cDNA文库及其构建文档格式.docx

cDNA文库及其构建文档格式.docx

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（4）双链cDNA的修饰。

（5）双链cDNA的分子克隆。

（6）cDNA文库的扩增。

（7）cDNA文库鉴定评价。

　　构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库，二者大同小异。

无论怎样，应当注意如下几个方面：

保证获得数量足够的高质量的起始RNA

　　构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northernblot的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录，这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好，虽然后者也并不是不能做。

老版本CLONTECH的SMART4的中级柱子要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右，这就要求起始总RNA量较多。

虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA也可以构建cDNA文库，但这是针对材料极为稀缺者而言，但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。

至于RNA的质量，如果采用纯化总mRNA后反转录，则对总RNA的杂质方面要求稍松，但对RNA的完整性则一丝不苟，要求未降解。

如果直接采用总RNA进行反转录，则对总RNA的质量要求非常高，不仅要求RNA相当完整而无降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰酸胍等杂质少，最好是试剂盒抽提的。

反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键

　　这是构建cDNA文库中最贵的一步，也是核酸质变的一步，它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。

反转录不成功，说明一次文库方案的夭折。

反转录效率不高表现在一是部分mRNA被反转录了，但还有相当一部分本该反转录的mRNA未被反转；

二是只有少部分mRNA被反转录通了即达到帽子结构最近处，而很大一部分mRNA没有反转录完全，总的全长cDNA太少，这就难以构建好的全长cDNA文库。

少量程度的mRNA降解或反转录不完全在SMART4等试剂盒及手工方法构建中对文库的滴度影响不大，但对文库的全长性则有很大影响。

Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接头连接后再反转录的新技术（可参考其GeneRacer说明书）从原理上是保证最终获得全长cDNA的最好方法，但对mRNA的完整性要求非常高，理论上讲必须是带有帽子结构和PolyA结构的全长mRNA且反转录完全，才能进入文库中。

反转录完成后点样检测cDNA的浓度及分子量分布是很重要的。

层析柱cDNA分级很关键

　　这一步稍不注意会影响成功性或影响获得的cDNA的片段分布特点。

这一步的操作要小心，尤其要在加入cDNA之前通过反复悬浮和试滴保证柱子能正常工作，cDNA的加入和收集要精力集中。

获得的每一级的cDNA量很少，检测时带型很暗，所以要用新鲜做的透明薄胶检测，根据检测结果一定要舍弃太短的cDNA（一般400bp以下就不要了，因为短片段太多会严重影响后面的连接转化效果及文库质量）。

　　四、噬菌体文库或质粒文库均对载体与cDNA的连接效率要求很高，也对连接产物转染或转化大肠杆菌的效率要求很高。

连接效率高低直接关系到文库构建是否成功，更要注意的是文库连接与一般的片段克隆的连接不一样。

一般的片段克隆连接是固定长度的载体与固定长度的目的DNA连接，而文库连接是固定长度的载体与非固定长度的目的DNA连接，目的基因cDNA长的有10kb以上，短的只有500bp或更短。

一系列长度不等的cDNA与载体在一起连接的结果，不同长度cDNA的连接效率就不一样。

有的专家的经验是，根据分级结果，有意识地将长度不同的cDNA群分别与载体连接，再分别转化或转染大肠杆菌，分别完成滴度检测，最后将不同长度级别的文库混合在一起供杂交筛选。

1,mRNA的制备

　　动物细胞mRNA的制备

　　植物细胞mRNA的制备

2,mRNA的来源

　　选用mRNA含量高的组织材料,或通过药物等方法提高mRNA的含量

3,mRNA完整性的检测

　　1）mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量蛋白质的能力。

无细胞翻译系统（Cell-freetranslationsystem），又叫体外转录-翻译的偶联系统,因为该系统需要制备无细胞提取物,还有人称之为"

溶胞粗制品翻译系统"

。

　　无细胞提取物的制备：

　　用机械的,超声波的,渗透压或用适当的去污剂等方法,将细胞溶破,再高速离心出去其质膜与细胞核等.该提取液中含有RNA聚合酶,核糖体,tRNA和能量发生系统.

　　常见的体外无细胞翻译系统:

　　兔网织红细胞系统。

网织红细胞无细胞核,其合成的蛋白质90%以上为珠蛋白.

　　缺点:

已含有珠蛋白mRNA.可以在该体系中加入微球菌核酸酶和Ca2+,可很快分解,除去体系中的珠蛋白mRNA。

　　麦胚系统用组织捣碎机将麦子捣碎,分离出麦胚.然后将粗制的麦胚加10倍体积的缓冲液与砂子共研磨.23000g离心所得的上清夜称为S23;

将S23分装,保存于-20°

C冰箱中.

　　利用麦胚系统进行蛋白质翻译合成研究时,需加的物质与网织红细胞系统相似.由于该体系无mRNA,所以必须加入mRNA。

　　优点：

适于研究mRNA,活力强,价格低廉等.

　　缺点：

不同制品的活性差别较大,且合成分子量较大（71X105Dal）的蛋白质时往往提前终止.

　　哺乳动物mRNA在红细胞裂解液中翻译

　　*SDS-PAGE 

analysisofproteinstranslatedbycell-freetranslationsystem.Lane1:

proteinmarker;

Lane2,withoutmRNA;

Lane3to7:

translationproductsoftotalmRNAfrommammaliancells

　　2）mRNA在无细胞体系中指导合成目的多肽的能力

　　3）mRNA分子的大小

　　哺乳动物mRNA长度为500-8000bp,大部分mRNA位于1.5-2.0kb之间.

　　4）总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能力

　　利用哺乳动物细胞提取的poly（A）+RNA合成cDNA

　　*Lane1:

-HindIII-EcoRI;

Lane2:

thefirstchainofcDNA;

　　Lane3:

thesecondchainofcDNA;

Lane4:

-HindIII

4,mRNA在细胞中的丰度

　　1） 

高丰度mRNA

　　目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的50-90%,该类mRNA在合成和克隆cDNA之前不需进一步纯化特定mRNA.

　　2）低丰度mRNA

　　目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下.

　　5,mRNA的富集方法

　　典型的哺乳动物细胞含有10,000-30,000种不同的mRNA分子,某些mRNA分子在细胞内的拷贝数很低甚至只有一个拷贝.

　　mRNA的丰度与文库克隆子数的关系

　　ln（1-P）

　　N=ln（1-1/n）

　　N:

所需克隆数;

P:

要求的概率;

n:

一种mRNA在总mRNA中的相对比例

　　1）按大小对mRNA进行分级分离

　　*通过琼脂糖凝胶电泳分离大小不同的mRNA分子,该方法的分离效果最好,但从凝胶中回收的得率较低.

　　*蔗糖梯度离心:

加入破坏RNA二级结构的变性剂如氢氧化甲基汞等,再进行蔗糖梯度离心以分离不同分子量的mRNA.

　　2）cDNA的分级分离

　　*mRNA通过反转录形成cDNA,在插入到克隆载体前,通过琼脂糖凝胶电泳,将不同大小的cDNA分子分离开来.

　　*优点:

　　a）避免了分离过程中mRNA被污染的RNA酶降解

　　b）增加了获得全长cDNA克隆的概率

　　c）获得更准确的分级分离效果（分子量）

　　3）多聚核糖体免疫学纯化法

　　*使用抗体来纯化合成目的多肽的多聚核糖体.将正在合成的新生多肽链的多聚核糖体结合到免疫亲和柱（A蛋白-Sepharose柱）上,随后用EDTA将多聚核糖体解离下来,并通过Oligo（dT）层析分离mRNA,利用该方法可将目的mRNA纯化数千倍.目的mRNA在细胞中的含量可为数十拷贝.

1.试剂配制

　　准备工作：

　　1、研钵、5ml/10ml/25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。

　　2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃20mins高压灭菌。

　　3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。

　　4、常用试剂及其配方：

　　▲DEPC水：

在1000ml去离子水中加入100ulDEPC,静置过夜后高压灭菌。

　　▲0.78M柠檬酸纳：

PH=4~5

　　三水合柠檬酸纳22.94g

　　加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。

　　▲10%肌氨酸钠：

　　肌氨酸钠10g

　　▲变性裂解液：

　　0.78M柠檬酸钠8.25ml

　　10%肌氨酸钠12.375ml

　　异硫氰酸胍118.05g

　　加DEPC水定容至250ml，室温放置备用

　　临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v）

　　▲2M醋酸钠PH=4.5

　　NaAc·

3H2O13.6g

　　加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用

　　▲3M醋酸钠PH=5

3H2O20.4g

　　▲4MLiCL:

　　LiCL24.164g

　　加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用

　　▲0.5MEDTAPH=8.0

　　EDTA18.61g

　　用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温放置备用

　　▲10XMOPS（3-（N-吗啉代）丙磺酸）:

　　MOPS41.86g

　　NaAC·

3H2O4.10g

　　0.5MEDTA（PH8.0）20ml

　　用NaOH调PH值6.5,DEPC水定容到1L，室温避光放置备用。

　　▲1xMOPS:

　　10xMOPS30ml

　　加DEPC水270ml，用时现配。

　　▲4xRNALoadingbuffer:

　　10xMOPS400ul

　　甘油（高压过）200UL

　　溴酚兰10ul

　　甲醛（37%）72ul

　　去离子甲酰氨310ul

　　EDTA（0.5MPH8.0）8ul

　　ErBr（10mg/mlinDEPCH2O）70ul

　　在4℃可保持3个月

　　▲10xPBS

　　pH=7.4

　　NaCl80g

　　KCl2g

　　Na2HPO414.4g

　　KH2PO42.4g

　　定容至1000ml

　　▲变性电泳胶：

　　称取0.5g琼脂糖，加入47.5ml1xMOPs，加热至琼脂糖熔化后，冷却至50℃左右，加入2.5ml甲醛，轻轻混匀后倒入电泳托上。

　　▲变性电泳缓冲液：

　　在250ml容量瓶内加入5ml甲醛，用1xMOPS定容至250ml

2.动物组织totalRNA的提取

　　1．根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量，将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中，冰浴5分钟。

　　2．将组织样品放入变性裂解液中，在高速下匀浆15-30秒/次，直到看不见组织和细胞碎片。

　　3．根据表1加入适量2M的乙酸钠（pH4.0），反复颠倒混匀4-5次。

　　4．根据表1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。

　　5．冰浴10分钟。

　　6．4°

C，12000g离心20分钟。

　　7．小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中，内含所需的RNA。

蛋白质和DNA分别留在了有机相和中间层。

　　8．加入等体积的异丙醇，-20°

C沉淀30分钟以上。

　　9．4°

　　10．根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA。

　　11．加等体积的氯仿，加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。

　　12．4°

　　13．小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇，-20°

C沉淀至少30分钟。

　　14．4°

　　15．弃上清，加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀。

4°

C，12000g离心10分钟。

　　16．弃上清，空气中干燥RNA沉淀，直至没有乙醇气味。

用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀。

　　17．取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置－80°

C冰箱中保存。

　　表1

Mg#oftissue

500

800

1000

变性裂解液（ml）

5

8

10

2MNaOACpH4（ml）

0.5

0.8

1

水饱和酚（mL）

氯仿（mL）

1.6

2

异丙醇（mL）

4

6

变性裂解液（mL）

75%乙醇（mL）

DEPC-treatedH20（mL）

3.植物组织totalRNA的提取

　　1.先将研钵于－80℃冰箱中预冷，然后将1g样品在液氮中研磨成粉末状。

　　2.将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50ml离心管中，充分匀浆。

（1g样品加入3ml变性裂解液）。

　　3.加入0.3ml（1/10体积）2M的NaAc（ph4－5）颠倒混匀。

　　4.加入3ml（等体积）的水饱和酚，充分振荡，再加入1ml（1/3）的氯仿，振荡。

　　5.冰浴10min。

4℃，12000g离心10min

　　6.小心转移上清于另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀至少1小时。

　　7.4℃，12000g离心20min。

　　8.去上清，取沉淀。

加1ml4M的LiCl溶解沉淀（1mlLiCl/g组织），并转入1.5ml离心管中。

　　9.4℃，13000rpm离心15min。

　　10.用0.4mlDEPC水溶解沉淀，加1/2体积的水饱和酚，1/2体积的氯仿，颠倒混匀。

　　11.4℃，13000rpm离心10min。

　　12.取上清，加1/10体积的3MNaAc（ph5）和2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀30min以上。

　　13.4℃，13000rpm离心15min。

　　14.弃上清，用1ml75%的乙醇洗涤沉淀，4℃，13000rpm离心10min。

　　15.弃上清，取沉淀，空气中干燥RNA沉淀，直至无乙醇味。

　　16.用40－60ulDEPC水溶解（300-500ug/g）RNA沉淀。

　　17.取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置－80℃冰箱中保存。

4.TRIzolReagent提取totalRNA（GIBCO）

　　1．查表2根据样品量选择适当的TRIzolReagent体积装入50mlRNase-free离心管中，注意样品体积不能超过TRIzolReagent体积的10%。

　　2．将组织样品放入TRIzolReagent中，高速下匀浆15-30秒/次，直至看不见组织和细胞碎片。

　　3．室温温育10分钟。

　　4．据表2加入适量体积的氯仿，剧烈震荡15秒钟，然后室温下温育3分钟。

　　5．4&

ordm;

C，12000g离心15分钟，形成淡红色的苯酚/氯仿有机相，中间相和上层水相，水相约占TRIzol体积的60%。

　　6．转移上清于另一个Rnase-free的50ml离心管中。

根据表2加入适量异丙醇，-20&

C沉淀1小时以上。

　　7．4&

C,12000g离心10分钟。

　　8．去上清，据表2加入适量体积的75%的乙醇混匀。

　　9．4&

C，7500g离心5分钟。

　　10．去上清，空气中干燥或真空抽干RNA沉淀，但不要太干。

加入适量体积的DEPC-WATER,溶解沉淀。

　　11．取少量RNA用于测定其OD值和电泳，其余置-80&

　　表2

组织量

TRIzolReagent

氯仿

异丙醇

75%乙醇

50~100mg

1ml

0.2ml

1.OligotexmRNAKits（QIAGEN）法

　　1.将OligotexSuspension置于37℃水浴中，旋转混匀，溶解Oligotex.,然后置于室温。

　　2.将OBBBuffer置于37℃水浴中，旋转混匀，重溶沉淀物，然后置于室温。

　　3.将OEBBuffer置于70℃水浴中，待用。

　　试验步骤：

　　表3：

加入试剂量据此表

TotalRNA

RNase-freeWaterto:

BufferOBB 

（ul）

Oligotex 

Suspension（ul）

Prepsize

<

=0.25mg

250ul

15

Mini

0.25-0.5mg

500ul

30

Midi

0.5-0.75mg

45

0.75-1.00mg

55

　　1.TotalRNA量不要多于1mg，用移液器取出所需RNA量到1.5ml离心管中，加RNase-freewater补足到500ul

　　2.根据表3加入适当体积的OBBBuffer和OligotexSuspension，轻弹1.5ml离心管彻底混匀

　　3.置于70℃水浴中3min

　　4.取出置于室温（20℃－30℃）10min

　　5.13000rpm室温离心2min，用移液器吸出上清到一个新的1.5ml离心管中，保留上清直到polyA被结合上。

　　6.用移液器取400ulOW2Buffer混匀沉淀物，将混合物转移到SpinColumn中，RT，13000rpm，离心1min

　　7.将SpinColumn转移到一个新的1.5ml离心管中，加400ulOW2，RT，13000rpm，离心1min

　　8.将SpinColumn转移到一个新的1.5ml管中，取出25ulOERBuffer（70℃）到Column中，用移液器吹打3－4次树脂，室温13000rpm，离心1min。

　　9.取出25ulOERBuffer（70℃）到Column中，用移液器吹打3－4次树脂，室温13000rpm，离心1min。

　　10.测OD,并电泳定量。

2.磁珠法分离mRNA

　　1.在RNase-free的Eppendorf管中加入0.1~1.0mg的总RNA和RNase-free水至终体积为500ul.

　　2.65&

C加热10分钟。

　　3.加入3ul生物素标记的Oligo（dT）和13ul 

20×

SSC于RNA中，轻轻混合，室温放置逐渐冷去至室温，一般需10分钟左右。

　　4.同时配0.5×

SSC1.2ml和0.1×

SSC1.4ml.

　　5.将磁珠（SA-PMPs）轻晃散开，放入磁性分离架上，使SA-PMPs集中于管的一侧（约30sec），小心去上清，切不可离心。

用0.3ml0.5×

ssc漂洗SA-PMPs,用磁性分离架集中磁珠，去除上清，重复3次。

　　6.将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0.1ml0.5Xssc,注意漂洗后的SA-PMPs应在30分钟内使用。

　　7.将（3）中的oligo（dT）/mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA—PMPs管中，轻轻摇匀，室温下放10分钟。

　　8.用磁性分离架捕获SA-PMPs,小心去上清，但不要弃去。

　　9.用0.1×

SSC,每次0.3ml洗3次，每次都晃至