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下面是文献:

植物抗病毒基因工程

植物病毒病难以防治已成为植物界的“癌症”，给全球农业生产造成巨大的损失。

有效地防治植物病毒病，减少经济损失，满足日益增长的世界人口需求。

是农业生产当务之急。

病毒分子生物学，植物基因工程的迅速发展，为筛选培育抗病、优质、丰产的新植物开辟了广阔的前景。

自1986年，全球范围内兴起了多种利用分子生物学及基因工程研究成果防治植物病毒病害的策略，并成功地培育筛选出多种抗病毒的工程植物。

1．病毒外壳蛋白介导的基因工程抗病性

外壳蛋白是形成病毒颗粒的结构蛋白，它的功能是将病毒基因组核酸包被起来，保护核酸；

与宿主互相识别，决定宿主范围；

参与病毒的长距离运输等。

1986年，美国的Beachy实验室的Powell－Abel等第一次将烟草花叶病毒外壳蛋白（TMV－Cp）基因插入修饰过的农杆菌质粒中，并置于花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子下，经农杆菌侵染而将TMV－Cp基因转入烟草，并在烟草中表达TMV－Cp，分子生物学检测表明TMV－Cp基因已整合到烟草的基因组中，并能稳定地遗传给子代，在转基因烟草中TMV－Cp表达量占叶蛋白0．1％左右。

攻毒试验表明：

转基因烟草能够抑制TMV的复制，在一定程度上降低或阻止TMV的系统侵染；

并延迟发病12～30天。

这一突破性的研究成果标志着植物抗病毒基因工程的诞生。

自此科学家继续用黄瓜花叶病毒（CMV），马铃薯病毒X和Y，大豆花叶病毒（SMV），苜蓿花叶病毒（AiMV）等病毒的外壳蛋白基因导入植物体后，均得到类似的实验结果，使转基因植物获得对该病毒的抗性。

至今世界各地科学家已在15个病毒组中的30多种病毒中，证实了由病毒外壳蛋白介导的抗病性，许多抗性工程植物相继进入大田试验。

目前认为外壳蛋白介导的抗病性是比较成熟的植物抗病毒基因工程策略，有人认为其机制是外壳蛋白在转基因植物中的积累干扰了病毒脱衣壳，从而抑制了病毒在植物体中的复制，转运与积累，但许多实验结果预示其机制的复杂性。

2．复制酶介导的抗病性

复制酶即特异性依赖于病毒RNA的RNA多聚酶。

是病毒基因组编码的自身复制不可缺少的部分，特异地合成病毒的正负链RNA。

1990年Golemboski等报道他们将TMVU1株编码的复制酶的一部分基因序列，即54kD蛋白基因转入烟草中得到的工程植株用很高浓度的TMVU1（500μg/mL）及TMVRNA（300μg/mL）接种时，均表现出很高的抗性，比一般转外壳蛋白基因的植物介导的植物抗病性高得多。

后来豌豆早枯病毒54kD的蛋白基因和CMVFnyRNA2编码的切去活性中心部位GDD（Gly－Asp－Asp）的复制酶部分基因片段转入烟草，均获得了高抗的工程植物。

此外在马铃薯病毒X和Y中也报道了同样成功的研究结果。

转入的这些基因均为切除了复制酶活性中心部位GDD核苷酸序列，大多数人认为表达的这些不稳定蛋白产物会干扰病毒复制过程中复制酶复合体的形成及其功能的行使，从而使工程植株具有抗病性。

复制酶策略很有应用前景。

3．卫星RNA介导的抗病性

卫星RNA是独立于病毒基因组之外，依赖于其辅助病毒复制的小分子RNA，是病毒分子寄生物。

我国田波实验室自1981年首次在国际上开展了利用卫星RNA防治病毒病害的研究工作，结果表明黄瓜花叶病毒（CMV）卫星RNA作为生物防治因子能有效地防治由强毒株系CMV引起的严重病害。

1986年英国Baulcombe等首次将CMVI－17N卫星RNA以双联体基因形式转入烟草，并得到抗CMV的工程植物。

此后陆续将烟草环斑病毒和CMV的卫星RNA转入烟草和番茄中并得到抗病植株。

一般认为由卫星RNA介导的抗病机制是卫星RNA与病毒RNA竞争复制酶，从而干扰病毒基因组的复制，使表达卫星RNA工程植株得到保护。

因具卫星RNA的病毒数量很少，使卫星RNA介导的抗病性的应用受到限制。

4．反义RNA和核酶策略

反义RNA对基因表达具有一定的抑制作用，尤其在细菌中，与转录起始区互补的反义RNA最为有效。

在真核生物中，与3′-末端序列互补的反义RNA有一定的抑制作用。

Baulcombe等1987年和Cuozzo等1988年分别得到烟草环斑病毒的4个基因组RNA的反义序列和CMV－Cp反义序列的转基因植株。

转基因工程株未获得对病毒的抗性或只表现微弱的抗性。

Day等1991和Lindo等1992分别在双生病毒番茄金黄叶病毒和烟草蚀纹病毒上得到转反义RNA的抗性烟草。

核酶是一种高效特异的RNA内切酶，其结构包括一个几乎完全相同的17个高度保守核苷酸序列，其中有3对碱基配对形成的茎和环结构，整个结构很象一个锤头，具自我切割的活性，锤头结构是自身切割活性的结构基础。

只要已知某一RNA的序列，就可以设计出用于不同目的核酶进行特异地切割。

因为植物病毒大多数是RNA病毒，并且许多已被测序，可以设计出特定的核酶，切割病毒RNA基因，从而破坏其生存的功能，达到抗病毒的目的。

目前由核酶介导的抗病毒策略也成功的报道。

但是也存在一定的危险性，核酶也有可能将生物体内的有用的RNA作为耙子进行切割，破坏正常细胞的生理功能。

以反义RNA和核酶介导的抗性还有待于进一步的研究。

5．复合基因策略

由外壳蛋白基因，缺损复制酶基因和卫星RNA介导的抗病性是比较成熟的研究策略。

但这些工程植株抗病性有一定的局限性，例如转基因植物只抗一种病毒或抗亲缘关系较近的病毒。

自然界中往往是几种病毒复合侵染植物。

1990年Lawson将马铃薯病毒X和Y的外壳蛋白基因串联后转入马铃薯中，使转基因马铃薯表现出对这两种病毒的抗性。

而且抗性高于转单一基因的对照植株。

6．其它抗病毒策略

封闭和干扰病毒的移动蛋白。

病毒侵染植物体后，可以移动进行系统侵染，这种移动被认为是通过病毒编码的移动蛋白与胞间联丝相互作用，打开胞间联丝通道而进行的。

封闭和干扰移动蛋白就可以限制病毒的扩散侵染。

植物抗体基因策略。

1989年，Hiatt等将分泌特异性抗体的杂交瘤中得到的抗体的重链和轻链基因片段转入烟草，在转化株中表达了抗体的重链和轻链，通过表达重链和轻链的单株杂交，其后代体内得到完整的具有免疫活性的抗体。

目前许多抗体基因在转基因植物体中得到表达，并用于防治植物病毒病。

这表明动物的免疫系统同样能够在植物体内发挥抗病毒的作用。

缺陷RNA策略。

Marsh等1991年在原生质体体系中发现缺陷型的雀麦花叶病毒RNA可以干扰野生病毒的增殖。

缺陷干扰RNA在动物病毒中普遍存在，然而植物病毒中仅存在于Tombvirus和Carmovirus两个病毒组中，能干扰辅助病毒的复制，增强或减弱辅助病毒的症状由缺陷干扰RNA介导的抗病性还在探索中。

另外植物体自身的一些抗病毒的基因也被克隆，并用于抗病毒植物基因工程中。

目前随着植物分子生物学，植物生理学，病毒分子生物学的发展以及基因工程技术的不断完善，将会出现更有效更安全的抗植物病毒的策略。

（程英豪、王继伟，生物学通报，1998年第33卷第5期，P.5）

转病毒外壳蛋白和病毒复制酶基因如何产生抗病植物

　　植物病毒病难以防治已成为植物界的“癌症”，给全球农业生产造成巨大的损失。

　　1．病毒外壳蛋白介导的基因工程抗病性

　　外壳蛋白是形成病毒颗粒的结构蛋白，它的功能是将病毒基因组核酸包被起来，保护核酸；

　　2．复制酶介导的抗病性

　　复制酶即特异性依赖于病毒RNA的RNA多聚酶。

　　3．卫星RNA介导的抗病性

　　卫星RNA是独立于病毒基因组之外，依赖于其辅助病毒复制的小分子RNA，是病毒分子寄生物。

　　4．反义RNA和核酶策略

　　反义RNA对基因表达具有一定的抑制作用，尤其在细菌中，与转录起始区互补的反义RNA最为有效。

　　核酶是一种高效特异的RNA内切酶，其结构包括一个几乎完全相同的17个高度保守核苷酸序列，其中有3对碱基配对形成的茎和环结构，整个结构很象一个锤头，具自我切割的活性，锤头结构是自身切割活性的结构基础。

　　5．复合基因策略

　　由外壳蛋白基因，缺损复制酶基因和卫星RNA介导的抗病性是比较成熟的研究策略。

　　6．其它抗病毒策略

　　封闭和干扰病毒的移动蛋白。

　　植物抗体基因策略。

　　缺陷RNA策略。

　　另外植物体自身的一些抗病毒的基因也被克隆，并用于抗病毒植物基因工程中。

　　目前随着植物分子生物学，植物生理学，病毒分子生物学的发展以及基因工程技术的不断完善，将会出现更有效更安全的抗植物病毒的策略。

抗病毒植物基因工程产生的的分子基础

　　1986年，PowellAbel等报道，通过转TBSV基因植物基因工程技术将烟草花叶病毒（TMV）外壳蛋白基因转化烟草，获得高表达外壳蛋白的转基因烟草植株。

这些转基因烟草表现出对TMV侵染的抗性。

这一工作首次证明，表达病毒外壳蛋白的转基因植物可获得基因工程保护作用，由此确立了抗病毒植物基因工程这一新领域。

自此以后，人们不断分离来源于病毒等的基因，设计并试验了许多不同的策略以研究通过植物基因工程技术获得抗病毒工程植物，为植物病毒病的防治开辟了一条崭新的途径。

　　交叉保护是植物病毒学中的一个古老的命题。

交叉保护这一现象由Mckinney等于1929年首次报道的。

所谓交叉保护是指预先感染了温和株系病毒的田间作物（如烟草、番茄、苹果等）可以防御与之亲源关系相近的强毒株系病毒的侵染。

以后在类病毒中也发现了这一现象。

八十年代初，人们曾一度利用弱毒株系来防治生产中的某些重要病毒病，并取得了一定的防效。

　　那么对植物病毒交叉保护作用而言，究竟是病毒的外壳蛋白（CoatProtein，CP）还是RNA或是两者共同提供了交叉保护的分子基础？

早在1976年Zaitlin等以TMV弱毒株系病毒为材料，研究交叉保护形成的原因。

这些弱毒株系只能产生缺损CP或根本不能合成CP，预先接种这些株系病毒的植物再接种亲源关系较近的病毒时，就能够产生交叉保护作用。

然而Sherwood和Fulton（1982）的结果表明CP是交叉保护作用的基础。

随后的实验证明由CP基因缺损的TMV株系产生的保护作用是非特异性的，因为芜菁花叶病毒的侵染也被抑制；

而CP基因正常的株系产生的保护作用只特异于亲源关系相近的病毒。

事实上，交叉保护的机制可能不止一种。

一个推测是，交叉保护作用是以病毒的外壳蛋白为基础的，很可能预先感染弱毒株系的病毒所合成的外壳蛋白阻止了强毒株系病毒（后接种）的脱衣壳，或者通过包装作用将强毒株系病毒的基因组又重新包被起来。

另外两种病毒之间存在着正义链之间的抑制作用，或者是两种病毒的复制机制中存在着相互抑制作用。

　　交叉保护实验虽获得了一些结果，但问题是在这些实验中病毒的复制不可避免。

然而，利用分子生物学和遗传转化方法，能够在整个转化植株或某些特殊的组织中表达病毒基因组的特定基因片段，以确定在没有病毒复制的情况下，这些基因是否能够提供交叉保护作用。

因此，对于这一研究目的而言，植物基因工程技术提供了一个较为理想的工具与途径。

　　Haemilton（1980）首先提出了植物基因工程的思想：

在转基因植物中表达病毒基因组序列可能是一种防御病毒侵染的途径。

在DeZoeten和Fulton（1975）以及Sherwood和Fulton（1982）提出的交叉保护机制的基础上，Sequeria于1984年提出，将CP基因转入到植物体内表达可能会产生保护作用。

随后，Beachy于1985年讨论了利用病毒反义序列获得保护作用的可能性。

Sanford和Jhonston同年提出了如下设想：

具交叉保护作用的病毒的复制酶可能结合到后感染的强毒病毒RNA中的“复制酶结合位点”（Replicateattachmentsite），但无复制酶活性，从而阻止了强毒株系病毒复制酶的结合。

从上述所提到的设想来看，其理论基础都离不开病毒的交叉保护现象及其作用机制的研究结果这一大背景。

抗病毒植物基因工程的策略

　　1986年以来，研究者们纷纷利用病毒的基因来培育抗病毒的转基因植物。

除CP基因外，主要是将病毒的各种非结构蛋白基因转入植物体内，这些基因包括病毒复制酶、移动蛋白基因、蛋白酶基因、RNA的结合蛋白（RNA-bindingprotein）基因等。

这些基因的转化植物表现出对同种病毒或相近病毒或病毒RNA侵染的高水平抗性。

此外，还有其它一些策略也被采用，如致弱卫星RNA、缺损干扰病毒序列（Defectiveinterferingsequence，DI）、病毒缺损蛋白酶、抗病毒的核酶（Ribozymes）、反义RNA或抗体基因等。

　　在我国，中国科学院微生物所的科研人员率先将病毒的CP基因转入植物，获得了能够稳定遗传的抗病毒烟草、马铃薯、线辣椒、大豆、番木瓜、西瓜等一批转基因植物。

其中同时表达TMVCP基因和黄瓜花叶病毒CP基因的转基因烟草对TMV和黄瓜花叶病毒表现很高的抗性，田间试验发现转基因烟草的抗病性能够稳定遗传，并于1993年荣获中国科学院科技进步一等奖。

转马铃薯Y病毒CP基因的马铃薯在云南表现出抗病和增产的效果。

转黄瓜花叶病毒CP基因的线辣椒经过多年的田间试验，筛选出抗性高、抗性稳定、品质佳的第六代转基因线辣椒。

转马铃薯Y病毒复制酶基因的烟草后代在辽宁烟草病毒病的高发区，表现出

高度抗性。

进一步研究发现马铃薯Y病毒复制酶基因在转录水平上介导相对广谱抗病性。

此

外，利用核酶技术，培育了抗类病毒的转基因马铃薯。