枳实提取物中类黄酮的高效液相色谱法测定及其抗氧化作用研究资料下载.pdf

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结论HPLC测定法简便、准确，可用于测定枳实类黄酮含量，同时枳实提取物具有较强的自由基清除作用。

关键词：

枳实；

类黄酮；

高效液相色谱法；

抗氧化作用中图分类号：

R2842；

R2855文献标识码：

A文章编号：

1008-0805（2009）01_（）207-I）2DeterminationofFlavoniodsinCitrusaurantiumLExtractbyHPLCanditsAntioxidantActivityJIAOshirong一，HUANGChengyu（1SchoolofBioengineeringofXihuaUniversity，Chengdu610039，China2SchoolofHuaxiPublicHealth，SichuanUniversity，Chengdu610041，China）Abstract：

ObjectiveToestablishanHPLCmethodfordeterminationofnaringin，hesperidin，neohesperidin，rutinandquercetininCitrusaurantiumLandtostudyantioxidantactivityMethodsThesampleswereextractedwithethano1Thechromatographicconditionswereasfollows：

PhenomenexGeminiC18column（150mmx46mm，51xm），columntemperatureat37，mobilephaseofacetonitrilephosphatesolution，detectionwavelengthat280nmor365nm，flowrate1OmlminInaddition，DPPHradicalscavengingwasemployedtomeasureantioxidantactivitiesResultsThecalibrationcurveswerelinearintherangeof114357171xgfornaringin00920459txgforhesperidin，11795895ixgforneohesperidin，00240118txgforrutinand00790395gforquercetinTheaveragerecoveriesofnaringin，hesperidin，neohesperidinwere99604，100150and100249respectivelyRSDwere05154390and0774respectivelyTheDPPHradicalscavengingactivityofCaurantiumLflavoniodswas176timesofnaringinConclusionThemethodissimple，accuratefordetectingflavoniodsinCaurantiumL，andtheCaurantiumLKeywords：

CitrusaurantiumL；

Flavoniods；

extracthasantioxidantactivitiesHighperformanceliquidchromatography；

Antioxidantactivity枳实为芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL及其栽培变种或甜橙CitrussineusisOsbeck的干燥幼果，具有破气除痞、化痰消积的功效，是中医临床常用药物。

关于测定枳实类黄酮的HPLC法大部分报道是测定柚皮苷、橙皮苷，而对于新橙皮苷、芦丁、槲皮素的测定，少有报道，同时对于枳实类黄酮的抗氧化作用未见报道。

本研究采用HPLC测定枳实中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、芦丁、槲皮素的含量，同时测定了枳实类黄酮对DPPH自由基的清除作用，为枳实药用的深入研究提供基础。

1材料、试剂与仪器枳实购买自成都荷花池中药材市场（经鉴定为酸橙幼果CitnaurantiumL）；

芦丁（生物制品检定所，批号100080200306）、柚皮苷、新橙皮苷（sigma）；

槲皮素、橙皮苷（Fluka）；

2，2一二苯代苦味酰基（2，2一diphenyl一2一picrylhydrazyl，DPPH）（sigma）。

乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

WatersHPLC（waters515pump，water2487uV），752PC型紫外可见分光光度计。

2方法21枳实提取方法枳实提取物（CaurantiumLethanolextract，收稿日期：

200711-20；

修订日期：

20081030基金项目：

四川省教育厅自然重点项目资助（No07ZA117）作者简介：

焦士蓉（1968），女（汉族），安徽安庆人，现任西华大学生物工程学院副教授，硕士学位，主要从事食品营养与卫生研究工作CEE）：

枳实粉碎，以70乙醇，料液比1：

30，温度80，回流提取3次，2h次，合并滤液，60C真空浓缩，冷冻干燥，得浅棕色粉末。

22枳实内黄酮的测定（I-IPLC法，芦丁、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、槲皮素为对照）色谱条件：

PhenomenexGeminiC。

（150mmx46mm，5Ixm），柱温37，流动相A：

100乙腈，B：

0075磷酸溶液，梯度洗脱：

015min，A（1520）；

1520min，A（20一80）；

2023min，A（80100）；

2324min，A（10015）；

2430min，A（15）。

流速10mlmin，检测波长分别是280，365nm，进样量lOlxl。

23DPPH的清除作用准确称取2，2一二苯代苦味酰基标准品20mg，无水乙醇溶解定容至500ml，得浓度为004mgml溶液。

取此溶液3ml，加入不同浓度的试样溶液1ml，室温，3Omin，测定吸光度值A，空白组以1ml无水乙醇代替试样，并按下式计算清除率：

DPPH清除率（）：

（1一A试羊A自）1003结果31线性关系的确定分别精密称取柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、芦丁及槲皮素对照品142920，147375，11466，2962，9880mg以甲醇：

二甲亚砜（1：

1）溶解并定容至50ml，得对照品储备液。

并将溶液稀释5倍后，分别以5，75，10jxl进样；

将溶液稀释125倍后，分别以5，75，10txl进样，柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷在280nm，芦丁及槲皮素在365nm处测定。

记录色谱图，见图1一207时珍国医国药2009年第20卷第1期LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL20NO12。

以峰面积为纵坐标（y），绝对进样量（gm1）为横坐标（）作图，见图3，结果见表1。

表15种对照品的标准曲线002040600100120140160180200220240260280300tfmin图1柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照色谱图nO2406080100120141）1180加D221）240260281）300tfmi13图2芦丁、槲皮素对照色谱图图3柚皮苷标准曲线32回收率实验精密称取15375mg的枳实提取物，以甲醇：

1）溶解并定容至25ml，得样品储备液。

将3份1ml的样品储备液分别与1，09，08ml对照品储备液混合并定容至10ml，计算柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷回收率。

结果见表2。

表2回收率结果（4-s）样品回收率柚皮苷橙皮苷新橙皮苷9960408801001500671l00249075933重复性实验精密称取6份枳实提取物，样品以甲醇：

二甲亚砜（1：

1）溶解并定容至50ml，得样品储备液。

测得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均含量为20940，1126，18936。

RSD分别为0515，4390，0774。

砜（1：

1）溶解并定容至50ml，得样品储备液。

测得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、芦丁和槲皮素的平均含量分别为（209400108），（11260049），（189360147），（00240005），（00480018）。

见图34。

00201O60oi01）位D14016018020022D240260280300tmjn图4枳实提取物色谱图（280nm】oo20406080lOODMD1601802。

D221）240260280300fmin图5枳实提取物色谱图（365nm）35枳实提取物对DPPH清除作用结果见表3。

从表3可见，芦丁、槲皮素、柚皮苷、枳实提取物具有DPPH清除作用，并呈线性关系。

他们的线性关系分别为：

Y=一00264X2+30831X一10688，R=09949；

y=54533X+59653，=09797；

Y=00049X+33114，R=09995；

Y=00752X+93899，R=09897。

半抑制浓度DC50分别为19984，8075，9528286，540028gm1。

枳实提取物对DPPH的清除作用低于芦丁和槲皮素，但高于柚皮苷，是柚皮苷清除作用的176倍，具有较强的抗氧化作用。

表3枳实提取物与对照品对DPPH清除作用（s）34样品测定精密称取6份枳实提取物，样品以甲醇：

二甲亚n=3208蛎如0O0000O0O0O042O864202l11OO00O00OOOOO0OO0O0OO00O0I1=i#蓐0=白避鼗i350；

443322l1OOOOO00000O0f1LLISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL20NO1时珍国医国药2009年第2O卷第1期4讨论柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷是枳实中主要黄酮苷类化合物，具有相同的共轭体系，紫外扫描在280nm处有最大吸收峰。

芦丁、槲皮素具有相同的共轭体系，检测波长在365nm。

通过HPLC测定，枳实提取物中含有较高的柚皮苷、新橙皮苷，同时也含有橙皮苷、少量芦丁和槲皮素。

关于类黄酮的抗氧化活性，取决于类黄酮的化学结构，B环上有邻二羟基及C环上具有双键，其抗氧化活性高j，芦丁与槲皮素具有以上结构，而柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷没有以上结构，因此芦丁与槲皮素的抗氧化活性高于柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷。

同时槲皮素C环上具有3一OH，而芦丁的3一OH被糖苷取代，因此槲皮素的抗氧化性强于芦丁。

通过对DPPH清除作用也证实了抗氧化性的顺序为槲皮素芦丁柚皮苷，本研究表明枳实提取物中是多种类黄酮混合物，而多种类黄酮的混合具有相当强的协同效应，这可能是其抗氧化活性高于柚皮苷的原因。

参考文献：

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912梁远园，冯彪，祝晨辣HPLC法测定枳实药材中橙皮苷与柚皮苷的含量J中药新药与临床药理，2006，17（5）：

3593李秀玲，李龙，肖红斌反相高效液相色谱法测定枳实、枳壳中橙皮甙和柚皮甙含量J色谱，2002，20（6）：

5854FSharififar，MHMoshafi，SHMansouri，eta1InvitrovaluationofantibacterialandantioxidantactivitiesoftheessentialoilandethanolextractofendemicZatafiamuhifloraBoisslJ1FoodContml，2007，18：

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4666DanilaDM，MarcoG，MaufizioLG，eta1FlavanonesinCitrusfruit：

StructureantioxidantactivityrelationshipsJIFoodResearchInternationa12005，38（10）：

1161验方祛斑汤对A375人黑素瘤细胞黑素合成的影响刘邦民一，张涓，陶春蓉，苏咏梅，艾儒棣（1成都中医药大学，四川成都610075；

2陕西中医学院，陕西咸阳712046；

3重庆医科大学，重庆400050）摘要：

目的研究验方祛斑汤对A375人黑素瘤细胞株细胞增殖、酪氨酸酶活性和黑素合成的影响，探讨验方治疗黄褐斑的作用机制。

方法四甲基偶氮唑蓝法（MTT）测定验方对细胞增殖的影响，用酶学方法测定对酪氨酸酶活性的影响，475nm比色法测定验方对黑素含量的影响。

结果验方祛斑汤对体外培养的A375人黑素瘤细胞具有抑制细胞增殖，降低酪氨酸酶活性和黑素含量作用。

结论该方能抑制黑素细胞黑素合成，这可能是其治疗黄褐斑的作用机制之一。

验方祛斑汤；

人黑素瘤细胞；

黑素合成；

黄褐斑中图分类号：

1008-0805（2009）01-0209-02EffectsofProvedRecipeQubanSouponMelanogenesisinA375HumanMelanomaLIUBangmin，ZHANGJuan，TAOChun-rong。

，SUYongmei，AIRudi（1ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine，Chengdu610075，China2ShaanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Xianyang712046，China；

3ChongqingMedicalUniversity，Chongqing400050China）Abstract：

ObjectiveTostudytheeffectofprovedrecipeQubansouponcellproliferation，tyrosinaseactivityandthemelanogenesisofA375humanmelanomacellandtoexplorethemechanismofthemontreatingchloasmaMethodsMTFwasusedtostudytheproliferationofA375humanmelanomacel1Tyrosinaseactivityw