最全的动物疫病实验室检测方法Word格式.docx
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四、操作步骤
1.用包被缓冲液稀释亚洲1型口蹄疫病毒兔抗血清至工作浓度（1:
1000）,在ELISA板上每孔加50µ
l,振荡,封板或置湿盒内，室温过夜。
2.抗原抗体（阴阳性对照血清及待检血清）反应
根据不同的需要,选择图1-2中的一种布局在抗原抗体反应板上操作。
图196孔酶标板检测10份样品布局图
S11:
8
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10
+1:
32
-1:
4
1:
16
1：
64
128
256
512
1024
2048
l024
4096
图1为抗体滴度测定（定量）检测10份样品布局图;
图2为抗体滴度测定（定量）检测20份样品布局图。
图296孔酶标板检测20份样品布局图
S11:
S111:
S12
S13
S14
S15
S16
S17
S18
S19
S20
以图1为例,在U型血凝板上按50µ
l/孔量用PBST将待检血清从1:
4开始做2倍连续稀释至1:
512。
同时,按图示稀释阴阳性对照血清,然后每孔加入50µ
l用PBST稀释到使用浓度的亚Ⅰ洲型口蹄疫病毒抗原（1:
4,即1份病毒抗原、加3份PBST）,病毒抗原对照孔加100µ
l。
振荡混匀,封板,4℃过夜。
加入病毒抗原后血清的稀释度变为从1:
8开始的2倍稀释。
3.用洗涤液（1×
PBST）洗ELISA板5次,在洗水纸上甩干,再将抗原抗体混合物从抗原抗体反应板上按次序转移至ELISA板上的相对应孔,每孔50µ
l封板,37℃温育1小时。
4.同上洗板5次,甩干。
用豚鼠抗血清稀释液稀释亚洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作浓度（1:
1000）,每孔加50µ
l,封板,37℃温育1小时。
5.同上洗板5次,甩干。
用l×
PBST稀释兔抗豚鼠酶结合物至工作浓度（1:
500）,每孔加50µ
l封板,37℃温育1小时。
6.同上洗板5次,每孔加50µ
l底物溶液（务必加双氧水）,37℃温育15分钟。
每孔再加50µ
l终止液终止反应,立即在492nm波长下读取光吸收值（OD492nm值）。
五结果判定
1.试验认可标准
每块板设4孔病毒抗原对照,病毒抗原对照不加任何血清,直接用PBST稀释至使用浓度,与血清/病毒抗原复合物同步加入ELISA板孔,50µ
l/孔,病毒抗原对照OD492nm值应在1.5±
0.5范围内。
阳性对照抗体效价应在1:
1024±
1滴度以内,阴性对照血清抗体效价应＜1:
8。
2.病毒抗原对照平均OD492nm值50%计算（临界值）
抗原对照是4孔,弃去最高和最低OD492nm值,计算剩余2孔的平均OD492nm值,再除以2,即50%对照值。
该值即为临界值，表示阻断50%反应的对照OD492nm值。
3.结果判定
以病毒抗原对照平均OD492nm值的50%为临界值,被检血清稀释孔OD492nm值大于临界值的孔为阴性孔,小于或等于临界值的孔为阳性孔,阳性孔的OD492nm值等于临界值时所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度。
例如病毒抗原对照平均OD492nm值为1.2,则其50%为。
假设某一待检血清在1:
128时OD492nm值为0.6,则该份待检血清的抗体滴度为1:
128。
假设临界值处于两个滴度之间,如处于1：
64与1：
128之间，则抗体滴度取中间值为1:
9O。
定性检测中,两个重复孔只要有一孔为阳性孔,则抗体滴度判定为1:
128,两孔均为阳性孔,则判定为抗体滴度＞1:
ELISA抗体效价≥1:
128,判定为亚洲1型口蹄疫抗体阳性。
ELISA抗体效价与保护力的关系:
牛、羊:
抗体效价≥1:
128,99%保护；
效价≤1:
16,不保护；
效价在1:
22-90之间,50%保护。
猪瘟抗原检测试剂盒
ClassicalSwineFeverVirusAntigenTestkit（CSFVAg）
概述
猪瘟病毒（CSFV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、边界病病毒（BDV）都是瘟病毒科黄病毒属的成员。
猪瘟病毒自从成为一种重要的病原体以来，给养猪业造成了巨大的经济损失，并引起猪的严重死亡。
感染高致病力猪瘟病毒后，猪在出现临床症状前会排出大量的病毒。
耐过急性或亚急性感染的动物会产生抗体并且不再散毒。
低致病力温和病毒会造成猪的隐性感染，病猪将会持续或间歇排出病毒直至死亡。
怀孕母猪与猪瘟病毒接触后可能通过胎盘感染胎儿。
先天性感染可能导致流产，木乃伊胎儿，死产和/或弱仔及畸形胎儿。
先天性感染低毒力病毒的结果是产出持续性感染的仔猪，仔猪出现免疫耐受，不表现任何症状向外排毒。
猪也有可能感染BVDV或BDV。
尽管这些感染通常呈温和经过并且是自限性的，但将它们同猪瘟病毒有效区分是很重要的。
原理
本ELISA检测试剂盒是用来检测外周血白细胞、全血、细胞培养物以及组织样本中的猪瘟病毒抗原。
采用双抗体夹心ELISA，将CSFV单克隆抗血清包被微量反应板，可与样品中的CSEV抗原结合。
猪瘟病毒的特异性单克隆抗体形成了夹心的上层。
形成的单克隆抗体+样品+单克隆抗体夹心可以用辣根过氧化物酶标记物检测。
加入与辣根过氧化物酶反应的底物，在酶的作用下形成有色产物。
通过酶标仪测定其吸光度。
可以用450nm单波长或450nm与620m双波长测定各孔吸光度。
试剂
本试剂盒采用96孔板，可以一次检测92个样品（每个样品1孔，每个对照2孔）或46个样品（每个样品2孔，每个对照2孔）；
或分6次使用，每次用2个板条，设2个对照，测定6个样品（每个样品2孔）。
为了检测结果的准确性，最好每个样本都设重复。
试剂数量
1、多克隆羊抗血清包被板条8孔×
12条（96孔）
2、10倍浓缩样品稀释液（10x）55ml
足以配制550mL直接使用的1x稀释液
3、10倍浓缩洗涤液（10x）125ml
足以配制1、25L直接使用的洗涤液工作浓度（1x）
4、CSFV单克隆抗体，含防腐剂4ml
5、阳性对照，含有防腐剂
6、阴性对照，含有防腐剂
7、100倍浓缩辣根过氧化物酶标记物（100x），
辣根过氧化物酶标记抗鼠IgG，含有防腐剂200μl
8、酶标抗体稀释液15ml
9、底物液，TMB/H2O2溶液12ml
10、终止液，1MHCI（小心，强酸）12ml
注意事项
1、仔细阅读并遵守操作说明；
2、试剂盒试剂于2～7℃冷藏保存。
建议将浓缩的洗涤液（10x）保存在18～25℃室温，以免形成结晶。
3、所有试剂在使用前必须恢复至室温。
4、未使用的包被板应该密封保存在配备的塑料袋中，于2～7℃冷藏保存。
5、不要将不同批次的说明书以及试剂盒成分混合使用。
6、注意防止真菌或细菌污染试剂盒成分。
处理试剂时要小心。
7、不要用超过保质期的检测试剂盒。
8、进行样品或试剂操作时严禁吃东西、喝水或吸烟。
9、每个样品都用单独的吸头。
10、每一批次的试剂必须用其配备的阴阳对照。
11、配制试剂时只能用超纯水。
12、不要用嘴吸取液体。
13、底物溶液和浓缩的样本稀释液对眼睛、呼吸系统和皮肤有剌激性，防止与皮肤和眼睛接触。
14、终止液为1MHCl，HCI为强酸并且能造成灼伤，小心处理。
15、本试剂盒只能用于体外诊断。
兽医专用。
试剂配制
1、包被的反应板、猪瘟病毒特异性单克隆抗体、阳性对照、阴性对照、底物溶液、终止液为现用试剂。
2、洗涤液
10倍浓缩洗涤液必须用超纯水或双蒸水进行10倍（1：
10）稀释，稀释的洗涤液于2～7℃冷藏保存，但不能超过3天；
或冰冻保存，至少可以保存一年。
例如：
配制500ml稀释的洗涤液，将450ml超纯水或双蒸水加到50ml浓缩液中，混匀。
注意：
如果浓缩液有结晶，在使用前必须溶解。
可将瓶子放在温水中30分钟以上。
3、样品稀释液
10倍浓缩样品稀释液必须用超纯水或双蒸水进行10倍（1∶10）稀释，但如果检测全血样品时，将适量的10倍浓缩液与等体积的超纯水混合，制成5倍浓缩液（5X）即可。
将制备的稀释液于2～7℃冷藏保存，但不能超过3天；
或者冰冻保存，可以保存一年以上。
4、辣根过氧化物酶标记物（100x）
100倍（100X）浓缩标记物在使用前必须用标记物稀释液进行1∶100倍稀释。
如果只使用部分试剂，只要用稀释液按100倍（1∶100）稀释足够本次使用的标记物浓缩液（旋涡振荡混勾）即可。
稀释后的标记物溶液只能保存24小时。
10ml的辣根过氧化物酶标记物工作液，只需取100μl浓缩标记物（100X）加到10ml标记物稀释液中，在旋涡振荡器上混匀即可。
自备器材
1、精密移液器，5μ1至1000μ1
2、一次性移液吸头。
3、双蒸水或超纯水。
4、洗瓶或自动洗板机。
5、湿盒或封板胶带。
6、离心机，2000xg。
7、酶标仪。
8、离心管和小试管。
9、微量离心机，10，000xg。
10、旋涡振荡器。
11、剪刀和摄子。
12、0.17MNH4CI溶液，制备白细胞用。
样品制备
制备好的样品或组织可以在2～7℃保存7天，或-20℃冷冻保存6个月以上。
但这些样品在应用前应该再次以1，500xg离心10分钟或10，000xg离心2～5分钟。
外周血白细胞
a）取10ml肝素或EDTA抗凝血样品，1，500xg离心15～20分钟。
b）用移液器小心吸出血沉棕黄层，加入500µ
l样品稀释液（1X），在旋涡振荡器上混匀，室温下放置1小时，其间不时用旋涡器混合。
然后直接进行步骤f操作；
c）假设样品的棕黄层压积细胞体积非常少，那么就用整个细胞团（包括红细胞）。
将细胞加进10ml的离心管，并加入5ml预冷（2～7℃，下同）的0.17MNH4CI（氯化铵）混匀，静置10分钟。
d）用冷（2～7℃）超纯水或双蒸水加满离心管，轻轻上下颠倒混匀，1，500xg离心5分钟。
e）弃去上清，向细胞团中加入500µ
l样品稀释液（1x），用洁净的吸头悬起细胞，在旋涡振荡器上混匀，室温放置1小时。
期间不时用旋涡器混合。
f）1，500xg离心5分钟，取上清液按"
操作步骤"
进行检测。
g）注意：
处理好的样品可以在2～7℃冷藏保存7天，或-20℃冷冻保存6个月，但在使用前必须再次离心。
外周血自细胞（简化方法）
a）取～2ml肝素或EDTA抗凝血与等体积冷（2-8℃）0.17MNH4CI加入离心管混合。
室温放置10分钟。
b）1，500xg离心10分钟（或10，000xg离心2－3分钟），弃掉上清。
c）用冷（2～7℃）超纯水或双蒸水加满离心管，轻轻上下颠倒混匀，1，500xg离心5分钟。
d）弃去上清，向细胞团中加入500µ
l样本稀释液（1x）。
旋涡振荡充分混匀，室温放置1小时。
取75µ
l按照"
全血（肝素或EDTA抗凝）
a）取25µ
l10倍浓缩样品稀释液（10X）和475µ
l全血加入微量离心管，在旋涡振荡器上混匀。
b）室温下温育1小时，期间不时用旋涡器混合。
此样品可以直接按照“操作步骤”进行检测。
或：
直接将75µ
l全血加入酶标板孔中，再加入10µ
l5倍浓缩样品稀释液（5X）。
晃动酶标板/板条，使样品混合均匀。
再按照“操作步骤”进行检测。
细胞培养物
a）移去细胞培养液，收集培养瓶中的细胞加入到离心管中。
b）2，500xg离心5分钟，弃去上清。
c）向细胞团中加入500µ
l样品稀释液（1x）。
取此样品75µ
l按照“操作步骤”进行检测。
组织
最好用新鲜的组织。
如果有必要，组织可以在处理前于2～8℃冷藏保存1个月。
每只动物检测1～2种组织，最好选取扁桃体、脾、肠、肠系膜淋巴结或肺。
a）取1～2g组织用剪刀剪成小碎块（2～5mm大小）。
b）将组织碎块加入10ml离心管，加入5ml样品稀释液（1x），旋涡振荡混匀，室温下放置1～2小时，期间不时用旋涡器混合。
c）1，500xg离心10分钟，取75µ
l上清液按照“操作步骤”进行检测。
操作步骤
所有试剂在使用前应该恢复至室温18～25℃；
使用前试剂应在室温条件下至少放置1小时。
1、每孔加入25µ
lCSFV特异性单克隆抗体。
此步骤可以用多道加样器（8～12道）操作。
2、在相应孔中分别加入75µ
l阳性对照、阴性对照，各加2孔。
注意更换吸头。
3、在其余孔中分别加入75µ
l制备好的样品，注意更换吸头。
轻轻拍打酶标板，使样品混合均匀。
4、置湿盒中或用胶条密封后室温（18～25℃）温育过夜。
也可以放置室温温育4个小时，但是这可降低检测灵敏度。
5、甩掉孔中液体，用洗涤液（1X）洗涤5次，每次洗涤都要将孔注满。
将孔中的所有液体倒空，用力拍打酶标板，以使所有液体拍出。
或者，每孔加入洗涤液250～300µ
l用自动洗板机洗涤5次。
洗涤酶标板要仔细细心。
6、每孔加入100µ
l稀释好的辣根过氧化物酶标记物，在湿盒或密封后置室温温育1小时。
7、重复操作步骤5；
每孔加入100µ
l底物液，在暗处室温温育10分钟。
第1孔加入底物液开始计时。
8、每孔加入100µ
l终止液终止反应。
加入终止液的顺序与上述加入底物的顺序一致。
9、在酶标仪上测量样品与对照孔在450m处的吸光值，或测量在450nm和620nm双波长的吸光值（空气调零）。
10、计算每个样品和阳性对照孔的矫正吸光值的平均值（参见“计算方法”）。
计算方法
首先计算样品和对照孔的OD平均值，在判定结果之前，所有样品和阳性对照孔的OD平均值必须进行矫正，矫正的OD值等于样本或阳性对照值减去阴性对照值。
矫正OD=样本OD－阴性对照OD
北京爱德士元亨生物科技奋进行平均值相UN值计算并提供数据汇总的仪器和软件系统（xChek）
试验有效性判定
阳性对照OD平均值应该大于，阴性对照OD平均值应小于，试验结果方能有效。
否则，应仔细检查实验操作并进行重测。
如果阴性对照的吸收值始终很高，将阴性对照液在微量离心机中10，000xg离心3～5分钟，重新检测。
结果判定
被检样品的矫正吸光值大于或等于，则为阳性：
被检样品的矫正吸光值小于，则为阴性；
被检样品的矫正吸光值大于，小于，则为可疑。
建议根据外周血白细胞处理方案或细胞培养物处理方案进行全血样品的处理和检测。
猪瘟病毒抗体阻断ELISA试验
本方法是用于检测猪血清或血浆中猪瘟病毒抗体的一种阻断ELISA方法，通过待测抗体和单克隆抗体与猪瘟病毒抗原的竞争结合，采用辣根过氧化物酶与底物的显色程度来进行判定。
1操作步骤在使用时，所有的试剂盒组分都必须恢复到室温18～25℃。
使用前应将各组分放置于室温至少1小时。
1.1分别将50uL样品稀释液加入每个检测孔和对照孔中。
1.2分别将50uL的阳性对照和阴性对照加入相应的对照孔中，注意不同对照的吸头要更换，以防污染。
1.3分别将50uL的被检样品加入剩下的检测孔中，注意不同检样的吸头要分开，以防污染。
1.4轻弹微量反应板或用振荡器振荡，使反应板中的溶液混匀。
1.5将微量反应板用封条封闭置于湿箱中〔18～25℃〕孵育2小时，也可以将微量反应板用封条置于湿箱中孵育过夜。
1.6吸出反应孔中的液体，并用稀释好的洗涤液洗涤3次，注意每次洗涤时都要将洗涤液加满反应孔。
1.7分别将100uL的抗CSFV酶标二抗〔即取即用〕加入反应孔中，用封条封闭反应板并于室温下或湿箱中孵育30分钟。
1.8洗板〔见1.6〕后，分别将100uL的底物溶液加入反应孔中，于避光、室温条件下放置10分钟。
加完第一孔后即可计时。
1.9在每个反应孔中加入100uL终止液终止反应。
注意要按加酶标二抗的顺序加终止液。
1.10在450nm处测定样本以及对照的吸光值，也可用双波长（450nm和620nm）测定样本以及对照的吸光度值，空气调零。
1.11计算样本和对照的平均吸光度值。
计算方法如下：
计算被检样本的平均值OD450〔＝ODTEST〕、阳性对照的平均值〔＝ODPOS〕、阴性对照的平均值〔＝ODNEG〕。
根据以下公式计算被检样本和阳性对照的阻断率；
ODNEG-ODTEST
阻断率＝———————×
100%
ODNEG
2试验有效性阴性对照的平均OD450应大于0.50。
阳性对照的阻断率应大于50%。
3结果判定如果被检样本的阻断率大于或等于40％，该样本被判定为阳性〔有CSFV抗体存在〕。
如果被检样本的阻断率小于或等于30％，该样本被判定为阴性〔无CSFV抗体存在〕。
如果被检样本阻断率在30～40％之间，应在数日后再对该动物进行重测。
猪瘟单抗酶联免疫吸附试验
〔一〕材料及试剂
1．猪瘟单抗纯化抗原
2．兔抗猪IgG酶标抗体
3．猪瘟阳性血清
4．猪瘟阴性血清
1～4均由指定的生物制品所购买。
5．ELISA反应板
6．包被液
碳酸钠碳酸氢钠2O加至1000mlpH值
7．PBS液
氯化钠、磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、加双馏水1000ml
8．PBS－吐温洗涤液、PBS液1000ml、犊牛血清5ml、混合即可
9．底物溶液
⑴柠檬酸液、柠檬酸21g、双蒸馏水加至1000ml
⑵2HPO4液、Na2HPO4·
12H2O、双蒸馏水加至1000ml
⑶磷酸盐－柠檬酸缓冲液
取⑴液、⑵液混匀即可
⑷邻苯二胺液
取⑶液50ml、双馏水50ml、磷苯二胺20mg、30%H2O2，待邻苯二胺溶化后再
加H2O2，现用现配。
10．终止液
浓H2SO4、H2
〔二〕操作方法
1．用包被液将猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原、猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原各做100倍稀释，每孔包被100µ
l，4℃湿盒过夜。
2．次日取出，甩去孔内液体，3×
3′冲洗。
3．将待检血清以PBS液做400倍稀释，每孔加100µ
l同时将猪瘟阳性血清、猪瘟阴性血清各做100倍稀释，于对照孔中加100μl。
37℃温育1.5h～2h。
4．重复第二步，取出，甩去孔内液体，3×
3′洗涤。
5．将兔抗猪IgG酶标抗体以PBS液做100倍稀释，每孔加100μl，37℃温育1.5h～2h。
6．重复第4步。
7．每孔加底物溶液100µ
l，室温下观察显色反应。
当阴性对照孔稍显色时，立即终止反应，并以阴性孔做空白对照。
8．每孔加终止液50µ
l立即于酶联免疫吸附检测仪测定490nm波长的光密度。
〔三〕结果判定
在猪瘟弱毒酶联板上，OD≥0.2，为猪瘟弱毒抗体阳性；
OD＜0.2，为猪瘟弱毒抗体阴性。
在猪瘟强毒酶联板上，OD≥0.5，为猪瘟强毒抗体阳性；
OD＜0.2，为猪瘟强毒抗体阴性。
口蹄疫结构蛋白检测方法〔3ABC-I-ELISA〕
简介
口蹄疫（FMD）是一种高度接触性传染病，传播迅速，可形成世界性大流行，对养殖业和国际畜产品贸易具有严重的负面影响。
控制和消灭FMD策略包括疫苗免疫和屠宰可疑畜群。
在采用疫苗的国家，大多数动物血清口蹄疫病毒（FMDV）结构蛋白和病毒感染相关抗原（VIAA，即3D）抗体均为阳性，因此，一些基于结构蛋白和VIAA的诊断方法很难确定口问疫病毒感染与否。
只有将感染动物和隐性带毒动物与疫苗免疫动物加以区分才能为FMD的控制和消灭提供科学的依据。
日前的疫苗生产工艺，在病毒纯化过程中去除绝大部分非结构蛋白，因此灭活疫苗免疫动物体内没有病毒非结构蛋白3ABC抗体产生，而自然感染动物体内既有结构蛋白抗体，也有非结构蛋向3ABC抗体。
因此检测FMDV非结构蛋白3ABC抗体的ELISA方法不但可以检测隐性感染动物，而且可以区分感染动物和免疫动物。
口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测试剂盒（FMD3ABC-I-ELlSA）对感染牛的检出率很高，敏感性在99%以上。
对免疫牛的特异性在96%以上。
用途
FMD3ABC-I-ELISA试剂盒检测FMDV非结构蛋白3ABC抗体。
该试剂盒不受血清型影响，适用于活畜进出口调运、疫区净化检疫和群体无症状感染评价，区分感染和免疫动物
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