大鼠海马神经元钠离子通道电流的记录与分析Word格式文档下载.docx

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随着研究的深入，科学家发现细胞膜上的离子通道是在生物电的产生和传播中起着重要的作用，它是神经、肌肉、腺体等许多组织细胞膜上的基本兴奋单元，它们能产生和传导电信号，具有重要生理功能。

离子通道不仅直接与兴奋性相关，并可进一步影响和控制递质释放，腺体分泌、肌肉运动、细胞分裂、生殖、甚至对学习记忆和维持细胞体积恒定及内环境稳定起重要作用。

近年来，离子通道结构与功能的研究随着生物化学、分子生物学、药理学的不断创新以及膜生物物理学特别是膜片钳技术的新突破而有了飞速的发展【2】。

1.大鼠海马结构及膜片钳技术介绍

1.1大鼠海马结构

海马结构位于侧脑室下角底内，是种系发生上比较古老而简单的皮质部分，具有一致的组织结构，细胞分层排列，是研究中枢神经系统解剖和生理的可塑性模型。

随着种系进化，其相对体积减少，绝对体积增加，在人类达到了最高水平。

根据Isaacson（1974年）的分层法，可将海马的细胞结构分成七层，即分子层、隐窝层、辐射层、锥体细胞层、多形细胞层、海马槽和上皮细胞层。

其中，位于辐射层下面的锥体细胞层是海马的锥体细胞聚集区，分离的该区锥体细胞具有典型的中枢神经元代表性。

作为边缘系统的一个重要部分，海马与许多高级神经活动、行为反应以及植物性神经功能有重要关系，一直被视为神经科学研究的模型。

由于海马与学习、记忆关系密切，且对缺血和缺氧、癫痫、衰老、化学损害剂和有害物理辐射等许多致病因素较为敏感，近年来越来越引起研究者的广泛兴趣【3】。

图1是海马解剖结构。

图1海马解剖结构

1.2细胞膜离子通道

经过长期的研究发现，在细胞膜上存在多种类型的离子通道，主要有电压门控离子通道、配体门控离子通道以及机械门控离子通道等。

在本文中主要讨论使用膜片钳放大器测量门控离子通道的方法。

在大鼠海马组织细胞膜上存在多种门控离子通道。

电压门控钠离子通道，电压门控钾离子通道以及电压门控钙离子通道等【4】。

下面介绍这几种离子通道的特性。

1.2.1电压门控钠离子通道

电压门控钠离子通道广泛存在于神经、肌肉等可兴奋性细胞膜上，其激活可导致钠离子快速内流，使细胞去极化，产生动作电位的上升相，主要生理功能是产生可传播动作电位。

目前已克隆出至少五种类型钠通道，其中多数对钠通道选择性拮抗剂——河豚毒素（TTX）较敏感。

钠通道在维持细胞兴奋性及正常生理功能上非常重要，而且还是一些药物的作用靶点，如局部麻醉药和I类抗心律失常药，就是分别选择性地阻断神经细胞和心肌细胞的钠通道，达到阻断兴奋性传播和减少细胞兴奋性的作用。

1.2.2电压门控钾离子通道

钾离子通道是人体内分布最广、种类最多的一种离子通道。

电压门控钾离子通道对所有可兴奋细胞的功能是必需的，主要控制动作电位的形状，形成动作电位，调节动作电位的频率，调整静息膜电位，在调节神经递质释放、心率、胰岛素分泌、神经元兴奋性、上皮电解质传导、平滑肌收缩、细胞体积调节等细胞信号转导过程中起着重要作用。

电压门控钾通道按生理特征主要分为四类:

（1）延迟整流钾通道，这是一种外向整流钾通道，膜去极化时经过延迟才激活，失活非常缓慢，对TEA、Cs+、Ba+等比较敏感；

（2）瞬时外向（A型）钾通道，它的激活和失活都较迅速，对通道阻断剂4-氨基吡啶敏感；

（3）内向整流钾通道，该通道超极化时激活，去极化使通道关闭，对TEA、Cs+、Ba+敏感；

（4）钙激活钾通道，它受到电压和钙离子浓度的双重门控（后两种不做太多介绍）。

延迟整流钾通道在动作电位复极化相开放，钾离子外流而使膜电位复极化回到静息电位。

A型钾通道激活则使动作电位出现延缓，从而增加脉冲间距。

在海马神经元有两种电压门控性钾离子通道，即快速激活与失活的瞬时外向钾通道（IA）和缓慢激活几乎不失活的延迟整流钾通道（IK）。

IA是动作电位复极化早期外向电流的主要成分，主要调节静息膜的兴奋性，减慢去极化速度，延缓动作电位产生，并可使重复放电神经细胞呈现缓慢放电节律，而IK是动作电位复极化过程的主要成分，影响动作电位的频率适应性。

1.2.3电压门控钙离子通道

电压门控钙通道的结构类似钠通道，根据对不同毒素或药物的敏感性及电生理特性，已鉴定出多种类型钙通道，如L型通道，T型钙通道，N型钙通道。

应用不同毒素阻断钙电流的某种特定的成分，在神经元发现了另外三种钙通道：

P型，主要存在于小脑Purkinje细胞；

Q型，主要存在于小脑颗粒细胞；

R型，阻断其他钙通道后剩余的部分。

电压门控钙通道将膜电位去极化转换为Ca2+内流，使细胞内Ca2+浓度增加，从而促使腺体分泌、肌肉收缩和第二信使激活，还可以影响基因表达和蛋白质合成等。

钙通道是唯一将复极化过程与非电学活动联系起来的离子通道，因此钙通道起着神经元电活动与细胞内生化过程的桥梁作用。

没有钙通道，神经系统的信号与其它活动就无法输出。

在海马细胞膜中有L-型钙通道。

1.3膜片钳技术

膜片钳技术是一种通过微电极与细胞膜之间形成紧密接触的方法，采用电压钳或者电流钳技术对生物膜上离子通道的电活动（尤其是可对单通道电流）进行记录的微电极技术。

图2为膜片钳测量原理。

图2膜片钳测量原理

膜片钳技术的基本操作过程：

首先在细胞膜表面，给电极间断施加负压，这样在玻璃微电极壁与膜之间就形成了紧密接触，术语叫做高阻封接（GigaohmSeal），其电阻达109（1G）以上，以使离子不能从玻璃电极尖端与膜之间通过，只能从膜上的离子通道进出。

如果轻轻的回撤电极，细胞膜可被撕下一片，能记录着小片膜的跨膜离子电流。

如果运气好的话，这片膜上也许只有一个离子通道，可以记录单通道电流【5】。

1.3.1膜片钳技术的发展概况

离子通道微弱电流记录的核心技术是微电极技术。

英国剑桥大学的科学家Hodgkin和Huxley在20世界50年代采用微电极技术创建了动作电位的学说。

随着科学技术的发展和实验记录的要求，人们不断将微电极技术发展，进而县城了现代的膜片钳技术，可以说膜片钳技术就是现代微电极技术。

1976年德国马普生物物理化学研究所的Neher和sakmann博士在青蛙肌细胞上用双电极电压钳方法，记录到了单通道离子电流，从而诞生了膜片钳技术。

这是人类首次记录到单通道的例子电流。

但是在他们的试验中电极与细胞膜的封接电阻并不高，只有MΩ水平。

后来在1980年，Sigworth博士与Neher博士采用在电极内施加负压吸引，使封接电阻达到了GΩ水平，这就是我们常说的高阻封接，它大大降低了记录的噪声水平，使十分微小的单通道电流（＜1pA）得以分辨出来。

1983年10月Neher和sakmann主编了《single—channelrecording》一书，对当时的膜片钳技术进行了全面、系统的总结，从此奠定了膜片钳技术的里程碑【6】。

膜片钳技术从创立以来，经历了许多发展变化，记录方式、使用标本等等都发生了变化。

1.3.2膜片钳技术的基本记录模式

膜片钳技术共有四种基本记录模式，其他的记录模式都是在此基础上组建发展衍变而来的。

这四种记录模式为：

细胞贴附记录模式（cell-attachedrecording或oncellrecording）、内面向外记录模式（inside-outrecording）、外面向外记录模式（outside-outrecording）、全细胞记录

模式（whole-cellrecording）。

前面三种是单通道记录模式，其中内面向外和外面向外记录模式为游离膜片的记录模式。

将电极接触细胞膜，轻轻的给予负压吸引，就形成了细胞贴附记录模式。

将电极迅速提起，脱离细胞，因为细胞具有流动性，粘着在电极尖端的细胞膜会自动融合，从而形成一个囊泡。

当将电极提出浴液液面而短暂（2S）暴露在空气中，囊泡的外表面会破碎，再次将电极放入浴液，就形成了内面向外记录模式。

另外，如果将电极放入低钙溶液中，囊泡的外表面也会破裂，形成内面向外记录模式。

形成细胞贴附记录模式后，采用继续施加负压或者电击的方法打破细胞膜，就形成了全细胞记录模式。

在形成全细胞记录模式后，将电极缓缓提起，逐渐脱离细胞，同样由于细胞具有流动性，粘在电极尖端的细胞膜会自动融合，这样细胞膜外面就朝向电极极端外，形成外膜向外记录模式【7】。

1.3.3全细胞记录与单细胞记录的比较

从记录方法上看，全细胞记录操作复杂，而且存在串联电阻补偿、空间钳制等一系列问题，而单通道记录则不存在这些问题。

从所获数据信息来说，单通道记录可以获得单通道电导、通道开放概率、开关时间的分布特征等，这是全细胞记录所办不到的。

但是全细胞记录也有许多单通道记录所部具备的优点，其中最重要的是，单细胞记录无法获得整个细胞的功能变化信息，而全细胞记录所获信息则能反映细胞功能的改变，加之容易更换细胞外液，所以全细胞记录更适合于离子通道支、动力学的研究。

全细胞膜片钳记录提供了三种研究途径。

其一，可以测定用玻璃微电极法难以测定的小细胞的膜电位和膜离子电流，籍此可判明在细胞水平上离子通道的特性。

其二，在一定程度上可改变细胞内液成分，从而对细胞信息传递进行分析。

其三，可对细胞膜电容进行测定，从而对胞饮、胞吐等重要细胞机能进行研究。

在本实验中，采用了全细胞膜片记录的实验研究方法。

1.3.4全细胞膜片钳技术

全细胞膜片钳技术可分为电流固定模式和电压固定模式，前者是在固定电流的条件下检测与其

图4全细胞膜片钳技术示意图及其等效电路图

相应的膜电位。

例如将电流固定在零时，可检测细胞的自然应答（静息膜电位、自发性膜电位振动或自发性动作电位等）。

后者是在电位固定的基础上检测钳制电压时的膜电流。

图4为全细胞记录模式的示意图和等效电路图。

RS、Rcell、Rseal分别为串联电阻、细胞膜电阻和封接电阻，CP和Cm为快电容与慢电容。

刺激脉冲通过RS、Rcell、Rseal产生的电流，通常称为漏电流。

一般情况下RS<

<

Rcell<

Rseal，所以漏电流的主要决定因素为Rseal，实验中记录到的电流波形实际为通道电流和漏电流的迭加。

2.钠离子通道电流实验过程

2.1实验材料

动物：

Wistar大鼠，鼠龄7到10天，雌雄不限。

由山西医科大学实验动物中心提供。

试剂：

A.孵育液（ACSF）（mmol/L）：

NaCl128，KCl5，NaH2PO41.5，MgSO42，CaCl22，NaHCO325，Glucose10，HEPES10，KOH调节pH7.4。

B.全细胞电流记录液

细胞外液（mmol/L）：

NaCl130，KCl5.4，CaCl22，MgCl21，Glucose10，HEPES10，NaOH调节pH7.4。

电极内液（mmol/L）：

KCl120，MgCl21，CaCl21，HEPES10，EGTA10，KOH调节pH7.3。

C.钠电流记录液

标准细胞外液（mmol/L）：

NaCl50，KCl5.4，CaCl22，MgCl21，Glucose10，HEPES10，AchCl90，NaOH调至pH7.3。

CsCl70，CsF70，MgCl22，HEPES10，EGTA10，Na2ATP3,KOH调节pH7.2。

仪器设备：

膜片钳放大器PC2C膜片钳放大器（仪博，中国）

微电极拉制仪

微电极操作器

倒置显微镜

电子天平

PH检测仪

2.2实验过程

2.2.1溶液配制：

根据不同的记录对象选取合适的试剂和浓度配制不同的细胞外液和电极内液，从而尽量使细胞处于与体内相同的溶液环境中。

2.2.2大鼠海马神经元急性分离【3】

（1）取材和切片：

大鼠断头取脑，取出整个脑组织并快速移入冰冷（0~4℃）的孵育液中约1min，冷却后放在冰盘上沿矢状缝纵向切开左右侧大脑半球，快速剥离出双侧海马，沿海马长轴手工切成400~500μm厚的脑片，置于孵育液中，整个过程不超过3分钟。

（2）孵育：

将脑片室温下平衡孵育50min，孵育过程中连续通入95%O2+5%CO2的混合气，注意气泡大小，避免脑片翻滚，以防止神经元损伤。

（3）酶解：

将孵育后的脑片移入含有Pronase酶的消化液中，浓度为0.5mg/ml，32º

C恒温水浴中消化20min。

其间通入95%O2+5%CO2的混合气，同样要防止气泡吹到脑片。

（4）洗酶：

消化完毕后用孵育液冲洗脑片3~4次，洗净脑片表面的酶液。

（5）吹打和贴壁：

在盛有孵育液的离心管内，依次用经热抛光的口径递减的数个Pasture吸管轻轻吹打脑片，直至组织块分散，制成单细胞悬液。

竖直静置约5min，吸取上清液，加入放有盖玻片的培养皿内，约20min后细胞贴壁。

（6）脑片保存：

暂时不用的脑片置于孵育液中，并持续通95%O2+5%CO2的混合气，脑片可存活4~6h。

2.2.3电极的拉制

玻璃微电极由微电极拉制仪经两部拉制而成，拉制好的电极在测量时的入水电阻最好为2~4MΩ，这样在实验式容易封接。

2.2.4全细胞电流记录

在室温下，用PC2C膜片钳放大器进行全细胞电流的刺激，试验参数的设置和数据采集、刺激方案的施加都通过Pclamp软件来进行。

在电极与细胞膜形成高阻封接后，迅速进行快电容补偿，然后稍微给电极一个负压，进行破膜，破膜后进行慢电容和串联电阻补偿，然后选择合适的刺激方案进行刺激，测量和记录全细胞电流。

3.2.5数据分析

所采集的数据使用软件Clampfit10.2进行观察并取点，然后用Origin8进行统计分析，并作图。

2.3实验中存在的问题以及解决办法

2.3.1溶液配制

在配制溶液时要根据测量对象的不同选择合适的溶剂，配制的基本原则是保持两个平衡和一个洁净，即渗透压平衡和酸碱度平衡，所用液体在使用前必须经微孔滤膜过滤，以保持洁净。

在称完药品并定容完毕后，便可封装放入冷藏室保存，但不能长时间保存，最好是两三天。

在使用时待恢复室温后，通入95%O2+5%CO2直至饱和（一般为15分钟），然后再调节溶液的酸碱度到合适的值。

2.3.2大鼠年龄的选择

一般要选择7-12天的大乳鼠。

原因有三个：

一是幼鼠的颅骨比较软，容易取脑，；

二是幼鼠脑耐缺氧能力强；

三是幼鼠脑细胞韧性好容易形成高阻封接。

2.3.3酶解剂量和时间的选择

在试验中可以根据具体的情况选择合适的酶液的浓度和酶解的时间，已达到最好的酶解效果。

本实验中一般选择在5ml的孵育液中加入0.0015到0.0020g酶制成酶液，然后酶解25到30min。

2.3.4电极的拉制

拉制电极的玻璃管多用硬质玻璃制成（尤其是硼硅酸盐玻璃）。

硼硅酸盐玻璃的熔点较高，拉制后颈部较长，电阻较高。

但其点穴性能优越，电导率低，噪声小。

拉制微电极一般都选用两部拉制法，一般第一步温度较高，第二部温度较低。

在本实验中选择第一步拉制温度为56.5℃，第二部温度为52.5℃。

拉制出的电极入水电阻一般保持在2~4MΩ左右。

但是拉制出的电极的入水电阻会随温度和玻璃管的不同而变化，在入水电阻发生变化后可以适当调节一、二部的温度已达到合适的电阻。

2.3.5破膜问题

要形成全细胞记录必须打破细胞膜，而这往往造成封接不稳定，所以在破膜时要格外小心。

在采用负压吸引膜式，所施加负压的大小出于细胞种类、细胞膜的清洁程度、微电极的形状有关外，还与操作手法密切相关，对初学者来说要一个摸索的过程。

如果采用手抽注射器的方法不容易控制负压，可用嘴吸的办法，效果往往较好。

一些膜片钳放大器专门提供了“ZAP”功能，用于电极破膜。

2.3.6快电容补偿【8】

玻璃微电极内导体通过绝缘材料玻璃与浴液（和参考电极电气相连），形成以分布形式存在的电容，此外，探头中的电极连线对地也存在杂散的分布电容，这样的电容是瞬间被充电的，所以成为快电容。

这样情况下，分布电容充电会形成干扰电流，这将妨碍例子通道电流的正确记录，记录中必须消除。

在本套膜片钳放大系统中，可以通过适当调快电容旋钮和滞后旋钮消除大部分电容充电作用引起的影响。

2.3.7串联电阻补偿问题【8】

串联电阻式指从微电极到信号地之间电流流过时所遇到的除了膜电阻以外的任何电阻。

当将微电极放入浴液中时，串联电阻主要是电极电阻，全细胞巨鹿模式形成后，串联电阻包括电极电阻、破裂细胞膜的残余膜片电阻、细胞内部电阻。

后两者统称为接入电阻，破裂细胞膜的残余膜片电阻占接入电阻的主要成分。

在全细胞记录下，由于串联电阻的存在，软件输出的命令电压并不等于细胞的跨膜电压。

同时串联电阻还带来一些其他问题，因此必须要尽量较小串联电阻对其进行补偿。

2.3.8慢电容补偿【8】

在全细胞记录模式中，当高阻封接形成后，首先进行快电容补偿，然后在讲膜片破碎，于是细胞内部与电极实现了电气联通。

这时的双层脂质细胞膜可以看成是电容。

当刺激信号输入时，刺激电压加在玻璃微电极上，串联电阻会对细胞膜电容的充电电流形成阻力，从而减慢膜电压的钳制速度。

对于研究快速的电压门控离子通道电流来说，其产生的电流伪差信号将会完全淹没响应速度较快的例子通道电流信号。

所以在对全细胞膜片钳电流记录之前必须将其消除。

在本实验中，为了以高分辨率观察快速变化的瞬态波形，贝塞尔低通滤波器带宽最好选择在10Khz，这样才容易观察到串联电脑旋钮输出波形变化的结果。

2.3.9液接电位的校正问题

一般在进行细胞封接钳都要对液接电位进行调零，然而存在的问题是当形成全细胞记录后，细胞内液与电极内液相通，液接电位消失，而先前对液接电位调零是所给予电极尖端的电压却一直存在，如果这一电压较大，则需要惊醒纠正，此即液接电位的校正。

2.3.10细胞内容物被电极内液稀释的问题

稀释的速度取决于串联电阻的大小，串联电阻越大，稀释的速度越小，一般小于10的串联电阻，细胞内液在几分钟指内就被稀释。

形成高阻封接，若不及时车去封接是给予的负压，细胞内溶液稀释的速度更快。

细胞内液被稀释可使惜败内容物丢失，细胞功能因而发上改变，这方面典型的例子就是全细胞电力幅度随记录时间而发生的rundown现象。

2.3.11漏电流问题

在全细胞记录中，如果要该改变细胞膜电位，就会存在膜漏电流问题。

膜漏电流的存在会影响离子通道电流的记录，因此要予以去除。

3.实验结果与数据分析

3.1大鼠海马神经元形态

本实验所用细胞是从大鼠海马CA3区急性分离的神经元，按上述实验条件分离出的大鼠海马神经细胞显微镜下观察：

密度分布适均，通常呈独立存在的状态，并且具有不同的形态特征。

大多数细胞具有神经元样外观，有立体空间结构，有细胞突起，形状多为锥体形、椭圆形或圆形。

图表5急性分离的大鼠海马CA3区锥体神经元

图5为高倍显微镜下观察的新鲜分离的典型海马CA3区锥体细胞。

细胞呈锥体形或椭圆形、有较长的轴突和树突、外形饱满、表面光滑、有较强的光晕、立体感强、相差显微镜下折光度好，并且贴壁良好。

在此分离条件下分离得到的细胞用于我们的实验研究中。

分离得到的完整的海马神经元锥体细胞易于形成全细胞膜片钳记录，选择直径为10μm左右的神经元用于膜片钳记录，形状扁平或颗粒状表面的细胞不宜用于记录。

3.2全细胞跨膜总电流

使用前述的全细胞电流记录内外液，置保持电位于-80mV，给予从-70mV至+60mV的阶梯去极化脉冲电压刺激，步幅+10mV，刺激波宽160ms，刺激频率0.5Hz，可记录得到CA3区锥体神经元全细胞跨膜总电流【3】，如图6。

从图中可知，全细胞跨膜总电流既有内向电流成分，又有外向电流成分。

内向电流主要发生在刺激初期几毫秒，表现为快速激活和快速失活的特性，之后外向电流成分被激活。

3.3内向钠电流记录及特性【9】

采用钠通道的记录外液和电极内液，记录单个海马CA3区锥体神经元细胞膜上的电压门控钠离子通道电流。

由于钠通道电流属于快激活快失活的电流，因此，置钳制电位于-100mv，给予脉冲幅度从-100至+60mv，脉冲宽度20ms，步幅+10mv的去极化脉冲电压，刺激频率0.5Hz，可得到一系列快速激活与失活的内向电流，如图7。

由于在细胞外液中加入了TEA-Cl、4-AP，电极内液中有高浓度的Cs+，故钾电流可被阻断，钙电流可被外液中加入的CdCl2和内液中高浓度的F-所灭。

图表7内向钠电流

3.3.1钠电流的I-V曲线分析

在破膜形成全细胞记录模式后稳定2min，然后置钳制电位-80mV，从-70mV起给予10mV步幅递增，20ms脉宽去极化脉冲刺激至+60mV，刺激频率0.5Hz，激活并记录钠通道电流，分别在1、3、5、7、9min记录不同时间的钠电流，对4个细胞在不同测试电压下所得内向钠电流峰值取平

图表8钠电流I-V曲线

均值，以不同膜电位（去极化刺激电位）为横轴，该膜电位下激活的峰电流为纵轴，绘制不同记录时间钠电流的电流-电压（I-V）曲线，如图7。

如图可知，钠电流的峰值在3min以后达到较大的较稳定的值。

对I-V曲线进行分析可知，海马神经元钠电流的激活电位阈值为-60mV，在-30mV时达到电流峰值，在-60mV到-10mV之间电流随电压变化比较明显，在其后电流随电压的变化较小。

峰电流大小为-2339.85±

1307nA,翻转电位为54.8±

6.1mV。

3.3.2钠激活动力学

将膜电位钳制-100mV，预置-120mV超极化电压500ms，然后从-80mV起给予10mV步幅递增，

图表10钠激活动力学曲线

12ms脉宽的去极化脉冲刺激至0mV，刺激频率0.5Hz，引出一系列钠电流，然后利用公式

将钠电流峰值转换成电导值，其中G为电导、V为测试膜电位，Vrev为翻转电位，I为各膜电位下测定的钠电