血液中45种有毒生物碱成分的液相色谱串联质谱检验方法Word文档下载推荐.docx
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I
血液中45种有毒生物碱成分的液相色谱-串联质谱检验方法
1范围
本技术规范规定了血液中45种有毒生物碱成分（见附录A）的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检验方法。
本技术规范适用于血液中45种有毒生物碱成分的定性定量分析。
也适用于尿液及体外样品、可疑物证中45种有毒生物碱的定性分析。
2规范性引用文件
下列文件中对本技术规范的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本技术规范。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本技术规范。
GA/T122毒物分析名词术语
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
GA/T122中界定的术语和定义适用于本技术规范。
4原理
本法利用45种有毒生物碱成分可在碱性条件下被有机溶剂从血液中提取出来的特点，以SKF525A为内标，用液相色谱-串联质谱法的多反应监测（MRM）模式进行检测，经与平行操作的有毒生物碱对照品比较，以保留时间、两对母离子/子离子对进行定性分析；
以定量离子对峰面积为依据，内标法或外标法定量。
5试剂和仪器
5.1试剂
5.1.1乙腈。
5.1.2甲酸：
优级纯。
5.1.3甲醇。
5.1.4乙醚：
分析纯。
5.1.5乙酸铵。
5.1.6超纯水：
由纯水系统制得，电阻率18.2MΩ·
cm。
5.1.7pH9.2硼砂缓冲液。
5.1.8流动相缓冲液：
20mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸缓冲液：
分别称取1.54g乙酸铵和1.84g甲酸置于
1000mL容量瓶中，加水定容至刻度，pH值约为4。
1
5.1.945种有毒生物碱对照品标准溶液：
分别精密称取45种有毒生物碱对照品各适量，用甲醇配成
1.0mg/mL对照品标准储备溶液，置冰箱中冷冻保存，保存时间为12个月。
试验中所用其它浓度的对照
品标准溶液均从上述储备液用甲醇稀释而得。
5.1.10内标物SKF525A对照品标准溶液：
精密称取SKF525A适量，用甲醇配制成1.0mg/mLSKF525A对
照品标准储备溶液，置冰箱中冷冻保存，保存时间为12个月。
将储备液用甲醇稀释得5µ
g/mLSKF525A
内标工作液，置冰箱中冷藏保存，保存时间为6个月。
注：
本技术规范所用试剂除另有说明外均为色谱纯，试验用水为一级水（见GB/T6682规定）。
5.2仪器
5.2.1液相色谱-串联质谱仪：
配电喷雾离子源（ESI）。
5.2.2分析天平：
感量0.1mg。
5.2.3涡旋混合器。
5.2.4离心机。
5.2.5精密移液器。
5.2.6恒温水浴锅。
6测定步骤
6.1样品预处理
6.1.1待测样品
取待测血液1mL，加5µ
g/mLSKF525A内标工作液10L，加1mLpH9.2硼砂缓冲液后，用乙醚3mL
提取，涡旋混合，离心，将乙醚层转移至另一试管中，同法提取两次，合并乙醚液，置60°
C水浴中挥
干，残留物用100L流动相（乙腈∶流动相缓冲液=70∶30）定容，供LC-MS/MS分析。
6.1.2空白样品
取空白血液1mL，按“6.1.1”项下进行操作和分析。
6.1.3添加样品
取空白血液1mL，添加待测样品中出现的可疑有毒生物碱对照品，按“6.1.1”项下进行操作和分
析。
6.2测定
6.2.1液相色谱-串联质谱仪参考条件
a）液相色谱柱：
CapcellPakC18（250mm2.0mm，MGⅡ5m）或相当者；
b）柱温：
室温；
c）流动相：
V（乙腈）∶V（流动相缓冲液）=70∶30；
d）流速：
200L/min；
e）进样量：
5L；
f）离子源：
电喷雾电离-正离子模式（ESI+）；
g）检测方式：
多反应监测（MRM）；
h）离子源电压（IS）：
5500V；
i）碰撞气（CAD）、气帘气（CUR）、雾化气（GS1）、辅助气2（GS2）均为高纯氮气，使用前调节各
气流流量以使质谱灵敏度达到检测要求；
2
j）各成分去簇电压（DP）、碰撞能量（CE）等电压值应优化至最佳灵敏度（见附录A）。
6.2.2定性分析
定性分析以两对母离子/子离子对进行（见附录A）。
如果待测样品出现某一有毒生物碱两对母离子
/子离子对的特征色谱峰，保留时间与添加样品中相应对照品的色谱峰保留时间比较，相对误差在2%
内，且所选择的离子对相对丰度比与添加对照品的离子对相对丰度比之相对误差不超过表1规定的范
围，则可认为待测样品中检出此种有毒生物碱成分。
表1相对离子对丰度比的最大允许相对误差（%）
相对离子对丰度比≥502050102010
允许的相对误差20253050
6.2.3定量分析
6.2.3.1定量方法
根据待测样品中有毒生物碱的浓度情况，用空白血液添加相应有毒生物碱对照品，采用内标法或外
标法，以定量离子对峰面积进行定量测定。
定量方法可采用工作曲线法或单点校正法。
采用工作曲线法时待测样品中有毒生物碱的浓度应在工作曲线的线性范围内。
配制系列浓度的有毒
生物碱血液质控样品，按“6.1.1”进行样品处理，按“6.2.1”条件进行测定，以有毒生物碱和内标定量离子
对峰面积比（或有毒生物碱定量离子对峰面积）为纵坐标，血液中有毒生物碱浓度为横坐标绘制工作曲
线，用工作曲线对待测样品中有毒生物碱浓度进行定量。
采用单点校正法时待测样品中有毒生物碱的浓度应在添加样品中有毒生物碱浓度的50%内。
6.2.3.2结果计算
6.2.3.2.1内标-工作曲线法
在系列浓度的有毒生物碱血液质控样品中，以有毒生物碱与内标SKF525A定量离子对的峰面积比（Y）
为纵坐标、有毒生物碱质量浓度（C）为横坐标进行线性回归，得线性方程。
根据待测样品中有毒生物碱与内标SKF525A定量离子对峰面积比，按公式
（1）计算出待测样品中
有毒生物碱的质量浓度。
C
Ya
………………………………
（1）
b
式中：
C待测样品中有毒生物碱质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
Y待测样品中有毒生物碱与内标峰面积比；
a线性方程的截距；
b线性方程的斜率。
6.2.3.2.2内标-单点校正法
根据待测样品及添加样品中有毒生物碱与内标SKF525A定量离子对峰面积比，按公式
（2）计算出待
测样品中有毒生物碱的质量浓度。
3
AAc
i………………………………
（2）
AA
i
A待测样品中有毒生物碱的峰面积；
A′添加样品中有毒生物碱的峰面积；
Ai待测样品中内标的峰面积；
Ai′添加样品中内标的峰面积；
c添加样品中有毒生物碱的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）。
6.2.3.2.3外标-工作曲线法
在系列浓度的有毒生物碱血液质控样品中，以有毒生物碱定量离子对的峰面积（Y）为纵坐标、有
毒生物碱质量浓度（C）为横坐标进行线性回归，得线性方程。
根据待测样品中有毒生物碱定量离子对峰面积，按公式（3）计算出待测样品中有毒生物碱的质量
浓度。
………………………………（3）
Y待测样品中有毒生物碱的峰面积；
6.2.3.2.4外标-单点校正法
根据待测样品及添加样品中有毒生物碱定量离子对峰面积，按公式（4）计算出待测样品中有毒生
物碱的质量浓度。
Ac
………………………………（4）
A
c添加样品中有毒生物碱的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）。
6.2.3.3平行试验
待测样品同时平行测定两份，双样相对相差按公式（5）计算：
|C1-C2|
RD（%）=100………………………………（5）
4
RD相对相差；
C1、C2两份待测样品平行定量测定的质量浓度；
C两份待测样品平行定量测定质量浓度的平均值。
6.2.4空白试验
用空白血液进行空白试验。
7结果评价
7.1定性结果评价
7.1.1阴性结果评价
如果待测样品中仅检出内标SKF525A未检出附录A中45种有毒生物碱成分，则阴性结果可靠；
如果待
测样品中未检出内标，则阴性结果不可靠。
7.1.2阳性结果评价
如果待测样品中检出附录A中有毒生物碱成分且空白样品无干扰，则阳性结果可靠；
如果待测样品
中检出有毒生物碱成分且空白样品亦呈阳性，则阳性结果不可靠。
7.2定量结果评价
平行试验中两份检材的双样相对相差不得超过20%（腐败检材不得超过30%），结果按两份检材浓
度的平均值计算，否则需要重新测定。
8检出限和定量下限
内容见附录A
5
雪上一枝蒿甲素Bullatine2.47
344.1→58.1
344.1→235.0
344.1→58.166
54
60
氧化苦参碱Oxymatrine2.46
264.7→247.2
264.7→205.1
264.7→247.240
42
氧可酮Oxycodone2.44
316.2→298.1
316.2→241.1
316.2→298.127
36
80
延胡索乙素
Tetrahydropalmati
ne
3.63
356.4→192.3
356.4→165.3
356.4→192.335
34
药根碱Jatrorrhizine3.11
335.8→292.2
335.8→321.4
335.8→292.244
40
罂粟碱Papaverine3.62
340.1→202.2
340.1→324.3
340.1→202.237
41
原阿片碱Protopine3.03
352.1→336.1
352.1→308.2
352.1→336.141
表A.245种有毒生物碱的检出限（LOD）和定量下限（LOQ）
（单位：
ng/mL）
化合物LODLOQ化合物LODLOQ
阿托品12毛果芸香碱0.52
巴马汀0.51马钱子碱12
草乌甲素0.10.2那可汀0.10.1
茶碱2.510羟基喜树碱2550
次乌头碱0.10.1青藤碱57
蒂巴因11秋水仙碱2.510
东莨菪碱0.20.5山梗菜碱0.51
毒扁豆碱0.50.5山莨菪碱2550
二羟丙茶碱510士的宁0.20.5
粉防己碱210石杉碱甲1020
高三尖杉酯碱0.51筒箭毒碱510
后马托品12乌头碱0.10.1
槐定碱25小檗碱0.20.5
胡椒碱0.10.1新乌头碱0.10.2
加兰他敏0.51喜树碱25
8
可待因22.5雪上一枝蒿甲素12
可卡因0.10.1氧化苦参碱58
可可碱2040氧可酮12
苦参碱0.20.5延胡索乙素0.10.2
利血平0.51药根碱25
吗啡57罂粟碱0.10.2
麻黄碱0.51原阿片碱12
麦角新碱0.51
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