肿瘤的最新基因研究Word文件下载.docx

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Stats在头颈部肿瘤中的研究仅是开端。

Leong等研究了头颈部鳞癌中Stat5的表达及其与EGFR和TGFα的关系，结果显示Stat5有2种亚型即Stat5a和Stat5b，与正常组织相比表达明显增多，并且EGFR和TGFα引起表皮增生依赖于Stat5b的激活而不是Stat5a。

Madusa等在研究应用维生素A、5-FU和放疗（FAR）联合治疗头颈部鳞癌时发现在鳞癌细胞中Stat3处于激活状态，抑制其活性可以提高FAR的治疗效果。

2抑癌基因

抑癌基因存在于正常细胞中，具有与癌基因相拮抗的作用，抑制肿瘤的形成和生长。

抑癌基因失活时，则会失去对癌基因的监控，使细胞异常增殖与分化，导致肿瘤发生。

目前P27、P16、FHIT等抑癌基因与头颈部肿瘤关系正成为新的

研究热点。

2.1P27P27是近年发现的抑癌基因，它是由Polyak

和Toyoshima2个研究小组分别采用反向遗传学途径和酵母相互作用筛选克隆发现的。

它编码的蛋白对cyclin-CDKs具有广泛的抑制活性，属于细胞周期抑制蛋白kip类，与

P27、p57功能相似。

P27是进化高度保守的蛋白质，其氨基酸序列保守性为90%，P27基因的突变罕见于人类，仅见个别密码子的多态性表现。

P27蛋白水平在多数肿瘤中均异常下

降。

Fan等用免疫组化染色对109例喉鳞癌患者进行了回顾性研究，结果表明，肿瘤的大小、临床分期和淋巴结转移与

P27的表达有关，P27是预测喉鳞癌预后的有用指标，并可帮助医生选择扩大治疗范围的病例。

Saegusa等采用免疫组化染色方法检测了鼻窦肿瘤中P27的表达，结果P27平均计数从正常到恶性病变依次减少，各类型间的计数差别有显著意义，提示P27表达的降低与鼻窦肿瘤的增殖有关，也与鳞癌的角化程度有关，表明P27对于降低细胞的增殖活性起着重要的作用。

Hager等的研究表明，在头颈部鳞癌中应用1,25（OH）2VitD3抑制G0\G1期的转换可以诱导P21和P27的表达，从而控制鳞癌细胞的增殖。

这项研究也提示了P27的表达可以抑制细胞的增殖活性。

2.P16基因全长8.5KB，由3个外显子和2个内显子

组成。

P16又称为细胞周期素依赖性激酶4抑制剂，其产物

P16蛋白可与cyclinD1竞争性结合CDK4，直接作用于cyclinD\Rb\CDK4的反馈途径，调节Rb蛋白磷酸化作用，从而抑制细胞增殖。

初步的研究表明，P16基因在机体许多部位的肿瘤中有突变，很可能是在肿瘤发生过程中起重要作用的肿瘤抑制基因。

P16蛋白缺乏是头颈部鳞癌中常见的分子异常，可能是癌变的早期事件，与其发病机制密切相关。

3,FHIT1996年Ohta等从上皮癌细胞系3p14.2区域克隆出的一个候选基因，是新的抑癌基因，在人类多种肿瘤组织或细胞系中，此基因呈现高频率的纯合性缺失或异常转录。

FHIT功能缺失、异常可能导致了细胞生长与生长抑制信

号调控失衡，从而细胞生长失控形成肿瘤，它与许多肿瘤的发生有关。

Virgilio等用southern杂交和免疫荧光杂交技术对26个头颈部鳞状细胞癌细胞株进行研究，结果表明一半以上的头颈部肿瘤患者存在FHIT基因的异常转录。

Otterson等认为，EB病毒致癌的途径可能是病毒整合到FAR3B区域，而FHIT包含了FAR3B区域，故推测EBV致癌可能主要通过FHIT基因的改变。

FHIT基因的改变主要表现为异常转录，但研究发现并不是所有的异常转录都会导致基因异常，其具体作用机制及预测癌变发生的价值还有待进一步研究。

Pavelic等用分子基因和免疫组化方法研究了FHIT的缺失和头颈部鳞癌及肺癌的关系，结果表明，头颈部鳞癌和肺癌患者FHIT缺失，并有细胞增生和p21waf1的阴性表达，同时FHIT蛋白阳性肺癌患者的平均生存率明显高于阴性的患者。

Kisielewski等通过RT-PCR对29个头颈癌组织块

和9个头颈癌细胞系FHIT基因的转录产物进行研究表明，7∕9的肿瘤细胞系在蛋白水平上表现出FHIT表达异常。

Gonzalez用免疫组化方法检测了口腔鳞癌和邻近的正常鳞

状上皮中FHIT蛋白的表达，发现正常鳞状上皮组织中J,KF

蛋白的表达为强阳性，FHIT蛋白的表达水平只在恶性肿瘤的

细胞中缺失或降低。

大量研究表明，检测肿瘤基因标记物有助于早期诊断及治疗头颈部肿瘤，提高肿瘤患者的生存率。

尽管目前还没有公认的、明确的肿瘤基因标记物，但随着分子生物学的进展，肿瘤基因标记物在头颈部肿瘤诊断和治疗中的作用将越来越重要，为人类最终攻克癌症做出贡献。

p53;

抑癌基因;

肿瘤免疫

　　p53是迄今被发现的与肿瘤发生、发展关系最为密切的抑癌基因,p53基因的突变见于人类50%以上的肿瘤［1］。

正常的p53蛋白通过诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡等途径对细胞增殖发挥负调控作用,并促进细胞分化,同时p53对于维持遗传物质的稳定性发挥极其重要的作用。

由于点突变、基因片段缺失和p53蛋白失活等导致的p53功能缺陷,可以通过多种分子机制引起细胞过度增殖和遗传物质的改变,以及逃避机体对癌变细胞的免疫监控作用,最终导致肿瘤的发生［2］。

同时,在肿瘤细胞中异常表达的p53,尤其是突变型p53蛋白可以诱导机体产生细胞和体液免疫反应［3］。

因此,通过检测p53基因结构和功能的改变,以及体内p53特异性T细胞的活化和抗体产生,可以为肿瘤的早期诊断提供依据,而p53抗原肽或野生型p53的应用,将有助于激发抗肿瘤免疫反应和纠正肿瘤细胞的恶性表型,从而为肿瘤的免疫治疗带来新的希望。

　　1 

p53基因及其生物学功能概述

　　人类p53基因定位于染色体17p13.1,全长16000～20000bp,由11个外显子和10个内含子组成,编码由393个氨基酸残基组成、相对分子质量（Mr）为53000的蛋白。

野生型p53蛋白是一种定位于细胞核中的转录因子,其活性形式为四聚体,自N端起依次为转录活化区、DNA结合区、四聚体化区和C端调节区。

p53活性受到磷酸化、乙酰化等调节,第15位和37位丝氨酸的磷酸化,以及第373和382位赖氨酸的乙酰化都可以显著提高p53蛋白的转录激活能力［4］。

另外,癌基因产物Mdm2与p53结合后,能够诱导后者发生p53发生泛素化降解,也成为细胞内p53功能调节的重要方式［5］。

当细胞面临DNA损伤、纺锤丝断裂、癌基因异常激活、缺氧,细胞内dNTP不足等不利因素时,在上游信号分子的作用下,p53表达上调,或细胞原有的p53通过磷酸化而活化,使p53的胞质含量、稳定性及转录活性均显著增加［2,5］。

　　活化的p53蛋白通过调控其靶基因的表达以及下游信号传递,引起多种生物学效应,主要包括:

（1）细胞周期阻滞。

p53活化后,可以启动细胞周期负调控相关基因p21waf1/cip1,1433σ和cyclinG等的转录表达。

以p21waf1/cip1为例,该蛋白可以通过抑制细胞周期素/细胞周期素依赖性激酶复合体的活化,使细胞周期停滞于G1期。

（2）DNA损伤修复。

细胞周期的停滞使损伤的DNA分子有机会得以修复。

在电离辐射的诱导下,p53蛋白通过与gadd45基因内含子中一段序列结合,上调该基因的表达,而gadd45通过激活cdc2基因促进基因组DNA修复。

（3）细胞凋亡。

在特定情况下,如DNA严重损伤或修复失败时,活化的p53作为转录因子,可以直接启动细胞凋亡相关基因bax、gml、p2xm、killer/dr5和pag608等的表达,促进细胞凋亡［6,7］。

　　p53对于维持细胞、组织乃至生物个体的功能和代谢具有至关重要的作用。

除了维持细胞基因组的稳定性、防止癌变外,p53对于糖代谢、能量的产生,以及细胞老化等生理过程都具有重要的调节作用［8,9］。

　　2 

p53与机体免疫反应

　　p53与机体免疫系统的功能和免疫反应关系密切,表现在:

一方面p53,尤其是突变型p53可以作为肿瘤相关抗原激发机体免疫反应;

另一方面,p53作为转录因子,可以直接启动免疫细胞中一些基因的表达,从而对这些细胞的增殖和功能发挥调节作用。

　　2．1 

p53蛋白的免疫原性 

在正常细胞中,由于Mdm2结合引发的高效泛素化降解作用,p53蛋白的含量非常低,而且主要分布于细胞核中。

尽管在T淋巴细胞发育的阴性选择过程中,胸腺中表达的p53蛋白可以介导p53反应性CD8+T细胞的克隆删除,但由于p53表达和暴露有限,加之p53蛋白通常并不呈现在一些实质组织细胞表面,因此这种删除是不彻底的。

在肿瘤细胞中,由于野生型或者突变型p53的过量表达,尤其是在细胞质中浓度的增加,使少量坏死肿瘤细胞释放的p53能够被抗原提呈细胞摄取、加工并提呈给T细胞,使p53特异性T细胞活化,激发机体抗肿瘤免疫反应。

研究显示,来源于野生型和突变型p53蛋白的特定肽段均可以诱导正常或荷瘤小鼠体内MHCII限制的CD4+T细胞活化,而包含突变氨基酸残基的肽段通常显示出更强的诱导T细胞活化的能力。

在肿瘤发生、发展的不同阶段,活化的p53特异性CD4+T细胞可以分泌IL2、IFNγ等Th1类细胞因子,进一步激发抗肿瘤免疫反应,也可能产生IL4、IL5、IL10等Th2类细胞因子,介导免疫耐受,从而产生完全不同的效应。

但只有在少数情况下,这类针对p53的免疫反应可以有效地抑制肿瘤的生长,甚至导致肿瘤彻底消失［10］。

　　除了激发细胞免疫,野生型和突变型p53蛋白也能够诱导机体产生自身抗体。

Schlichtholz等［11］在30%的乳腺癌患者体内检测到了p53抗体,而在结肠癌患者中这个比例约为26%。

这些抗体主要针对包含p53突变位点的抗原肽段。

同时,尽管p53抗体的产生在乳腺癌和一些消化系肿瘤中似乎与晚期肿瘤以及患者低存活期相关,但在大多数肿瘤中,它与肿瘤大小、分期并没有相关性。

　　2．2 

p53的两类抗原表位 

在野生型或者突变型p53蛋白中,存在两类抗原表位:

一类为优势表位（dominantepitope）,它们在T细胞发育的阴性选择阶段或者成熟的外周免疫器官中充分暴露,被加工提呈后引起相应T细胞克隆删除或者活性抑制,使机体对这类抗原产生免疫耐受。

另一类为隐蔽表位（crypticepitope）,含有这类表位的肽段由于在发育中的胸腺和正常外周组织中不被充分暴露、不能被抗原提呈细胞加工,或者在与结合相同MHC分子的优势表位的竞争中处于劣势等原因,不能有效地被提呈给相应的T细胞克隆,因而不能诱导中枢或者外周免疫耐受。

在特定生理状况下或特定组织（如肿瘤）中,当这类抗原表位大量存在或者被有效地加工提呈时,就可能诱发针对这种抗原的免疫反应。

在p53蛋白中,这些能够诱导机体免疫反应的隐蔽抗原表位主要位于N端或C端结构域,而较少存在于处在一级结构中心区域的DNA结合结构域［10,11］。

例如,在肿瘤患者体内,含有第1～50位氨基酸序列（AA150）的肽段可以有效地诱导T细胞活化,但它们活化后的效应与肿瘤的发展阶段关系密切,通常临床Ⅰ期和Ⅱ期的患者较之Ⅲ期患者更倾向于产生Th2类细胞因子。

相比之下,AA331370诱导T细胞活化后产生的细胞因子与肿瘤分期关系不大。

在很多肿瘤细胞中,由于突变导致p53蛋白在细胞质中大量聚积,使突变的p53蛋白被蛋白酶体降解,或者释放后被抗原提呈细胞摄取、加工,分别通过MHCⅠ和MHCⅡ限制的途径活化CD8+和CD4+T细胞,诱导针对相应抗原的免疫反应。

然而有证据表明,在野生型和突变型p53蛋白中,能够诱导T细胞活化并产生Th1类细胞因子的抗原表位远远少于能够使活化T细胞分泌Th2类细胞因子的表位,因此所有抗原表位作用的总效应通常是诱导机体产生针对p53的免疫耐受。

　　2．3 

p53与免疫调节 

p53除了作为抗原诱导机体免疫反应之外,还可能通过激活免疫系统相关基因的表达直接参与免疫调节。

在p53基因缺陷小鼠中,免疫系统的发育和老化过程均显著加快,并引起记忆性T细胞过度积累［12］。

在细胞凋亡过程中,凋亡细胞释放大量自身抗原,但这些抗原很少诱发自身免疫反应。

研究表明,一种可能的机制是p53作为转录因子直接上调主要抗原提呈细胞树突状细胞中CD200的表达,而后者可以显著抑制T细胞活化和免疫反应［13］。

另一项研究显示,p53的表达对于抑制肠道黏膜固有层T细胞的增殖,以及维持其对抗原的免疫耐受状态具有重要意义［14］。

巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）通过抑制p53在细胞中的积累和活化维持巨噬细胞的存活和功能,因而在机体天然免疫中发挥调节作用［15］。

环氧化酶-2

人类COX-2基因定位于1号染色体的1q25.2—q25.3,全长8.3kb，由10个外显子和9个内含子构成，编码604个氨基酸残基组成的多肽。

在5′端转录起始点上游有一些转录调控序列，包括2个核转录因子-κB（nuclearfactor-κB，NF-κB）位点、2个激活蛋白质-（2activatorportein-2，AP-2）位点、TATAbox序列、cAMP反应元件（cAMPresponsiveelement,CRE）、CCAAT增强子结合蛋白位点（CCAAT/enhancerbindingprotein,C/EBP）、Ets-1转录因子位点等。

COX-2与COX-1具有61%的同源性，但却表现出明显的功能差异。

COX-2主要分布于细胞核膜上，其表达调控主要集中在转录水平。

诱导其表达的因素包括癌基因、白细胞介素-1、缺氧、紫外线、转化生长因子和肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α,TNF-α）等，而地塞米松、抗氧化剂、抑癌蛋白P53则可抑制其表达。

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COX-2的致癌机制，现在比较认同的观点是认为COX-2可通过促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、促进血管形成、抑制免疫功能等机制，参与肿瘤的发生和发展。

其中主要是促进细胞增殖和抑制凋亡、促进血管形成。

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2.1COX-2通过促进细胞增殖和抑制细胞凋亡参与肿瘤的发生和发展牙易网（

COX-2的催化产物前列腺素E2（prostaglandinE2，PGE2）和其他前列腺素可诱导Bcl-2原癌基因的表达，同时下调E-cadherin和转化生长因子-D受体表达并提高细胞内CyclinAMP浓度从而抑制细胞凋亡，促进肿瘤发生。

研究表明，PGE2的释放在介导生长因子和癌基因的生长促进起决定作用。

研究发现，COX-2特异抑制剂和非特异抑制剂在多种肿瘤细胞包括胰腺癌、胶质瘤、结肠癌等均可引起凋亡。

有学者用大鼠COX-2cDNA转染大鼠肠上皮细胞RIE-1，获得稳定表达COX-2的细胞株RIE-S后，发现RIE-S有抗凋亡活性。

可见COX-2的过度表达改变了细胞某些增殖和凋亡相关基因的表达，从而促进肿瘤恶性行为的发生。

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2.2COX-2使新生血管增生及促进肿瘤生长牙易网（

肿瘤的血管生成是肿瘤生长浸润的重要环节，COX-2上调肿瘤血管生成，从而促进肿瘤生长。

肿瘤的生长可分为无血管期和有血管期，在无血管期肿瘤的直径不超过2mm，而在有血管期（肿瘤内出现新生血管）为肿瘤的生长转移提供了条件。

在恶性肿瘤的生长中，浸润和转移有赖于肿瘤血管生成，微血管密度（microvasculardensity，MVD）是反映恶性肿瘤侵袭和转移等生物学行为的重要指标。

研究发现肿瘤COX-2过度表达的患者MVD较COX-2表达低者明显增加。

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血管生成取决与作用相反的促血管生成因子和血管生成抑制因子间的平衡。

COX-2诱导血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basicfibroblastgrowthfactor,bFGF）等促血管生成因子的表达，从而促进肿瘤血管的生成，对头颈部鳞状细胞癌的研究也表明，COX-2表达增加并伴有VEGF表达上调和血管生成增多。

2.3抑制免疫功能及促进肿瘤发生发展牙易网（Z/

COX-2催化产生的PGE2可抑制T细胞和B细胞的增殖和自然杀伤细胞的细胞素反应，同时PGE2抑制TNF-α的产生，诱导有免疫抑制功能的白细胞介素-10的产生[16]。

Lang等[17]发现癌症患者单核细胞的迁移能力明显下降，选择性的COX-2抑制剂可明显提高这种迁移力，经分析认为COX-2可能通过影响单核—巨噬细胞的迁移力而抑制癌症患者的免疫系统，使癌细胞能够逃避免疫监视和免疫攻击。

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COX-2与头颈部肿瘤的关系牙易网（X€Cd€YLj€

Chan等[18]采用定量RT-PCR、免疫印迹和免疫组化方法检测COX-2在头颈部肿瘤的表达情况，发现24例头颈部肿瘤患者平均COX-2mRNA水平是健康志愿者的正常口腔黏膜的150倍；

免疫印迹有6例头颈部肿瘤患者COX-2呈阳性，而健康志愿者检测不到；

免疫组化显示头颈部鳞状细胞癌患者均表达COX-2蛋白。

Renkonen等[19]通过免疫组化的方法观察正常口腔黏膜、不同程度的口腔白斑病变及鳞癌侵害时发现，COX-2的染色在正常的、增生的、发育异常的、癌变鳞状上皮中依次增高。

Lee等[20]用COX-2的抗体蛋白印迹分析，显示受检的7株头颈部鳞癌细胞系固有地表达COX-2，且较正常组织中表达水平明显增高。

因此，COX-2在头颈部鳞癌的发生发展中的确起了重要作用。

Cometta等[21]采用免疫组化和免疫印迹法观察到甲状腺乳头状癌、滤泡癌和桥本甲状腺炎标本出现COX-2阳性表达，但正常的甲状腺组织中没有COX-2阳性表达。

目前，COX-2在涎腺肿瘤中的研究很少，有待进一步的深入研究。