引物设计.docx

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引物设计

在药物基因组学研究中，有一个非常重要的技术是引物设计，在此我转载一个引物设计的原则汇总。

一、引物设计stepbystep1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。

2、用PrimerPremier5搜索引物

①打开PrimerPremier5，点击File-New-DNAsequence,出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。

点击Primer，进入引物窗口。

②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCRprimers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。

在SearchParameters里面，可以设定相应参数。

一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp.

③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。

④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：

3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。

此窗口中需要着重查看的包括：

Tm应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。

该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。

若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。

最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。

但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。

对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.

⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Currentpair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。

3、用Oligo验证评估引物

①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为InternalStability（DeltaG）窗口和Tm窗口。

在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Currentoligolength来改变。

定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。

引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。

②Analyze中，第一项为Keyinfo，点击Selectedprimers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearestneighbormethod计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的DeltaG和3’端的DeltaG.3’端的DeltaG过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。

③Analyze中第二项为DuplexFormation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower，即上下游引物之间的二聚体形成情况。

引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其DeltaG值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。

Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和DeltaG值。

④Analyze中第三项为HairpinFormation，即发夹结构分析。

可以选择上游或者下游引物，同样，DeltaG值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。

Analyze中第四项为CompositionandTm，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。

上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％不要相差太大。

Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearestneighbormethod、％GCmethod和2（A＋T）＋4（G＋C）method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，Tm值可以控制在50～70度之间。

第五项为FalsePrimingSites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有Falsepriming分析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。

⑤Analyze中，有参考价值的最后一项是“PCR”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR反应Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。

若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且DeltaG值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。

⑥引物评价完毕后，可以选择File－Print，打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有Oligo软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。

因此，打印前最好关掉Tm窗口和DeltaG窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR窗口。

4、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。

二、引物设计过程中的心得

1、Primer5.0搜索引物

①PrimerLength我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。

当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。

②PCRProductsize最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。

至于上限倒也不必要求苛刻。

③Searchparameters还是选Manual吧，Searchstringency应选High，GC含量一般是40－60％。

其它参数默认就可以了。

④搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。

当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多，或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。

对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。

2、Oligo6.0评估引物

①在analyze里，DuplexFormation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，Themoststable3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol,ThemoststableDimeroverall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，ThemoststableDimeroverall6.7kcal/mol没有问题。

②HairpinFormation根据黄金法则

③Falseprimingsites:

Primer的primingefficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。

④在PCR栏，丁香园战友感觉其所显示的optimalannealingtemperature数值值得参考。

在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。

⑤Internalstability很重要：

我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。

下图引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。

△G参照黄金法则，这其实很好理解：

把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。

3、其他

①两个评价系统不一样，丁香园战友感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。

这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。

②3端的二聚体应该避免，这个要看退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（丁香园战友观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。

③丁香园战友感觉3端有A无A影响不大，3端有T是不是一定不行，不见得。

软件是评估，法则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。

④错配和二聚体谁轻谁重，丁香园战友觉得“到致命的程度”谁都重要，在设计的时候，尽量两个都不得罪。

⑤GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。

所以丁香园战友设计引物的时候，会尽量避免这样的情况出现。

除了前引物和后引物的Tm不能相差太大，我们还要重点考虑以下因素：

一、GC%GC含量

对于PCR反应来说GC含量在40%—60%，一般50%左右比较合适；而对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50%。

产物中GC含量最好大于引物中的GC含量。

二、Degeneracy多义性

当设计多义引物时应尽量减少引物多义性，这样会带来更好的特异性，应尽量避免3末端的多义性，因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。

三、3’EndStability3末端稳定性

引物稳定性影响它的错配效率，一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5末端和相对稳定性较弱的3末端。

如果引物3稳定性强，有可能在即使5末端不配对的情况下造成错配，形成非特异性扩增条带（secondarybands）。

而3末端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时，由于3末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸。

四、GCClampGC钳

引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5末端。

这一段有较强稳定性的5末端称为GC钳。

它保证引物与模板的稳定结合。

选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性条带的前提下尽量降低退火温度。

五、SecondaryStructures二级结构

二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素。

二级结构能显著影响反应中能与模板正确结合的引物数量，发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力，从而降低扩增效率，形成发卡环的引物则不能在PCR扩增中发挥作用。

六、Hairpin发卡结构

发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成引物折叠形成的二级结构，并由于发卡结构的形成是分子内的反应,仅仅需要三个连续碱基配对就可以形成。

发卡结构的稳定性可以用自由能衡量。

自由能大小取决于碱基配对释放的能量以及折叠DNA形成发卡环所需要的能量，如果自由能值大于0则该结构不稳定从而不会干扰反应，如果自由能值小于0则该结构可以干扰反应。

七、Dimer二聚体

引物之间的配对区域能形成引物二聚体，它是相同或不同的两条引物之间形成的二级结构。

它造成引物二聚体扩增并减少目的扩增产物，二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向引物之间形成，如果配对区域在3末端问题会更为严重，3末端配对很容易引起引物二聚体扩增。

八、FalsePriming错配

如果引物可以结合除目的位点外的其他区域，扩增效率将明显降低目的产物带将减少或出现涂布（smear）。

3末端连续几个碱基配对形成错配的倾向要高于引物上游区域同样数量的碱基配对，在使用引物设计软件时，您可以分别设定确认为错配的3末端或引物全长形成连续碱基配对的数量。

顺便说一下，如果是新手，刚开始接触引物设计，推荐使用PrimerPremier5.0，因为它界面简单，易学易用；如果你想把引物设计得尽善尽美，公认的首选软件是Oligo，其次我认为是DNAstar。

Oligo功能强大，所以使用起来就没有PrimerPremier5.0那么简便。

先用PrimerPremier5.0设计，然后把设计好的引物拿到Oligo里去检测这对引物的优劣，我想这对大多数引物设计者是一个不错的选择！

补充一：

具体说一下引物中GC含量问题

引物的GC含量一般为40-60%，以45-55％为宜，过高或过低都不利于引发反应。

有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。

如果G-C比例超出，则在引物的5’端增加As或Ts；而如果A-T比例过高，则同样在5’端增加Gs或Cs。

但也有认为：

原来普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率的观点其实是不对的，以人基因组DNA为模板，用81%AT的引物可以产生单一的、专一的、长250bp，含有70%AT的产物。

完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比

补充二：

关于自由能问题（如何根据自由能判断引物质量）

1、ΔG值（自由能）反映了引物与模板结合的强弱程度。

一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。

3′末端双链的ΔG是0～－2kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6时只有40%、到－8时少于20%、而－10时接近于0。

2、引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3’端的连续GGG或CCC会导致错误引发。

二聚体形成的能值越高越稳定，越不符合要求。

与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。

虽然有些带有发夹环，其ΔG为－3kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3′末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。

当然，如果发夹环在5′末端对反应就没有多大的影响了。

补充三：

关于产物需要测序的PCR引物的设计问题

在DNA测序的PCR中最好用5′末端稳定（如GC含量较多），而3′末端不太稳定（如AT含量较多）的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。

这就是基于引物内部稳定性的经验之谈。

其3′末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发DNA合成，所以不会产生假产物。

因此，为了有效地引发反应，引物的5′末端和中央部分必须与靶DNA也形成双链。

与此相反，带有稳定的、GC丰富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都与靶序列配对，只凭借其3′末端与靶序列任何位点的牢固配合就可以引发反应，产生非专一产物。

无论如何，寡核苷酸3′末端最后5个核苷酸的稳定性小于－9kcal/mol的，通常就是专一性的探针或引物。

寡核苷酸3′末端越不稳定，假引发的可能性越低。

首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。

围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primerlength）、产物长度（productlength）、序列Tm值（meltingtemperature）、ΔG值（internalstability）、引物二聚体及发夹结构（duplexformationandhairpin）、错误引发位点（falseprimingsite）、引物及产物GC含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。

以使用Oligo软件分析设计引物为例，1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度。

2.引物3’端的序列要比5’端重要。

引物3’端的碱基一般不用A（3’端碱基序列最好是G、C、CG、GC），因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。

另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

5’端序列对PCR影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。

3.引物的GC含量一般为40-60%，以45-55%为宜，过高或过低都不利于引发反应。

有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。

如果G-C比例超出，则在引物的5’端增加As或Ts；而如果A-T比例过高，则同样在5’端增加Gs或Cs。

但也有认为：

原来普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率的观点其实是不对的，以人基因组DNA为模板，用81%AT的引物可以产生单一的、专一的、长250bp，含有70%AT的产物。

完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。

4.引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右。

（Tm值曲线以选取72度附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应），至少要在55-80℃之间

5.ΔG值（自由能）反映了引物与模板结合的强弱程度。

一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。

3′末端双链的ΔG是0~-2kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在-6时只有40%、到-8时少于20%、而-10时接近于0。

6.可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，如此可保证不出现非目的产物的假带。

但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。

如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450以上，而在错误位点的引发效率为130，并且不好找其他更合适的引物，那么这对引物也是可以接受的。

7.Frq曲线为Oligo6新引进的一个指标，揭示了序列片断存在的重复机率大小。

选取引物时，宜选用Frq值相对较低的片断。

8.引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3’端的连续GGG或CCC会导致错误引发。

二聚体形成的能值越高越稳定，越不符合要求。

与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。

虽然有些带有发夹环，其ΔG为-3kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3′末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。

当然，如果发夹环在5′末端对反应就没有多大的影响了。

9.以公式（4×G/C+2×A/T-5）计算Tm值，即退火温度。

选择较低Tm值的引物的退火温度为反应的退火温度。

4-6℃的差别似乎对PCR产量影响不大。

最好，保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范围内

10.要知道，更重要的因素是模板与稳定性较小的引物之间解链温度的差异。

差异越小，PCR的效率越高。

因为DNA的解链温度也取决于它的长度，所以有的研究者喜欢设计很长，而不求它很稳定的引物。

可是，引物太长就难以避免形成二聚体和自身互补，因此，一般还是不用为好。

如果期待的产物长度等于或小于500bp，选用短的（16~18mer）的引物：

若产物长5kb，则用24mer的引物。

有人用20~23mer引物得到40kb的产物。

11.在DNA测序和PCR中最好用5′末端稳定（如GC含量较多），而3′末端不太稳定（如AT含量较多）的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。

这就是基于引物内部稳定性的经验之谈。

其3′末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发DNA合成，所以不会产生假产物。

因此，为了有效地引发反应，引物的5′末端和中央部分必须与靶DNA也形成双链。

与此相反，带有稳定的、GC丰富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都与靶序列配对，只凭借其3′末端与靶序列任何位点的牢固配合就可以引发反应，产生非专一产物。

无论如何，寡核苷酸3′末端最后5个核苷酸的稳定性小于-9kcal/mol的，通常就是专一性的探针或引物。

寡核苷酸3′末端越不稳定，假引发的可能性越低。

12.如果用3′末端低稳定性的引物，反应的最适退火温度范围会不寻常的宽。

这就可以不经过事先的最佳化实验就能在最佳条件下进行反应。

13.引物的唯一性：

为了放大单个的、专一性DNA片段，选用的引物序列就应当是唯一的，即在模板中没有重复序列。

如果用哺乳动物基因组序列作为模板，可以用Alu序列或其他短重复元件来核对想用的引物的互补性。

由此也可知，应当避免使用同寡聚物（如-AAAAAA-）和二核苷酸重复（如-ATATAT-）。

14.引物和产物的Tm值不要相差太大，20摄氏度范围内较好。

定下引物的Tm值范围之后即可定下引物的长度范围。

15.对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。

16.值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。

有的模板本身条件较差，比如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；有时PCR产物要作为克隆对象插入到载体中表达，因此PCR引物设计的可选择度很低。

遇到这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件，这时，使用自动搜索引物及正确地评价引物可使研究人员对实验心中有数。

17.在设计克隆PCR引物时，引物两端一般都添加酶切点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低，这种PCR需要灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。

18.如扩增出多条带（引发错配所致），不出目的带或出目的带很弱（引物引发效率低下）

设计引物都是在已知模板序列的情况下进行。

设计的目的是在两个目标间取得平衡：

扩增特异性和扩增效率。

引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。

设计引用有一些需要注意的基本原理：

①引物长度

一般引物长度为18~30碱基。

总的说来，决定引物退火温度（