多功能融合酶基因Linker的优化及表达.docx

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多功能融合酶基因Linker的优化及表达

多功能融合酶基因Linker的优化及表达

　　摘要：

在融合酶阿拉伯/木糖苷酶-木聚糖酶（Xar-xynA）之间插入不同组成和长度的多肽Linker，避免催化结构域相互之间的干扰，改善融合酶的催化效率。

5个含不同长度及Ala/Gly比例连接肽Linker的融合突变体在大肠杆菌重组表达、纯化，并对融合酶的酶学性质、动力学参数和酶解作用进行研究。

结果表明，融合酶Xar-L1/L2/L3-xynA和融合酶Xar-xynA有着相似的最适温度和最适pH值。

其中融合酶Xar-L1-xynA在65～80℃和pH值6.6～8.2有更强的阿拉伯/木糖苷酶热稳定性和pH值稳定性，将融合酶Xar-L1-xynA在65℃保温60min其阿拉伯/木糖苷酶活性有着明显的激活现象。

并获得连接Xar和XynA的最优Linker：

L1和L4，麦麸和玉米芯木聚糖产物酶解试验的结果表明，融合酶Xar-L1-xynA和Xar-L4-xynA比其他的融合酶有着更高的催化效率。

　　关键词：

多功能性酶；基因融合；木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶；木聚糖酶；连接肽

　　中图分类号：

Q786

　　文献标志码：

A

　　文章编号：

1002-1302（2016）04-0031-05

　　木聚糖是存在于农业废弃物中最丰富的半纤维素，由于木聚糖结构及降解方式的复杂性，彻底降解需要多种水解酶的协同作用。

同时使用多种水解酶来降解木聚糖，虽然清洁高效，但工序复杂，成本高。

近来FanZ等[1-3]将有关水解酶融合形成多功能融合酶来作用于水溶性阿拉伯木聚糖，玉米芯等农业废弃物，这方面研究不但提高了利用酶的综合效率，而且简化了工序和降低了成本。

　　构建的融合酶常因前后结构域的相互干扰而影响各自活性的发挥，于是在2结构域中插入多肽Linker（连接序列）来减弱或消除这种干扰。

已发现有不少多肽可作为连接融合酶的2个结构域的Linker，赋予多功能融合酶的空间柔性，增强酶位点识别，保持相临结构域的功能独立（不受干扰）[4]。

Carlsson等在融合酶的2个催化单元间插入多肽Linker（Linker1：

GDPLERSDP；Linker2：

GDPLEANGIRSDP）使融合酶中的乳糖苷酶和半乳糖脱氢酶的活性提高[5]；Lu等在融合酶中插入Linker（GGGGSGGGGS），使融合酶中的葡聚糖酶活性增加326%，木聚糖酶活性增加43%[6]等。

　　由于热稳定的酶在工业中有着广泛的应用前景，本研究选用疏棉状嗜热丝孢菌ThermomyceslanuginosusDSM5826木聚糖酶A（XynA）作为重组融合酶的一个酶源。

该木聚糖酶优先降解高聚合度的木聚糖链，产物是不同聚合度的低聚木糖，不产生木单糖，这对于生产低聚木糖具有很好的应用价值[7]。

另外选择1个具有双重活性的酶即嗜热厌氧乙醇菌Thermoanaerobacterethanolicus产生的阿拉伯呋喃糖苷酶（Xar）作为融合酶的酶源[8]，可以减少融合酶源的个数。

　　本研究针对半纤维素的结构及其降解复杂的特点，采用不同组分和长度的多肽Linker连接双活性阿拉伯/木糖苷酶（Xar）和木聚糖酶A（XynA）构建多功能半纤维素酶，并对融合酶的酶学性质、动力学参数和酶解作用进行研究，以获得三功能融合酶的催化效率增强的最优linker。

使得通过蛋白质工程构建多功能半纤维素酶来促进生物转化成为可能，为酶法降解半纤维素的工业化生产提供有效的技术路线和解决方案。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　质粒和菌株：

含有嗜热乙醇菌JW200（ThermoanaerobacterethanolicusJW200）α-阿拉伯糖苷酶/木糖苷酶（Xar）基因和疏棉状嗜热丝孢菌DSM5826（ThermomyceslanuginosusDSM5826）木聚糖酶A（XynA）基因的质粒pET-20b-xar和pET-20b-xar-xynA由前期研究构建保存。

大肠杆菌（Escherichiacoli）DH10B（Promega）用于质粒扩增和分子克隆等过程，E.coliJM109（DE3）（Promega）作为目的基因的表达宿主。

　　主要试剂：

限制性内切酶EcoRⅤ、XbaⅠ、XhoⅠ，Pyrobest聚合酶，T4DNA连接酶购自TaKaRa公司；燕麦木聚糖（OSX），对硝基苯酚-α-阿拉伯呋喃糖苷（pNPAF）和对硝基苯酚-β-木糖苷（pNPX）购自Sigma公司。

　　1.2方法

　　1.2.1基因操作DNA片断的分离、DNA的内切酶水解和连接、基因的电转化等方法均参照文献[9]。

琼脂糖电泳胶回收DNA片断和质粒的制备参考QIAGEN公司QIAquickGelExtractionKit和QIAprepSpinPlasmidMiniprepKit试剂盒使用指南进行。

　　1.2.2重组质粒pET-20b-xar-linker-xynA的构建设计长引物将连接肽融入基因间，融合基因中插入的连接肽氨基酸序列及其名称及本研究融合基因涉及的引物序列见表1。

将12个氨基酸长度的连接肽L1（SAGSSAAGSGSG）相应的碱基序列设计在长引物S1上，通过PCR将连接肽融入2个基因之间。

以质粒pET-20b-xar-xynA为模板，利用相应的上下游引物S1和P4（表1）扩增含连接肽L1的基因xynA。

反应体系（50μL）：

10×buffer5μL；dNTP（各2.5mmol/L）4μL；S1（50μmol/L）1μL；P4（50μmol/L）1μL；模板（10μg/mL）1μL；ProbestDNApolymerase（1.25U/μL）1μL；H2O37μL。

PCR扩增参数均设为：

先在95℃变性5min，加PyrobestDNA聚合酶1μL；然后94℃变性30s，50℃退火40s，72℃延伸1min，循环30次后，72℃保温10min。

将所得PCR片段和载体用T4DNA连接酶于16℃连接过夜，将连接液电转化感受态细胞E.coliDH10B。

挑取阳性克隆，提取质粒，用单、双酶切验证。

送至上海美吉生物技术公司测序，正确的转化子命名为pET-20b-xar-L1-xynA。

　　连接肽L2含有24个氨基酸，即（SAGSSAAGSGSG）2。

其相应的上下游引物为P1和S2（表1）。

构建成功的重组质粒命名为pET-20b-xar-L2-xynA。

　　连接肽L3的氨基酸序列为GGGGSGGGGS，同连接肽L1的插入方法一样，参考大肠杆菌氨基酸偏好密码子，将连接肽L3的碱基序列设计在长引物S3上。

重组质粒命名为pET-20b-xar-L3-xynA。

　　在连接肽L1的基础上设计了连接肽L4：

SGGSSAAGSGSG和L5：

SAGSSAAASASG，在已构建的重组质粒的基础上，设计了引物S4和S5。

构建的重组质粒命名为pET-20b-xar-L4/L5-xynA。

　　1.2.3重组酶的可溶性表达和活性检测将重组质粒pET-20b-xar，pET-20b-xar-xynA和pET-20b-xar-L1-xynA分别电转化于E.coliJM109（DE3），挑取单菌落接入含Amp抗性的LB培养液，进行IPTG诱导培养。

待培养结束，检测各样品细胞密度，取菌液1mL，离心收集菌体。

用100mmol/LpH值6.2的邻苯二甲酸氢钾-咪唑缓冲液（PIB）重悬，调整细胞密度一致。

经超声破碎，离心30min，上清即为粗酶液。

分别进行木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶和木糖苷酶活性的测定[8，10]。

同时进行SDS-PAGE，以检测各种重组质粒在宿主E.coliJM109（DE3）的可溶性表达情况。

　　1.2.4重组酶的纯化将质粒pET-20b-xar-xynA和pET-20b-xar-L1/L2/L3/L4/L5-xynA分别电转化于JM109（DE3），挑取单菌落接种于LB培养基中。

将培养好的菌液离心收集细胞，用高压破碎法破碎细胞，离心，接着65℃下热处理20min，最后用Ni2+亲和层析法纯化带连接肽的重组融合酶。

　　1.2.5重组酶Xar-L1/L2/L3-xynA的酶学性质

　　1.2.5.1最适反应温度的测定木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶活性的最适反应温度的测定：

酶促反应在50mmol/LpH值6.2的PIB缓冲液中进行。

在45～95℃范围，每隔5℃分别测定3种酶的活力。

以最高酶活力为100%，计算相对活性。

　　1.2.5.2最适反应pH值的测定木聚糖酶、木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶活性分别在65℃、90℃和80℃下测定不同的pH值（4.2～8.2）对酶活力的影响，以最高酶活为100%，计算相对活性。

　　1.2.5.3热稳定性的测定木聚糖酶活性热稳定性测定，是将融合酶分别置于50～80℃范围内，每隔5℃下保温1h，然后在65℃、pH值6.2测定残留活力，以保存于冰浴中的酶活力为100%，计算相对活性，找到酶活力半衰期为1h的温度。

木糖苷酶活性热稳定性的测定，是将酶置于65～90℃下保温1h，然后在90℃、pH值6.2测定残留活力。

阿拉伯糖苷酶活性热稳定性的测定，是将酶置于65～90℃下保温1h，然后在80℃、pH值6.6测定残留活力。

　　1.2.5.4pH值稳定性的测定将纯酶置于不同pH值（4.2～8.2）的100mmol/LPIB缓冲液中，在37℃下保温1h，冷却，然后补加相应的底物和缓冲液达到200μL。

再于最适温度和最适pH值下分别测定残留活力性，以保存于冰浴中的酶活力为100%，作pH值稳定性曲线。

　　1.2.5.5动力学参数的测定用pH值6.2PIB缓冲液分别配制0.25～2.5mg/mL的燕麦木聚糖（OSX）和0.02～0.2mmol/L的pNPX作为底物，用pH值5.8的缓冲液配制0.1～1.0mmol/L的pNPAF作为底物，然后分别在最适温度65℃、90℃、70℃测重组融合酶的木聚糖酶、木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶的活性。

采用Lineweaver-Burk作图法，计算重组融合酶3种活性的Km、Vmax及Kcat/Km值，其中Kcat=最大反应速度/蛋白摩尔数。

　　1.2.6融合酶的酶解试验分别称取玉米芯木聚糖（CX）[11]和去淀粉麦麸（DSWB）[12]200mg溶于pH值7.0、250mmol/L的磷酸缓冲液中，总体系为5mL。

以不加入任何融合酶的酶解体系为试验对照，其他的试验项（1～6）分别加入纯化融合酶Xar-xynA和Xar-L1/L2/L3/L4/L5-xynA。

以加入的融合酶Xar-L1-xynA的木聚糖酶酶单位（20U）为标准，其他试验项加入等摩尔数相对应的融合酶。

于65℃条件下反应1、4、10、24h后取样利用DNS法测还原糖浓度。

　　2结果与分析

　　2.1重组质粒pET-20b-xar-linker-xynA的构建

　　重组质粒pET-20b-xar-xynA和pET-20b-xar-L1/L2/L3/L4/L5-xynA构建的示意图见图1。

　　将连接肽L1的碱基序列设计在长引物S1上，通过PCR将连接肽融入2个基因之间。

扩增的DNA片段与实际大小一致为600bp，没有明显的非特异性条带，说明所选PCR扩增条件能有效扩增L1-xynA基因片段（图2-a）。

　　对于已构建的重组质粒pET-20b-xar-L1-xynA采用XbaⅠ和XhoⅠ双酶切，得到线性的pET-20b质粒和插入的xar-L1-xynA基因片段，大小分别为3.7kb和2.9kb，与预计结果的相同（图2-b），测序结果表明该质粒构建成功。

　　用同样的方法构建和验证其他4种带连接肽的重组质粒pET-20b-xar-L2/L3/L4/L5-xynA。

　　2.2融合酶Xar-L1-xynA的可溶性表达　　来源于真菌的XynA在大肠杆菌中虽然能高表达，但却形成大量的包涵体。

本研究将来源于细菌在宿主中没有包涵体生成的重组酶Xar融合在XynA的上游，是否能改善木聚糖酶A的可溶性表达情况。

由图3的SDS-PAGE谱图可知，使用带有T7启动子的pET-20b系统虽然实现了重组酶Xar、Xar-xynA和Xar-L1-xynA在E.coli中的高表达，但重组酶Xar-L1-xynA和Xar-xynA相对于重组酶Xar，却产生了部分的不溶性目的蛋白（泳道10、11），可知重组酶Xar的融合并没有改善多功能融合酶的可溶性表达。

　　2.3融合酶的纯化

　　将重组质粒pET-20b-xar-xynA、pET-20b-xar-L1/L2/L3/L4/L5-xynA，分别转化E.coliJM109（DE3），挑取单菌落于液体LB培养基中经IPTG诱导后，收集细菌经高压破碎，离心取上清分别进行酶活性的测定，结果表明构建成功的5种重组质粒能够在E.coliJM109（DE3）中进行活性表达。

上清液经热处理和Ni2+亲和层析两步纯化操作，所得6种融合酶经SDS-PAGE检测达到电泳均一（图4），与预期的蛋白分子量一致。

　　2.4融合酶Xar-L1/L2/L3-xynA和Xar-xynA的酶学性质

　　2.4.1最适反应温度和最适pH值分别用OSX、pNPX和pNPAF作为底物测得融合酶Xar-L1/L2/L3-xynA和Xar-xynA的木聚糖酶、木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶3种活性的最适反应温度及最适pH值，与融合酶Xar-xynA相似（表2）。

　　2.4.2温度稳定性由图5-a可知，融合酶Xar-L1/L2/L3-xynA和Xar-xynA的木聚糖酶活性有着相似的温度稳定性。

融合酶Xar-L1-xynA在65、70、75℃保温1h，木糖苷酶相对活性分别为246%、227%和182%（图5-b），阿拉伯糖苷酶相对活性分别为249%、226%和140%（图5-c），热稳定性明显优于其他3种酶的木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶活性的热稳定。

　　2.4.3pH值稳定性融合酶Xar-L1-xynA的木聚糖酶、木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶活性的pH值稳定性，分别在pH值5.8～8.2、pH值7.5～10.0和pH值5.8～8.2之间优于其他3种酶（图6）。

融合酶Xar-L1-xynA在pH值6.6～7.8之间的木聚糖酶、木糖苷酶（pH值8.2）和阿拉伯糖苷酶相对活性都大于100%。

　　2.4.4动力学参数融合酶Xar-xynA和Xar-L1/L2/L3-xynA以OSX，pNPX和pNPAF作为底物的动力学参数见表2。

　　2.5融合酶的酶解试验

　　在65℃、pH值7.0酶解24h，融合酶Xar-L1-xynA、Xar-L4-xynA酶解去淀粉麦麸和玉米芯木聚糖的效果最佳，释放的还原糖浓度达到2.3、2.26mg/mL（图7-a）和126、12.4mg/mL（图7-b），明显高于融合酶Xar-L2/L3/L5-xynA和Xar-xynA。

融合酶Xar-L5-xynA酶解去淀粉麦麸释放的还原糖量最低。

融合酶Xar-L2/L3/L5-xynA酶解玉米芯木聚糖释放的还原糖量与融合酶Xar-xynA接近。

　　3讨论

　　在优选的2个催化结构域Xar和XynA间插入连接肽L1构建了融合酶Xar-L1-xynA，试验结果表明，该融合酶有着比其他融合酶更高的热稳定性和pH值稳定性。

在65℃保温60min融合酶Xar-L1-xynA的阿拉伯/木糖苷酶相对活性有被激活现象。

有文献报道在高温酶葡萄糖苷酶的C末端融合上中温酶C末端的部分氨基酸，可以使高温酶的热稳定性明显降低[13-14]。

据推测融合酶Xar-L1-xynA不止以

　　唯一的一种形态存在，或者融合酶Xar-L1-xynA是以比其他融合酶更优化的形态存在，这些推测还待进一步证明。

更具优势的热稳定性、pH值稳定性，或者更优的结构形态使融合酶Xar-L1-xynA在酶解试验中有着最高的酶解效率。

　　本研究在L1的基础上增加连接肽的长度进一步提高融合酶的催化效率。

于是在2个催化结构域间插入连接肽L2，其氨基酸的序列是（SAGSSAAGSGSG）2，并构建了融合酶Xar-L2-xynA。

结果表明连接肽L1具有避免相邻2个结构域相互干扰的功能，但连接肽L2却没有这种功能。

据推测可能是因为连接肽L2长度太长，2个结构域的活性位点之间的协同作用并没有充分地表现出来。

这种现象在其他文献中也有报道，EBFP到EGFP荧光能量转移时随着连接肽长度的增加而减弱[15]。

　　[GGGGS]n（1≤n≤6）是迄今应用最为频繁的连接肽序列，尤其是在抗体工程研究上，包括单链抗体（single-chainantibody，scFv）构建时轻重链可变区（VL和VH）间的连接[16]。

本研究将（GGGGS）2插入在融合酶Xar-xynA这2个结构域之间构建融合酶Xar-L3-xynA，作为其他带连接肽的融合酶在应用中的对照。

在酶解木聚糖时，融合酶Xar-L3-xynA比融合酶Xar-L1/L2/L4/L5-xynA有着更低的催化效率。

据推测连接肽L3在Xar和XynA结构域之间并不是以延伸的结构形态存在，从而导致功能的部分损失。

虽然甘氨酸（Gly）为连接肽提供必要的柔性，但这种成分单一的连接肽（GGGGS）2却限制了融合酶的功能活性。

这些结果表明，添加在结构域之间影响功能的连接肽不仅取决于连接肽Linker的长度及成分，同样取决于融合结构域的结构和大小。

　　丙氨酸（Ala）因为它小的侧链―CH3从而不会干扰相邻结构域的侧链，能为设计的连接肽提供稳定的螺旋结构[17]。

蛋白工程研究表明Ala和丝氨酸（Ser）是以不同的方式影响着连接肽的柔性[18]。

本研究改变了连接肽L1的Ala/Gly比例（即连接肽L4含有2个Ala和5个Gly，连接肽L5有5个Ala和2个Gly），来改变连接肽L1的柔性，构建了融合酶Xar-L4-xynA和Xar-L5-xynA。

结果表明融合酶Xar-L4-xynA在降解农业废弃物时有着和Xar-L1-xynA相似的酶解效率，而融合酶Xar-L5-xynA却表现一定功能的损失。

对这种现象的解释是：

将连接肽L1的Ala个数增大到5个，可能降低了连接肽的柔性，使相邻的2个功能结构域不能独立地发挥作用[19]。

　　4结论

　　在融合酶Xar-xynA的2个结构域中插入优化的连接肽，其木聚糖酶、木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶活性能够得到改善，获得连接Xar和XynA这2个结构域最佳连接肽L1和L4，即SAGSSAAGSGSG和SGGSSAAGSGSG。

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