酵母单细胞蛋白液体发酵Word文档格式.docx
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它是生命体所进行的化学反应和生理变化，是多种多样的生物化学反应根据生命体本身所具有的遗传信息有序进行，以取得能量来维持生命活动的过程。
发酵产物是指在反应过程当中或反应到达终点时所产生的能够调节代谢使之达到平衡的物质。
实际上，发酵也是呼吸作用的一种，只不过呼吸作用最终生成CO和水，而发酵最终是获得各种不同的2
代谢产物。
（2）广义“发酵”的定义
工业上所称的发酵是泛指利用生物细胞制造某些产品或净化环境的过程，它包括厌氧培养的生产过程，如酒精、丙酮丁醇、乳酸等，以及通气（有氧）培养
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的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等的生产，还有利用兼性厌氧微生物进行的兼气发酵。
产品既有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。
3发酵工程（FermentationEngineering）的定义
应用微生物学等相关的自然科学以及工程学原理，利用微生物等生物细胞进行酶促转化，将原料转化成产品或提供社会性服务的一门科学。
（二）发酵的特点
发酵和其他化学工业的最大区别在于它是生物体所进行的化学反应。
其主要特点如下:
1，发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学反应，反应安全，要求条件也比较简单。
2，发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进行反应。
微生物因不同的类别可以有选择地去利用它所需要的营养。
基于这—特性，可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行生物资源的改造和更新。
3，发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的，反应的专一性强，因而可以得到较为单—的代谢产物。
4，由于生物体本身所具有的反应机制，能够专一性地和高度选择性地对某些较为复杂的化合物进行特定部位地氧化、还原等化学转化反应，也可以产生比较复杂的高分子化合物。
5，发酵过程中对杂菌污染的防治至关重要。
除了必须对设备进行严格消毒处理和空气过滤外，反应必须在无菌条件下进行。
如果污染了杂菌，生产上就要遭到巨大的经济损失，要是感染了噬菌体，对发酵就会造成更大的危害。
因而维持无菌条件是发酵成败的关键。
6，微生物菌种是进行发酵的根本因素，通过变异和菌种筛选，可获得高产的优良菌株并使生产设备得到充分利用，因此可获得常规方法难以生产的产品。
7，工业发酵与其他工业相比，投资少，见效快，可以取得显著的经济效益。
基于以上特点，工业发酵日益引起人们重视。
和传统的发酵工艺相比，现代发酵工程除了上述的发酵特征之外更有其优越性。
如除了使用微生物，还可以用
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动植物细胞和酶，也可以用人工构建的“工程菌’来进行反应;
反应设备也不只是常规的发酵罐，而是以各种各样的生物反应器而代之，自动化连续化程度高，使发酵水平在原有基础上有所提高和和创新。
（三）发酵的类型
根据发酵的特点和微生物对氧的不同需求，可以将发酵分成若干类型:
1，按发酵原料分:
糖类物质发酵、石油发酵及废水发酵等类型。
2，按发酵产物分:
氨基酸发酵、有机酸发酵、抗生素发酵、酒精发酵、维生素发酵等。
3，按发酵形式分:
固态发酵和深层液体发酵。
4，按发酵工艺流程分则有:
分批发酵、连续发酵和流加发酵。
5，按发酵过程中对氧的不同需求分，一般可分为:
厌氧发酵和通风发酵两大类型。
（四）发酵过程的组成部分
1发酵过程的组成
除某些转化过程外，典型的发酵过程可以划分成六个基本组成部分:
（1）繁殖种子和制备发酵培养基;
（2）培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌;
（3）菌种的活化、种子扩大培养和接种。
发酵菌种一般保存在冷冻管或冰
箱中的斜面上，在使用前要先接种到新鲜斜面培养基上进行活化，活化后再
用于种子扩大培养。
为了进行大规模的工业发酵生产，必须将活化的种子进
行逐级扩大。
扩大的方法可根据需要采用固体培养或液体培养两种不同的方
法。
固体法一般采用传统的制曲工艺，先用三角瓶扩大，再转接到曲盘扩大
培养。
液体法要先在三角瓶摇瓶（好氧菌或兼性厌氧菌）或静置（厌氧菌）扩大
培养，然后再转接到种子罐中进一步扩大培养。
种子扩大培养的阶段由发酵
规模决定，如一级、二级或三级等。
（4）微生物在最适合于产物合成的条件下，在发酵罐中生长;
（5）产物萃取和精制;
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（6）过程中排出的废弃物的处理。
六个部分之间的关系如图1-1所示。
研究和发展工艺，总是围绕着就逐步改善发酵的全面效益而进行的。
在建立发酵过程以前，首先要分离出产生菌，并改良菌种，使所产生的产物符合工业要求。
然后测定培养的需求，设计包括提取过程在内的工厂。
以后的发展计划，包括连续不断的改良菌种、培养基和提取过程。
图1-1典型的发酵过程示意图
2发酵生产的条件
（1）某种适宜的微生物;
（2）控制微生物进行代谢的各种条件（培养基组成，温度，溶氧pH等）;
（3）微生物发酵的设备;
（4）提取菌体或代谢产物，精制成产品的方法和设备。
二发酵工业的发展史
发酵工业的发展史，可以划分成五个阶段。
在19世纪以前是第一个阶段。
当时只限于含酒精饮料和醋的生产。
虽然在古埃及已经能酿造啤酒，但一直到17世纪才能在容量为1500桶（一桶相当于110升）的木质大桶中进行第一次真正的大规模酿造。
即使在早期的酿造中，也尝试对过程的控制。
历史记载，在1757年已应用温度计;
在1801年就有了原始的热交换器。
在18世纪中期，
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Cagniard-Latour,Schwann和Kutzing分别证实了酒精发酵中的酵母活动规律。
Paster最终使科学界信服在发酵过程中酵母所遵循的规律。
在18世纪后期，Hansen在Calsberg酿造厂中开始其开拓工作。
他建立了酵母单细胞分离和繁殖，提供纯种培养技术，并为生产的初始培养形成一套复杂的技术。
在英国麦酒酿造中并未运用纯种培养。
确切地说，许多小型的传统麦酒酿造过程，至尽仍在使用混合酵母。
醋的生产，原先是在浅层容器中进行，或是在未充满啤酒的木桶中，将残留的酒经缓慢氧化而生产醋，并散发出一种天然香味。
认识了空气在制醋过程中重要性后，终于发明了“发生器”。
在发生器中，填充惰性物质（如焦碳、煤和各种木刨花），酒从上面缓慢滴下。
可以将醋发生器视作第一个需氧发生器。
在18世纪末到19世纪初，基础培养基是用巴氏灭菌法处理，然后接种10%优质醋使呈酸性，可防治染菌污染。
这样就成为一个良好的接种材料。
在20世纪初，在酿酒和制醋工业中已建立起过程控制的概念。
在1900年到1940年间，主要的新产品是酵母、甘油、柠檬酸、乳酸、丁醇和丙酮。
其中面包酵母和有机熔剂的发酵有重大进展。
面包酵母的生产是需氧过程。
酵母在丰富养料中快速生长，使培养液中的氧耗尽。
在减少菌体生长的同时形成乙醇。
限制营养物的初始浓度，以防止出现缺氧现象，这个技术现在成为分批补料培养法，广泛应用于发酵工业;
早期使用的向酵母培养液中通入空气的方法，也改进为经由空气分布管进入培养液。
空气分布管可以用蒸汽进行冲刷。
在一战期间，Weizmann开拓了丁醇丙酮发酵，并建立了真正的无杂菌发酵。
所用的过程，至今还可以认为是一个在较少的染菌机会下提供良好接种材料和符合卫生标准的方法。
虽然丁醇丙酮发酵是厌氧的，但在发酵早期还是容易受到需氧菌的污染;
而在后期的厌氧条件下，也会受到产酸厌氧菌的污染。
发酵器是由低碳钢制成的具有半圆形的顶和底的圆桶。
它可以在压力下进行蒸汽灭菌而使杂
3菌污染减少到最低限度。
但是，使用200M容积的发酵器，使得在接种物的扩大和保持无杂菌状态都带来困难。
有机溶剂发酵技术的发展，是发酵技术的重要进展，为无杂菌需氧发酵工艺的建立铺平了道路。
第三阶段发酵工业的进展在二战期间，由于战争的需要，在纯种培养技术下，以深层培养生产青霉素。
青霉素的生产是在需氧过程中进行，它极易受到杂菌的
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污染。
虽然已从溶剂发酵中获得很有价值的知识，然而还要解决向培养基中通入大量无菌空气和高粘度培养液的搅拌问题。
早期青霉素生产与溶剂发酵的不同点还在于青霉素生产能力极低，因而促进了菌株改良的进程，并对以后的工业化起着重要的作用。
由于实验工厂的崛起，使发酵工业进一步的发展，它可以在半生产规模中试验新技术。
与此同时，大规模回收青霉素的萃取过程，也是另一大进展。
在这一时期中，发酵技术有重大的变化，因而有可能建立许多新的过程，包括其他抗生素、赤霉素、氨基酸、酶和甾体的转化。
在60年代初期，许多跨国公司决定研究生产微生物细胞作为饲料蛋白质的来源，推动了技术进展。
这一时期，可视作发酵工业的第四阶段。
最大的有机械
33搅拌发酵罐的容积，已经从第三阶段时的80M扩大到150M。
由于微生物蛋白质的售价较低，所以必需比其他发酵产品的生产规模更大些。
如以烃为碳源，则在发酵时对氧的需求量增加，因而不需要机械搅拌的高压喷射和强制循环的发酵罐应运而生。
这种过程如果进行连续操作，则更为经济。
这个阶段工业上普遍采用了分批培养和分批补料培养法。
连续发酵是向发酵罐中连续注入新鲜培养基，以促使微生物连续生长，并不断从中取出部分培养液，它在大工业中的应用极为有限。
与此同时，酿造业中也研究连续发酵的潜力，但在工业中应用的时间极短。
3如ICI公司还在使用3000M规模连续强制循环发酵罐。
超大型的连续发酵的操作周期可超过100天，面临的主要问题是染菌。
这类发酵罐的灭菌，是通过下列手段而达到的:
即高度标准化的发酵罐结构、料液的连续灭菌和利用电脑控制灭菌和操作周期，以最大限度地减少人工操作的差错。
发酵工业发展史中的第五阶段，是以在体外完成微生物基因操作，即通常称为基因工程而开始的。
基因工程不仅能在不相关的生物间转移基因，而且可以精确地对一个生物的基因组进行交换。
因而可以赋予微生物细胞具有生产较高等生物细胞所产生的化合物的能力。
由此形成新型的发酵过程，如胰岛素和干扰素的生产，使工业微生物所产生的化合物超出了原有微生物的范围。
采用基因操作技术，还可以提高工业微生物生产常规产品的能力。
三发酵产品的类型
工业上的发酵产品有四个主要类别:
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1，以菌体为产品;
2，以微生物的酶为产品;
3，以微生物的代谢产物为产品;
4，将一个化合物经过发酵改造化学结构------生物转化过程。
这些过程的发展史，将在稍后予以讨论，首先要对四类产品作简要的叙述。
（一）菌体
工业生产的微生物体，可分为二种。
一种是供制备面包用的酵母;
另一种是作为人类或动物的食物的微生物细胞（单细胞蛋白质）。
早在1900年时，面包酵母已经形成大生产的规模。
作为人类食物的酵母生产，则是在第一次世界大战时在德国发展起来的。
作为食用蛋白质来源的微生物细胞的生产，直到1960年才作深入的研究。
（二）微生物的酶
工业上，曾由植物、动物和微生物生产酶。
微生物的酶可以用发酵技术大量生产，是其最大的优点。
而且与植物或动物相比，改进微生物的生产能力也方便得多。
微生物的酶的应用广泛，主要在食品及其相关工业中。
酶的生产受到微生物本身严格控制。
为改进酶的生产能力可以改变这些控制，如在培养基中加入诱导物和采用菌株的诱变和筛选技术，以消除反馈阻遏作用。
近半人世纪以来，提纯结晶的酶制剂已在百种以上。
例如，广泛用于食品加工、纤维脱浆、葡萄糖生产的淀粉酶就是一种最常用的酶制剂。
其他如可用于澄清果汁、精炼植物纤维的果胶酶，以及在皮革加工，饲料添加剂等方面用途广泛的蛋白酶等，都是在工业和医药上十分重要的酶制剂。
此外，还有一些在医疗上作为诊断试剂或分析试剂用的特殊晦制剂也在深入研究和应用。
（三）微生物代谢产物
微生物的生长过程，可分为几个阶段。
向培养基中接种菌种后，并不立即开始生长，可能是个适应时期，这个阶段称为延缓期。
然后细胞的生长率逐渐增加，而达到最大生长率，并成为一个常数，这时称为对数成长期。
接着细胞生长停滞进入所谓稳定期。
随后，活细胞数下降，培养液进入死亡期。
除以动力学描述微生物的生长外，还可以按生长曲线中不同时期所产生的产物来分期。
在对数生长期中，所产生的产物，主要是供给细胞生长的物质，入氨基酸、核苷酸、蛋白质、
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核酸、脂类和碳水化合物等。
这些产物称为初级代谢产物。
能产生这些物质的生长阶段（相当于对数期）称为营养期（Trophophase）。
利用发酵生产的许多初级代谢产物，具有重大的经济意义（表1-1）。
野生型的微生物所产生的初级代谢产物，只限于微生物本身的需要。
工业微生物学家的任务是改良野生型微生物并改善培养条件，以增进这些化合物的生产能力。
表1,1微生物的初级代谢产物及其在工业上的用途
初级代谢产物用途
乙醇含酒精饮料中的活性成份
与石油混合后，可作为汽车的燃料
柠檬酸食品工业与化学工业中多种用途
丙酮和丁醇溶剂
谷氨酸调味品
赖氨酸食品添加剂
核苷酸调味品
多糖食品工业
提高油类回收率
维生素食品添加剂
有些微生物的稳定期培养物中所含有的化合物，并不在营养期时出现，而且未见到对细胞代谢功能有明显的影响。
这些化合物称为次级代谢产物。
这个生长期（相当于稳定期）则称为分化期（Idiophase）。
只有在继续培养过程中，细胞处于不生长或缓慢生长状态时，才能实现次级代谢。
这一点是十分重要的。
因此，推断微生物在天然环境中，是以相对低的速率生长的;
即在自然界中，是以分化期，而不是以营养期占优势。
这是微生物在培养过程中的另一个特性。
初级代谢物与次级代谢物之间的关系见图。
从图1-2中可见到次级代谢产物是由初级代谢的中间体和产物合成而得。
图中的初级代谢途径是极大多数微生物的常见途径。
各种次级代谢产物，只是极少数几个微生物种才能合成的。
图中的次级代谢产物是由众多微生物所产生。
当然，并不是所有微生物都能进行次级代谢。
通常，丝状菌、真菌以及产芽孢的细菌都能进行次级代谢，而肠道细菌则都不能。
次级代谢与初级代谢的微生物在分类学上的分布截然不同。
产生菌细胞在产生次级代谢时的生理学规律，曾经是重要的讨论主题。
由于次级代谢产物在工业上的重要性，促使人们对微生物的注意力超过了它们的产物。
许多次级代谢物具有抗微生物活性，另一些则是某一特定酶的抑制剂、生长促进剂或具有特殊药理作用。
和初级代谢物一样，许多次级代谢产
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物的生产形成多种形式的发酵过程。
野生型微生物只能产生浓度很低的次级代谢物。
它们的生物合成受到诱导、降解物的阻遏和反馈系统的控制。
谷氨酸（C5N）
图1-2初级和次级代谢间的关系（Turner，1972）
（粗线表示初级代谢，名称下加粗线者表示次级代谢产物）
（四）转化过程
1定义
生物细胞或其产生的酶能将一种化合物转化成化学结构相似，但在经济上更有价值的化合物。
转化反应是催化脱氢、氧化、羟化、缩合、脱羧、氨化、脱氨化或同分异构作用。
生物的转化反应比用特定的化学试剂有更多的优点。
反应是在常温下进行，而且还不需要重金属催化剂。
将乙醇用微生物转化成乙酸，已是成熟的生产方法。
微生物转化还可以生产更有价值的化合物。
如利用生物转化过程生产甾体、手性药物、抗生素和前列腺素。
转化发酵过程的奇特之处是先产生大量菌体，然后催化单一反应。
一些最新型的过程，是将全细胞或其中有催化作用的酶固定在惰性载体上。
具有催化作用的固定化细胞可以反复多次使用。
2生物转化反应的特点
（1）反应条件温和（30-40?
常压，水相反应）反应选择性高;
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（2）反应产物纯度高（包括光学纯）;
（3）反应底物简单便宜（一般无毒、不易燃）;
（4）反应收率主要取决于菌种的性能;
（5）设备简单。
四固体发酵和液体发酵
一般发酵工艺过程按照培养基物理性状不同，将发酵方式分为两大类:
固体发酵和液体发酵。
（一）固体发酵
固体发酵是指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水不溶性固态基质中，用一种或多种微生物的一个生物反应过程。
固体发酵起源于中国，具有几千年的历史。
近年来，由于固体发酵具有节水、节能的独特优势，属于清洁生产技术、逐步得到世界各国的重视。
根据物料堆积和通气方法可将固态发酵细分为浅层发酵、转桶发酵和厚层通气发酵3种方式。
目前我国酒类、酱油、食醋等的酿造主要采用固态发酵。
下面以浅层发酵为例说明固体发酵过程。
（1）种曲制作试管斜面?
锥形瓶菌种?
曲盒菌种?
曲池。
逐级扩大培养
一般采用含有麸皮的固态基质。
（2）成曲制作将配制好的物料蒸后冷却到40?
左右时按2%-4%的比例接
入种曲，混合均匀后移入通风制曲池。
曲层厚度25-30cm，曲料保持
疏松，厚度一致，保温28-32?
，当曲成熟后保存备用。
（3）发酵将种曲接入蒸后物料中，在40-50?
进行发酵，此阶段利用成
曲中微生物产生的酶对物料进行分解转化，产生所需要的代谢产物。
（4）产物的分离提取根据产物的性质进行。
（二）液体发酵
是将发酵原料制成液体培养基，接种微生物，通过其代谢活动，使发酵原料转化为发酵产品。
液体发酵可分为表面发酵和深层发酵两种方式。
其中深层发酵是应用最广的方式。
深层发酵是微生物的菌体或菌丝体均匀分散在液体培养基中，根据发酵微生物对氧的需求通入或不通入无菌空气。
现代发酵工业中，抗生素、有机酸、氨基酸、酶制剂等许多产品都可通过液体深层发酵来实现。
深层发
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酵具有生产规模大，发酵速度快，生产效率高，容易进行自动化控制等优点。
根据生产过程液体深层发酵可细分为分批发酵（间歇发酵）、连续发酵、补料分批发酵和计算机控制的发酵。
五发酵过程的控制
微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种本身的性能，而且要赋以合适的环境条件才能使它的生产能力充分表达出来。
为此我们必须通过各种研究方法了解有关生产菌种对环境条件的要求，如培养基、培养温度、pH、氧的需求等，并深入地了解生产菌在合成产物过程中的代谢调控机制以及可能的代谢途径，为设计合理的生产工艺提供理论基础。
同时，为了掌握菌种在发酵过程中的代谢变化规律，可以通过各种监测手段如取样测定随时间变化的菌体浓度，糖、氮消耗及产物浓度，以及采用传感器测定发酵罐中的培养温度pH、溶解氧等参数的情况，并予以有效地控制，使生产菌种处于产物合成的优化环境之中。
发酵工艺条件控制的目的就是要为生产菌创造一个最适的环境，使生产所需要的代谢活动得以最充分的表达。
在发酵过程中通常要对培养温度、pH、溶解氧、二氧化碳、泡沫、补料等因素进行控制，使其符合生物细胞生长的需要，从而获得高产高质的产品。
六发酵产物的分离提取
是指从发酵液中分离、精制有关产品的过程，也称发酵生产的下游加工过程。
发酵液是含有细胞、代谢产物、剩余培养基等多组分的多相系统，粘度非常大，从中分离产物很困难;
发酵产品在发酵液中浓度一般很低;
有些发酵产品具有生物活性，在分离提纯过程中很容易失活。
上述原因使下游加工过程很困难，也使其成为发酵工业的重要组成部分。
当发酵结束后根据所要分离产物的性质进行产物的分离提取。
若需要的是菌体，要用离心沉淀或板框压滤将菌体与发酵液或发酵基质相分离，然后进一步加工成产品。
若需要的是细胞外产物，要通过过滤戒离心收集清液，再根据性质的不同进行离子交换树脂吸附处理、脱色过滤、减压浓缩等方法提取和精制。
若是胞内产物，要收集细胞并裂解细胞，使产物释放，然后进一步分离提取。
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1预处理和固液分离
通过预处理可改善发酵液性质，有利于固液分离。
常用的处理方法有酸化、加热、加絮凝剂等方法。
固液分离常用过滤、离心等方法。
如果目的产物在细胞内，还需要破碎细胞。
在发酵工业中常用高压匀浆器和球磨机对细胞进行破碎。
破碎后通过离心、两水相萃取等方法使滤液和细胞碎片分离。
2提取
通过预处理，目的产物存在于滤液中。
由于滤液的体积较大，目的产物的浓度较低，需要通过提取使目的产物得到浓缩，同时也除了一些杂物质，使目的产物得到一定程度的纯化。
常用的提取方法有吸附法、离子交换法、沉淀法、萃取法、超滤法、蒸馏法。
3精制
经过提取使目的产物得到浓缩和一定程度的纯化，要通过精制使目的产物得
到纯化，从而使纯度达到目的要求。
小分子物质的精制常采用结晶操作，大
分子的精制常采用层析分离，包括凝胶层析、离子交换层析、聚焦层析、疏
水层析、亲和层析等。
4成品加工
经过提取和精制后，一般根据产品应用要求，还要对目的产物进行浓缩、过
滤除菌、去除热原、干燥、加稳定剂等操作。
5废物的回收和利用
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酵母单细胞蛋白液体发酵实验目的:
1.学习酵母单细胞蛋白的发酵方法和发酵过程的优化控制;
2.学习和掌握液体发酵的方法和一般过程。
实验原理:
发酵是一项古老而又现代的生物技术，在食品、饲料、环保、冶金，尤其是现代医药领域有着广阔的应用。
其实质是利用微生物的生命活动来为人类生产出有用的物质，包括菌体蛋白、初级代谢产物、次级代谢产物、基因重组蛋白或多肽等，主要过程有菌种的活化、培养基的制备和灭菌、种子（根据需要可以有一级种子、二级种子、三级种子）的制备、接种、发酵及其过程的监控、产物的分离纯化、成品制备。
酿酒酵母是一种食品级的微生物，人类从几千年前就开始利用它了，像夏禹时期就有仪狄作酒的记载。
干酵母蛋白质含量高达45%，且其蛋白氨基酸品种齐全，维生素丰富，营养价值较高，是饲料工业、医药工业、发酵工业和食品工业的重要原料。
酵母单细胞蛋白一直是欧美市场上缺乏的蛋白质资源，国内也很匮乏。
本次实验是在学完发酵工艺原理理论课的基础上，以液体发酵法制备酿酒酵母单细胞蛋白为实践内容，深入地理解发酵的原理、方法、一般过程、过程的优化控制。
通过实践与理论的结合，使学生掌握好发酵工艺原理课程。
【实验安排】
本实验安排在第十二周周六、周日两天进行。
第一天:
讲解、熟悉仪器设备、培养基的配制、灭菌、一级种子的制备
第二天:
摇瓶液体发酵、取样检测、分离出酵母单细胞蛋白
利用实验间隙，分批观摩10L和40L发酵罐，并进行讲解。
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实验1培养基制备与灭菌
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