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分别称取蛋白胨和NaCl溶于热水中，调pH至7.4，再加入溴麝香草酚蓝（先用少量95%乙醇溶解后，再加水配成1%水溶液），加入糖类，分装试管，装量4～5cm高，并倒放入一杜氏小管（管口向下，管内充满培养液）。

115℃湿热灭菌20min。

灭菌时注意适当延长煮沸时间，尽量把冷空气排尽以使杜氏小管内不残存气泡。

常用的糖类，如葡萄糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖等（后两种糖的用量常加大为1.5%）。

11.RCM培养基（强化梭菌培养基）（用于厌氧菌培养）酵母膏3g，牛肉膏l0g，蛋白胨10g，可溶性淀粉lg，葡萄糖5g,半胱氨酸盐酸盐0.5g，NaCl3g，NaAc3g,水l000mL,pH8.5，刃天青3mg/L,l2l℃湿热灭菌30min。

12.TYA培养基（用于厌氧菌培养）葡萄糖40g，牛肉膏2g，酵母膏2g，胰蛋白胨（bacto-typetone）6g，醋酸铵3g,KH2PO40.5g，MgSO4·

7H2O0.2g，FeSO4·

7H2O0.01g，水1000mL,pH6.5,121℃湿热灭菌30min。

13．玉米醪培养基（用于厌氧菌培养）玉米粉65g，自来水1000mL，混匀，煮10min成糊状，自然pH,121℃湿热灭菌30min。

14．中性红培养基（用于厌氧菌培养）葡萄糖40g，胰蛋白胨6g，酵母膏2g，牛肉膏

2g，醋酸铵3g，KH2PO45g，中性红0.2g,MgSO4·

7H2O0.01g,水1000ml,pH6.2,121℃湿热灭菌30min。

15．CaCO3明胶麦芽汁培养基（用于厌氧菌培养）麦芽汁（6波美）1000mL，水1000mL，CaCO310g,明胶10g，pH6.8,121℃湿热灭菌30min。

16．BCG牛乳培养基（用于乳酸发酵）（A）溶液：

脱脂乳粉100g，水500mL，加入1.6%溴甲酚绿（B.C.G）乙醇溶液1mL，80℃灭菌20min。

（B）溶液：

酵母膏10g，水500mL，琼脂20g,pH6.8,121℃湿热灭菌20min。

以无菌操作趁热将（A）、（B）溶液混合均匀后倒平板。

17．乳酸菌培养基（用于乳酸发酵）牛肉膏5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，乳糖5g,NaCl5g，水1000mL,pH6.8,121℃湿热灭菌20min。

18．酒精发酵培养基（用于酒精发酵）蔗糖10g,MgSO4·

7H2O0.5g,NH4NO30.5g,20%豆芽汁2mL,KH2PO40.5g，水100mL，自然pH。

氯化三苯基四氮唑盐酸盐（TTC）培养基上层：

TTC0.5g／L，葡萄糖5g／L，琼脂l5g／L。

下层：

葡萄糖15L，木糖5L，蛋白胨20g／L，酵母膏10L，琼脂20L，pH值6.0-6.5。

全糖发酵培养基：

葡萄糖60L，粗木糖40g／L，酵母浸膏3g／L，蛋白胨5g／L，尿素0.2g／L，磷酸氢二铵0.1g／L，pH值5.0，300mL三角瓶，每瓶分装60mL。

19.柯索夫培养基（用于钩端螺旋体培养）优质蛋白胨0.4g,NaCl0.7g,KCl0.02g,NaHCO30.01g，CaCl0.02g,KH2PO40.09g,NaH2PO40.48g,蒸馏水500mL，无菌兔血清40mL。

制法：

除兔血清外的其余各成分混合，加热溶解，调pH至7.2,121℃湿热灭菌20min，待冷却后，加入无菌兔血清，制成8%血清溶液，然后分装试管（5～10mL/管）,56℃水浴灭活lh后备用。

20．豆芽汁培养基黄豆芽500g，加水1000mL，煮沸lh，过滤后补足水分，121℃湿热灭菌后存放备用，此即为50%的豆芽汁，

用于细菌培养：

10%豆芽汁200mL，葡萄糖（或蔗糖）50g，水800mL,pH7.2～7.4。

用于霉菌或酵母菌培养：

10%豆芽汁200mL，糖50g，水800mL，自然pH。

霉菌用蔗糖，酵母菌用葡萄糖。

21．LB（Luria—Bertani）培养基（细菌培养，常在分子生物学中应用）双蒸馏水950mL，胰蛋白胨l0g,NaCll0g，酵母提取物（bacto-yeastextract）5g，用lmol/LNaOH（约lmL）调节pH值至7.0，加双蒸馏水至总体积为1L，121℃湿热灭菌30min。

含氨苄青霉素LB培养基:

待LB培养基灭菌后冷至50℃左右加入抗生素，至终浓度为80～100mg/L。

22．复红亚硫酸钠培养基（远藤氏培养基）（用于水体中大肠菌群测定）蛋白胨10g，牛肉浸膏5g，酵母浸膏5g，琼脂20g，乳糖10g,K2HPO40.5g，无水亚硫酸钠5g,5%碱性复红乙醇溶液20mL，蒸馏水1000mL。

制作过程：

先将蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏和琼脂加入到900mL水中，加热溶解，再加入K2PO4，溶解后补充水至l000mL，调pH至7.2～7.4。

随后加入乳糖，混匀溶解后，于115℃湿热灭菌20min。

再称取亚硫酸钠至一无菌空试管中，用少许无菌水使其溶解，在水浴中煮沸10min后，立即滴加于20mL5%碱性复红乙醇溶液中，直至深红色转变为淡粉红色为止。

将此混合液全部加入到上述已灭菌的并仍保持融化状态的培养基中，混匀后立即倒平板，待凝固后存放冰箱备用，若颜色由淡红变为深红，则不能再用。

23．乳糖蛋白胨半固体培养基（用于水体中大肠菌群测定）蛋白胨10g，牛肉浸膏5g，酵母膏5g，乳糖10g，琼脂5g，蒸馏水1000mL，pH7.2～7.4，分装试管（l0mL/管）,115℃湿热灭菌20min。

24．乳糖蛋白胨培养液（用于多管发酵法检测水体中大肠菌群）蛋白胨10g，牛肉膏3g，乳糖5g，NaCl5g，蒸馏水l000mL，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液lmL。

调pH至7.2，分装试管（l0mL/管），并放入倒置杜氏小管，l15℃湿热灭菌20min。

25．三倍浓乳糖蛋白胨培养液（用于水体中大肠菌群测定）将乳糖蛋白胨培养液中各营养成分以扩大3倍加入到l000mL水中，制法同上，分装于放有倒置杜氏小管的试管中，每管5mL，1l5℃湿热灭菌20min。

26．伊红美蓝培养基（EMB培养基）（用于水体中大肠菌群测定和细菌转导）蛋白胨l0g,乳糖10g,K2HPO42g，琼脂25g,2%/伊红Y（曙红）水溶液20mL,0.5%美蓝（亚甲蓝）水溶液l3mL，pH7.4。

先将蛋白胨、乳糖、K2HPO4和琼脂混匀，加热溶解后，调pH至7.4,1l5℃湿热灭菌20min，然后加入已分别灭菌的伊红液和美蓝液，充分混匀，防止产生气泡。

待培养基冷却到50℃左右倒平皿。

如培养基太热会产生过多的凝集水，可在平板凝固后倒置存于冰箱备用。

在细菌转导实验中用半乳糖代替乳糖，其余成分不变。

27．加倍肉汤培养基（用于细菌转导）牛肉膏6g，蛋白胨20g,NaCL10g，水1000mL,pH7.4～7.6。

28．半固体素琼脂（用于细菌转导）琼脂1g，水100mL,121℃湿热灭菌30min。

29．豆饼斜面培养基（用于产蛋白酶霉菌菌株筛选）：

豆饼100g加水5～6倍，煮出滤汁100mL，汁内加入KH2PO40.1%,MgSO40.05%,（NH4）2SO40.05%，可溶性淀粉2%,pH6，琼脂2%～2.5%。

30．酪素培养基（用于蛋白酶菌株筛选）分别配制A液和B液。

A液：

称取Na2HPO4·

7H2O1.07g。

干酪素4g，加适量蒸馏水，并加热溶解。

B液：

称取KH2PO40.36g，加水溶解。

A、B液混合后，加入酪素水解液0.3mL,加琼脂20g，最后用蒸馏水定容至1000mL。

酪素水解液的配制：

1g酪蛋白溶于碱性缓冲液中，加入1%的枯草芽孢杆菌蛋白酶25mL加水至100mL,30℃水解lh。

用于配制培养基时，其用量为1000mL培养基中加入100mL以上水解液。

31．细菌基本培养基（用于筛选营养缺陷型）Na2HPO4·

7H2O1g，MgSO4·

7H2O0.2g,葡萄糖5g,NaCl5g,K2HPO4lg，水l000mL,pH7.0,1l5℃湿热灭菌30min。

32.YEPD培养基（用于酵母原生质体融合）酵母粉10g,蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL,pH6.0，115℃湿热灭菌20min。

33.YEPD高渗培养基（用于酵母原生质体融合）在YEPD培养基中加入0.6mol/L的NaCL,3%琼脂。

34.YNB基本培养基（用于酵母原生质体融合）0.67%酵母氮碱基（YNB,不含氨基酸，Difco）,2%葡萄糖，3%琼脂，pH6.2。

另一配方为：

葡萄糖10g（NH4）2SO41g，K2HPO40.125g，KHPO40.875g,KI0.0001g，MgSO4·

7H2O0.5g,CaCl2·

2H2O0.lg,NaCl0.1g，维量元素母液lmL,维生素母液lmL（母液均按常规配制），水1000mL,pH5.8～6.0。

35.YNB高渗基本培养基（用于原生质体融合）在YNB基本培养基中加入0.6mol/LNaCl。

36．酚红半固体柱状培养基（用于检查氧与菌生长的关系）蛋白胨1g，葡萄糖10g,玉米浆10g，琼脂7g,水1000mL，pH7.2。

在调好pH后，加入1.6%酚红溶液数滴，至培养基变为深红色，分装于大试管中，装量约为试管高度的1/2，1l5℃灭菌20min。

细菌在此培养基中利用葡萄糖生长产酸，使酚红从红色变成黄色，在不同部位生长的细菌，可使培养基的相应部位颜色改变。

但注意培养时间太长，酸可扩散以致不能正确判断结果。

以上各种培养基均可配制成固体或半固体状态，只需改变琼脂用量即可，前者为1.5%～2.0%，后者为0.3%～0.8%。

37.酵母菌富集培养基

葡萄糖5%尿素0.1%硫化铵0.1%磷酸二氢钾0.25%磷酸氢二钠0.05%七水合硫酸镁0.1%七水合硫酸铁0.01%，酵母膏0.05%，孟加拉红0.003%pH4.5

TTC培养基：

TTC下层培养基：

葡萄糖10.1g，蛋白胨2.0g，酵母浸膏1.5g，酸性磷酸钾1.0g，硫酸镁0.4g，柠檬酸0.27g，琼脂30.0Gg。

TTC上层培养基：

TTCF0.05g，葡萄糖0.5g，琼

脂1.5g。

富集培养基为酵母增殖培养基（液体和固体）：

葡萄糖5g，KH2PO42.5g，Na2HPO40.5g，（NH4）2SO41g，尿素lg，MgSO4·

7H200.5g，酵母膏0.5g，FeSO40.1g，孟加拉红（1％水溶液）3.3mL，水定容至1000mL。

若配制液体培养基，将其pH调至4.5；

若配制固体培养基，则加琼脂15g，然后调pH至5．5～6。

在ll2℃下灭菌30min。

分离培养基：

含10％（V／v）酒精的麦芽汁（10。

Bix）。

TTC上层培养基:

葡萄糖0.5%、琼脂1.5%，115℃灭菌30min，冷却至60℃左右在无菌条件下加入0.05%的TTC染色剂溶解混匀后倒入平板

葡萄糖0.5g，琼脂1.5g，加水至100ml，115℃灭菌20min，待冷却至55℃左右时，加入TTC0.05g。

38.酿酒酵母产孢子培养基（醋酸钠培养基）：

麦氏（McCLary）培养基（醋酸钠培养基）葡萄糖0.1g,KCl0.18g，酵母膏0.25g，醋酸钠0.82g,琼脂l.5g，蒸馏水l00mL。

TTC0．059、葡萄糖59、琼脂粉l59水1000ml；

葡萄糖IOg、蛋白胨29、酵母膏1．59、KH。

PO。

1．Og、MgSO。

0．49、琼脂粉309、蒸馏水i000ml，pH5．5～5．7。

TTC下层培养基的平皿中，其中一个作为显色用；

另一．个作为对照挑选对应显色较深的菌落。

在两个平皿上38℃培养3d后，将预先配制好的TTC上层培养基冷却到45℃左右，慢慢倒入需要显色的平皿中，将茵落覆盖，移至暗处38℃显色2～3h后，迅速比较菌落颜色深浅，选出色较深的菌落，从对应的平皿上挑出相应的菌落影印到下一级平板上，重复方式做三级平板初筛，最终挑出的酵母斜面保存。

39.模拟发酵培养基：

葡萄糖200g／L，酵母粉0.5％，蛋白胨l％，蒸馏水配制，pH3.0。

实验室培养基

斜面培养基:

葡葡萄2%，酵母膏1%，蛋白胨1%，琼脂1.5%

种子培养基：

葡萄糖5%，酵母膏0.85%，氯化铵0.13%，硫酸镁0.01%，氯化钙0.006%

2．2．4．2二级筛选

将初筛出的酵母菌分别接入带有杜氏小管的不同的完全培养基中，在38℃下培养，在12h、24h、48h观察杜氏管中产气情况。

挑选出产气高的菌株作为复筛用。

2．2．4．3发酵摇瓶复筛

将二级筛选出的菌株活化后，在完全培养基中培养22～24小时，使菌

浓度达到约108个／ml。

按10％的接种量接入经液化、糖化的玉米粉发酵液

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显色结果要以菌落中心浅色面积为准，因为边缘一圈

颜色均较深，不易区别（这可能是由于边缘营养丰富，生长旺盛

的缘故）；

中心面积颜色深浅相差4i大时，则以菌落面积除以中

心浅色面积值大者为佳，即耿浅色两积相对小者：

以M表示r}

红四氮唑（Redtetrazoline，RT）

别名：

氯代三苯基四氮唑（triphenyltetrazoliumchloride，TTC）、2.3.5-三苯基氯化四氮唑、四氮唑红、红四唑、氯化-2,3,5-三苯基四氮唑、TetrazoliumRed、TPTZ、TTZ等。

分子式：

C19H15ClN4

分子量：

334.80

性状：

淡黄色晶体

是脂溶性光敏感复合物，1894年首次合成用来检测种子的生存能力，1958年开始用来染色检测哺乳动物组织的缺血梗塞。

它是呼吸链中吡啶—核苷结构酶系统的质子受体，与正常组织中的琥珀酸脱氢酶反应而呈红色。

用途：

一、在计数琼脂中加入适量的TTC（0.5%TTC1ML加到100ML琼脂中）,细菌菌落长成红颜色,对去除食品本底颗粒物干扰非常有意义.

二、在药物分析中——四氮唑盐比色法。

中国药典采用氯化三苯四氮唑法。

例如醋酸泼尼松龙软膏的含量测定。

三、脱氢酶活性测定。

TTC是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲臢（TPF），TPF比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体。

植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。

所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。

四、鉴定种子生命力。

应用TTC的水溶液浸泡种子，使之渗入种胚的细胞内，如果种胚具有生命力，其中的脱氢酶就可以将TTC作为受氢体使之还原成为三苯甲月替而呈红色，如果种胚死亡便不能染色，种胚生命力衰退或部分丧失生活力则染色较浅或局部被染色，因此，可以根据种胚染色的部位或染色的深浅程度来鉴定种子的生命力。

四氮唑盐的种类：

①红四氮唑（RT），即TTC，其还原产物为不溶于水的深红色三苯甲臢，λmax在480~490nm；

②蓝四氮唑（BT），即3，3‘-二甲氧苯基-双-4，4’-（3，5-二苯基）氯化四氮唑，其原产物为暗蓝色的双甲臢，λmax在525nm左右。

反应原理：

皮质激素C17-α-醇酮基（-CO-CH2OH）具有还原性，在强碱性试液中能将四氮唑盐定量地还原为有色甲臢。

生成颜色随所用试剂和条件的不同而定，多为红色或蓝色。

红四氮唑有毒成液体后保质期为一个月

生产燃料酒精的高浓度酒精发酵技术被定义为每升发酵醪含300g以上可溶性固形物。

一般来讲，

糖含量超过20％（w／v）时，工业生产不会使用，因为酒精含量的增加抑制了酵母的生长，并使发酵停止。

当糖化醪的糖含量高于16％（w／v）时，添加营养物质尤其重要。

用浓醪发酵时，菌株对温度很敏感，当温度较低时，酵母的发酵能力随温度的升高而升

高，发酵产生酒精的速度加快，但温度过高时，酵母发酵酶系代谢活力呈现钝化．发酵产生酒精速度减慢。

使用耐高温酵母菌株在较低温度来发酵，可提高酒精的产量。

富集培养基为麦芽汁。

生理盐水：

0．9％的NaCl溶液

亚甲基蓝染色液口引：

19亚甲基蓝溶于30ml、95％（v／v）乙醇中，加蒸馏水定容至100ml。

取一支ZX-19活化后菌株，用无菌水制成菌悬液，然后以相同接种量接入15瓶预先配制的装液量为50ml基础培养基中，30。

C、180rpm摇床培养，每2h取下一瓶稀释25倍测定0D值。

以培养时间为横坐标，0D值为纵坐标，绘出生长曲线，同时确定酵母细胞的对数生长期。

DE值--样品葡萄糖当量值（样品中还原糖占干物质的百分数），％

酵母细胞的大小测定例如；

①在物镜为40倍，目镜为15倍的显微镜上：

目镜测微尺50格=镜台测微

尺13格：

目镜测微尺每格实际长度为2．6um。

②在基础培养基中，30。

C培养24h后，酵母菌长=目镜测微尺4格=10．4姗；

酵母菌宽度=目镜测微尺2．5格=6．5um。

酵母种子的细胞计数和出芽率计算

取种子液稀释25倍，用血球计数板计数。

例如；

酵母种子的细胞存活率

取上述种子液稀释25倍，滴加少量亚甲基蓝溶液，然后用血球计数板计数，

计算细胞存活率。

TTC初筛

TTC，即氯化三苯基氮唑盐酸盐（TTC是由四醋酸铅氧化乙醇而来），无色化合物，它可以接受脱氢酶的氢，将其还原成红色化合物，而且这种化合物不再被氧气所氧化，所以试验不必在无氧或者密闭的条件下进行。

脱氢酶的多少或有无，直接影响红色的深浅或有无。

酒精酵母在给予充足葡萄糖时，发酵比较彻底，这时它的脱氢酶的多少和酒精产率存在正比关系。

产酒精度越高的菌株，脱氢酶一般越多，TTC接受氢也就越多，红色越深；

反之越浅。

所以TTC平皿可以用于淘汰产酒精度较低的菌株。

对经过热冲击处理的酵母单菌落221个进行TTC二级筛选，最终获得6支颜色较深的菌落，TTC二级筛选结果见表3—4。

摇瓶复筛

对TTC初筛获得的6株菌株进行活化，接种于基础培养基中摇瓶培养24h后，移种于复筛培养基中，32。

C、180rpm往复式摇床上摇瓶培养60h，同时以Zx一19作为对照，培养结果见表3-5。

ZX．19．5的遗传稳定性

首先对菌株zX-19—5连续传代10次，然后分别接入带有杜氏小管的复筛培

养基中，在32"

（2下培养，60h时观察杜氏管中产气情况。

lO代菌株产C02质量情况。

酵母菌在厌氧条件下发酵己糖生成酒精，其生化途径主要由两个阶段组成。

第一个阶段为己糖通过糖酵解途径（EMP途径）分解生成丙酮酸。

第二个途径丙酮酸由脱羧酶催化形成乙醛和二氧化碳，乙醛进一步被还原生成乙醇。

葡萄糖发酵生成乙醇的总反应简式为：

C6H1206__+2C2H50H+2C02十能量

就理论而言，酿酒酵母行酒精发酵，每消耗lmol葡萄糖可产生2mol乙醇，即180克葡萄糖产生92克乙醇，理论得率为51．11％。

可在生产实际中，远未达到此得率。

原因是酵母发酵过程中除主要生成乙醇外，还生成少量的其他副产物，包括甘油、有机酸（乙酸、乳酸、琥珀酸等）、杂醇油（高级醇）、醛类等，大约有4-10％的碳源将被用于形成副产物，加之工艺条件与其他环境因素的影响，实际可发酵性糖的利用率更低。

我国目前工业规模的酒精生产因不同地区、企业、所用原料与酵母种类、工艺条件等方面的差异，糖醇转化率一般在85-90％之间．

将来源于不同亲本的a型单倍体和a单倍体菌株进行杂交试验，基本培养基平扳培养。

在基本培养基平板培养过程中，二倍体的生长速度比单倍体的生长速度快，所以杂交菌株的单菌落会最早出现且较大，选取这样的菌落来进行检测。

酿酒酵母子囊孢子的形成有两个条件：

一、其营养环境中较缺乏氮源和可发酵性碳源；

二、菌株是二倍体。

第一个条件与培养基的成分及培养条件是相关的，产孢自口培养于营养丰富的完全培养基中，然后过渡到含醋酸盐为碳源的贫乏培养基中生长的酵母细胞可获得高水平的产孢率。

葡萄糖为孢子形成提供碳源骨架和其他前体物质，同时也提供细胞进行减数分裂的能源，但葡萄糖浓度过高会抑制孢子形成，大大降低孢子的形成