新版GMP微生物限度检查法验证报告Word格式.docx
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低
高
RPN≤7
可以接受，无需采取措施
2
中
16≥RPN≥8
一定程度上接受，但应按风险优先级
采取措施尽可能降低
3
RPN＞16或严重程度＝4
不能接受，尽快采取措施降低
4
关键
极高
极低
步骤/单元
危害
S
可能原因/
程序失败
现行控制
R
N
需采取措施
培训
验证部分项目出现偏差或漂移
方案培训不到位，方案的执行者不熟悉方案内容
严格执行经批准的验证报告进行培训，并考核合格
18
确认按照批准的方案培训，培训者均熟练掌握所培训内容。
检验过程操作不当
未达到设定标准，验证失败。
未遵循成品微生物限度检查操作规程，未严格遵循方案规定方法。
制定成品微生物限度检查操作规程，并对规程及设立的验证方法培训，按规程及方案要求进行操作。
确认成品微生物限度检查操作规程已制定并批准，确认人员已培训；
确认操作规程适用性。
4.验证前准备
4.1验证人员培训：
验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。
培训人员记录见附件1。
4.2将所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
4.3仪器与器具：
恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台、无菌培养皿、无菌移液管。
5.验证内容
5.1测试环境条件要求
所有检查在环境洁净度C级下的局部A级洁净度的单向流空气区域内隔离系统内进行，其全过程严格遵守无菌操作，能防止微生物污染。
5.2试验样品
*******
批号：
；
规格：
）
5.3验证用菌种及培养基：
5.3.1来源：
食品药品检验所
5.3.2菌落计数用菌种
菌种名称
内控编号
大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC（B）44102]
E-
金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC（B）26003]
S-
枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）[CMCC（B）63501]
B-
白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC（F）98001]
C-
黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC（F）98003]
A-
注：
编号由菌种首字母-传代代数-配制日期组成。
5.3.3培养基及其制备方法：
取市售的脱水培养基，分别按照规定方法进行配制后灌装于洁净的三角烧瓶中，然后加塞灭菌，在实验前加温熔化备用。
培养基名称
培养基批号
配制日期
有效期至
改良马丁琼脂培养基
玫瑰红钠琼脂培养基
营养琼脂培养基
5.4细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证：
按照中国药典2010年版微生物限度检查法中的平皿法进行细菌、霉菌及酵母菌计数的方法学验证试验及菌落计数。
5.4.1稀释液
5.4.1.10.9%无菌氯化钠溶液：
取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，121℃高压蒸汽灭菌30分钟。
5.4.1.2pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：
取磷酸二氢钾3.56g，磷酸氢二钠7.23g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，分装，过滤，121℃高压蒸汽灭菌30分钟。
5.4.2实验中所使用的玻璃仪器及金属器皿在使用前均经过200℃干热灭菌2小时。
5.4.3菌液制备
5.4.3.1接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养琼脂培养基中，30～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml，加0.9％无菌氯化钠溶液至10ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-6～10-7，使菌数约为50～100cfu/ml，做活菌计数备用。
5.4.3.2接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48小时，取此培养液1ml，加0.9％无菌氯化钠溶液至10ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-6～10-7，使菌数约为50～100cfu/ml，做活菌计数备用。
5.4.3.3接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天的用3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤丝的无菌毛细吸管）至无菌试管中，取1ml加含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液至10ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4～10-6,制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液备用。
5.4.4供试液的制备：
称取供试品10g，加温度不超过45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀后，作为1:
10的供试液。
5.4.5验证方法
5.4.5.1试验组：
取1:
10的供试液1ml和试验菌1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。
每稀释级每种培养基至少制备2个平板。
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌贴于营养琼脂培养基平皿上，白色念珠菌、黑曲霉玫瑰红钠琼脂培养基平皿上。
5.4.5.2供试品对照组：
10的供试品1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。
5.4.5.3菌液组：
取试验菌1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。
5.4.5.4稀释剂对照组：
取稀释液1ml和试验菌1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。
5.4.5.5验证试验进行三次独立的平行试验，并分别计算各次试验的菌回收率。
测定结果见附件2～附件6。
5.4.5.6菌回收率计算
_;
_Jt_*试验组的菌回收率（%）=
试验组平均菌落数—供试品对照组平均菌落数
×
100%_`h___1__2
菌液组平均菌落数
6k+FTDL_
稀释剂对照组的菌回收率（%）=
稀释剂对照组平均菌落数
×
100%/_ZZo`__
菌液组平均菌落数
B:
）9hF_?
o@
5.4.6判定标准：
试验组和对照组的菌回收率均应不低于70%。
5.4.7结论：
5.5控制菌检查验证方法：
按照中国药典2010年版微生物限度检查法进行控制菌的方法学验证试验及检查。
5.5.1验证用菌种：
5.5.1.1来源：
5.5.1.2验证用菌种
5.5.1.3培养基及其制备方法：
取市售的脱水培养基，分别按照规定的方法进行配制后灌装于洁净的三角烧瓶中，然后加塞灭菌。
在实验前加温熔化备用。
胆盐乳糖培养基
MUG培养基
乳糖胆盐发酵培养基
5.5.2菌液制备：
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至10ml营养琼脂培养基中，30～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液至10ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，使细菌数约为10～100cfu/ml。
5.5.3供试液的制备：
5.5.3.1称取供试品10g，加稀释剂至100ml，混匀后，作为1:
5.5.3.2取1:
10的供试液10ml，加稀释剂至100ml，混匀后，作为1:
100的供试液。
5.5.3.3取1:
100的供试液10ml，加稀释剂至100ml，混匀后，作为1:
1000的供试液。
5.5.4控制菌检查方法的验证
5.5.4.1大肠埃希菌：
5.5.4.1.1供试品组：
取供试液（1:
10）10ml，直接接种至100ml胆盐乳糖培养基上，培养18～24小时。
取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外光下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。
若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；
不呈现荧光，为MUG阴性。
观察后，沿培养管的管壁加入数滴里靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；
呈试剂本色，为靛基质阴性。
制备2个样品，记录结果。
5.5.4.1.2试验组：
10）10ml，直接接种至100ml胆盐乳糖培养基上，培养18～24小时。
5.5.4.1.3阳性对照组：
取试验菌1ml，直接接种至胆盐乳糖培养基上，培养18～24小时。
5.5.4.1.4阴性对照组：
取稀释剂10ml，直接接种至胆盐乳糖培养基上，培养18～24小时。
5.5.4.1.5阴性菌对照组：
10）10ml，直接接种至胆盐乳糖培养基上，培养18～24小时。
观察后，\沿培养管的管壁加入数滴里靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；
5.5.4.1.6验证试验进行三次独立的平行试验，并分别记录结果。
测定结果见附件7。
5.5.4.1.7判定标准：
供试品组MUG培养基、靛基质菌应为阴性；
试验组MUG培养基、靛基质菌应为阳性；
阳性对照组MUG培养基、靛基质应为阳性；
阴性对照组MUG培养基、靛基质菌应为阴性。
5.5.4.1.8结论：
5.5.4.2大肠菌群：
5.5.4.2.1供试品组：
取含适量（不少于10ml）的乳糖胆盐发酵培养基管3支，分别加入1:
10的供试液1ml、1:
100的供试液1ml、1:
1000的供试液1ml，培养18～24小时。
观察乳糖胆盐发酵管的菌落情况，记录结果。
5.5.4.2.2试验组：
10的供试液及试验菌各1ml、1:
100的供试液及试验菌各1ml、1:
1000的供试液及试验菌各1ml，培养18～24小时。
5.5.4.2.3阳性对照组：
取1支乳糖胆盐发酵培养基管加入大肠埃希菌1ml，培养18～24小时。
5.5.4.2.4阴性对照组：
取1支乳糖胆盐发酵培养基管加入稀释液1ml，培养18～24小时。
5.5.4.2.5阴性菌对照组：
取1支乳糖胆盐发酵培养基管加入金黄色葡萄球菌1ml，培养18～24小时。
5.5.4.2.6验证试验进行三次独立的平行试验，并分别记录结果。
测定结果见附件8。
5.5.4.2.7判定标准：
供试品组应无菌生长或有菌生长但不产酸产气，为阴性；
试验组应有菌生长并产酸产气，为阳性；
阳性对照组应有菌生长并产酸产气，为阳性；
阴性对照组应无菌生长，为阴性；
阴性菌对照组应无菌生长，为阴性。
5.5.4.2.8结论：
6.变更和偏差处理：
7.验证结果评定及结论：
本品对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉生长无影响，其试验组、稀释剂对照组回收率均达70%以上，控制菌试验组试验菌生长良好，阴性菌对其无干扰，此次整个验证试验无遗漏，验证记录完整，验证过程中无偏差，验证试验结果符合《中国药典》2010年版一部微生物限度检查验证试验要求。
发放验证证书，见附件9。
同时，确定本品微生物限度检查如下：
1、细菌、霉菌及酵母菌：
取供试品1ml，采用平皿法，直接接种至培养基中，照《中国药典》2010年版一部微生物限度检查项下要求进行检查。
2、大肠埃希菌：
取供试品10ml，采用平皿法，直接接种至培养基中，照《中国药典》2010年版一部微生物限度检查项下要求进行检查。
3、大肠菌群：
分取1:
10、1:
100、1：
1000的供试品，至乳糖胆盐发酵培养基管中，照《中国药典》2010年版一部微生物限度检查项下要求进行检查。
8.再验证周期：
结合本次验证结论，针对本次验证，对下次验证周期规定如下：
8.1发生重大变更或严重偏差，应及时采取措施并进行验证；
8.2验证状态出现较大偏移或出现不良趋势时，应组织分析，采取措施，需要时进行验证；
8.3产品的处方发生变动或其它因素变更导致产品的物料性质改变时，需要对本方案进行调整后作方法学再验证。
8.4国家相关微生物限度检查标准修改后需要对本方法重新进行再验证。
8.5原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检验方法应重新验证。
9.会审及批准
会审：
经验证小组会审，再验证结果真实、可靠。
批准：
*******微生物限度检查法再验证结果有效，从年月日起可以使用该方法进行检验。
附件1
培训人员记录表
部门
培训人员签名
签到日期
培训师签名
日期
附件2
大肠埃希菌回收率测定（平皿法）
试验
批号
供试品稀释倍数
菌落计数（平均数）cfu/ml
回收率%
平皿
试验组
菌液组
供试品对照组
稀释剂对照组
1
平均
验证结果评定
操作人
日期
复核人
附件3
金黄色葡萄球菌回收率测定（平皿法）
附件4
枯草芽孢杆菌回收率测定（平皿法）
附件5
白色念珠菌回收率测定结果（平皿法）
附件6
黑曲霉回收率测定结果（平皿法）
附件7
大肠埃希菌（平皿法）检查结果
试验批号
结果
项目
供试品组
阳性
对照组
阴性
阴性菌
MUG
靛基质
附件8
大肠菌群检查结果
阳性对照组
阴性对照组
阴性菌对照组
10-1
10-2
10-3
乳糖胆盐发酵
附件9
偏差处理与变更记录
验证项目名称
验证项目编号
偏差说明：
可能的原因：
偏差分类：
□重大□小
理由：
采取措施：
（如需要另附文件）
结果：
建议（如需要另附文件）
□接受偏差
□不接受偏差
批准人：
日期：
附件10
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