肉毒梭菌文档格式.docx

肉毒梭菌文档格式.docx

《肉毒梭菌文档格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《肉毒梭菌文档格式.docx（12页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

ClostridiumbotulinumDetectionFoodpoisoningControl

1.肉毒梭菌简介

1.1肉毒梭菌——基本概述

肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽胞杆菌属，具有该菌的基本特性，即厌氧性的杆状菌，形成芽胞，芽胞比繁殖体宽，呈梭状，新鲜培养基的革兰氏染色为阳性，产生剧烈细菌外毒素，即肉毒毒素。

肉毒梭菌生长时，可形成一种强力的毒素抑制呼吸导致死亡，这是迄今为止所知的最毒的自然生成的毒素之一。

1.2肉毒梭菌——类型

一种是蛋白分解型（就是分解蛋白质的类型），另一种是非蛋白分解型（就是不能分解蛋白质的类型）。

蛋白分解型包括肉毒梭菌的A型和一部分B型和F型。

非蛋白分解型包括肉毒梭菌的E型和一部分B型和F型。

肉毒梭菌一个菌株产生一种型毒素，根据所产生毒素的抗原性不同，可将肉毒梭菌分成8个型（A、B、Cα、Cβ、D、E、F、G型），对人致病的是A、B、E、F等4型。

A、B型最常见，E型来自鱼制品，F型少见，其他型则对动物致病。

1.3肉毒梭菌——生物形态

肉毒梭菌为多形态细菌，约为4×

1μm的大杆菌，两侧平行，两端钝园，直杆状或稍弯曲，芽胞为卵圆形，位于次极端，或偶有位于中央，常见很多游离芽胞。

有时形成长丝状或链状，有时能见到舟形、带把柄的柠檬形、蛇样线装、染色较深的球茎状，这些属于退化型。

当菌体开始形成芽胞时，常常伴随着自溶现象，可见到阴影形。

肉毒梭菌具有4-8根周毛性鞭毛，运动迟缓；

没有荚膜。

1.4肉毒梭菌-生物观察

1.4.1在固体培养基表面上

形成不正圆形，大约3毫米左右的菌落。

菌落半透明，表面呈颗粒状，边缘不整齐，界线不明显，向外扩散，呈绒毛网状，常常扩散成菌苔。

1.4.2在血平板上

出现与菌落几乎等大或者较大的溶血环。

1.4.3在乳糖卵黄牛奶平板上

菌落下培养基为乳浊，菌落表面及周围形成彩虹薄层，不分解乳糖；

分解蛋白的菌株，菌落周围出现透明环。

　1.4.5适宜温度

肉毒梭菌发育最适温度为25-35℃，培养基的最适的酸硷度为pH6.0-8.2。

2.肉毒梭菌检测

2.1以毒素活性为基础的检测方法

2.1.1小鼠生物学试验法

国际上最早确立的检测BoNT的标准方法是小鼠生物学试验法。

这种方法是迄今为止最敏感、最可靠的肉毒检测方法,可以实现对皮克（pg）级毒素的定量检测。

但此法操作繁琐、试验时间较长,除实验动物外,还需要有马血清抗毒素配合使用,也不适合现场推广。

2.1.2禽眼睑注射试验法

针对生物学试验法,我所发明了一种新的检测BoNT的动物试验法,即禽眼睑注射试验法[3]。

该方法具有特异性强、操作简单和易于判定等特点,与小鼠生物学试验法具有相同的特异性。

除了小鸡和成鸡外,还可根据现场实际条件选用麻雀、黄雀、鸽子等多种鸟类进行眼睑注射试验法,也能获得较好的试验结果。

尽管小鼠生物学试验法和禽眼睑注射法比较灵敏,但试验费用较高,涉及动物的使用问题。

2.1.3酶活性分析法

BoNT分子的生物活性区是它的轻链,具有依赖锌离子金属内肽酶活性。

不同型别的BoNT具有底物特异性和剪切位点的高度选择性,即每一型BoNT或者识别不同的蛋白底物或者作用于同一底物上不同的剪切位点。

例如,BoNT/A,BoNT/E以不同的剪切位点作用于突触体相关蛋白（synaptosome-associatedproteinof25kDa,SNAP-25）底物,BoNT/B和破伤风毒素（TeNT）以相同的剪切位点作用于囊泡相关膜蛋白（vesicle-associatedmembraneprotein,VAMP）底物,BoNT/C作用于syntaxin和SNAP-25两种底物,BoNT/D,BoNT/F,BoNT/G则以不同的剪切位点作用于VAMP底物[4~8]。

依据各型别BoNT作用底物的特点,人们通过检测其水解底物的速率来测定BoNT的酶活性和含量。

此种方法的关键是使用恰当的反应底物和显色剂。

如Schmidt等[9]采用氨基酸顺序为SNRBRIDQANQATRML的小肽作为反应底物,使用荧光胺作为显色剂,检测灵敏度达到0.001mg/ml。

该方法的最大特点是可以判定检测样品中的毒素是否具有生物活性,非常适合于BoNT抑制剂或拮抗剂的筛选。

当用于检测时,该方法则存在重要缺陷。

如果检测结果为阳性,需要进一步通过实验以排除破伤风毒素;

如果检测结果为阴性,还要考虑到毒素已经失去活性的可能性。

另外,待检样品中如果含有内源性的蛋白酶,在BoNT与底物相作用之前,蛋白酶可能已经水解了一部分底物,破坏了底物上BoNT的识别位点或者降低了底物的浓度,从而影响对检测结果的判断。

2.2免疫学检测方法

免疫学方法是利用BoNT特异性的诊断抗体而建立的一种检测方法,也逐渐成为目前常用的一种检测BoNT的重要手段,如免疫双扩试验（DD）、反向乳胶凝集试验（RPLA）、协同凝集试验（COA）等;

与标记技术相结合的还有酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体检测技术（FIA）、放射免疫技术（RIA）和胶体金免疫层析（GICA）技术等。

凝集技术在检测早期使用较多,但因其特异性不强、灵敏度低、所需样品量多,操作较为繁琐。

而放射免疫分析方法在特异性方面有所提高,但是检测灵敏度却不高,只有80~100MLD50/ml[10],而且存在放射性元素污染,也不易推广。

2.2.1酶联免疫吸附试验法

ELISA是目前应用最广泛的检测方法。

该方法利用酶反应测定特异性抗原-抗体反应的方法,分为夹心法和竞争法,测定毒素的ELISA主要采用夹心法。

早期的双抗体夹心检测毒素抗原的方法,主要缺陷是检测灵敏度不高,仅为50~100MLD50[10],而且不同毒素的血清型之间有交叉反应。

近年来,通过应用高灵敏度的抗体试剂盒复杂的信号放大系统,这些问题已在很大程度上得到解决。

该法的检测过程方便且灵敏度高,成为目前较为常用的一种敏感而特异的检测方法。

该法的敏感度通常达到纳克（ng）水平,而且可以用于毒素的定量。

2001年,华盛顿大学食品研究所和美国CDC,FDA共同建立的检测BoNT/A,B,E的双抗体夹心ELISA方法获得国际分析科学家联合会（AOAC）批准,成为第2个检测BoNT的国际认可的标准方法[11]。

2.2.2胶体金免疫层析技术

随着近年来国际反恐形势的日益严峻,各国实验室也致力于研制更加简便、快捷且灵敏度高的BoNT检测新方法,其中以胶体金免疫层析技术（immuno-chromatographicassay,ICA）发展最快,应用前景最广。

其优势在于:

标本处理简单,不需要专门仪器和人员培训,非技术人员按照说明书即可操作,并在5~15min内观察到结果,很适合突发事件现场和基层使用。

对BoNT的检测灵敏度可达ng水平[12]。

目前,利用胶体金免疫层析技术,美国等国家也已生产出多种形式的检测条、检测卡或检测盒用于现场快速检测。

2.2.3免疫PCR

免疫PCR技术（immuno-PCR）是将抗原-抗体反应的特异性与PCR技术相结合建立的一种方法。

其基本原理和ELISA相同,只是检测的物质为标记DNA的PCR扩增产物。

因此其敏感度是ELISA法的10万倍,可检测到数百个待检分子。

检测BoNT的免疫PCR有间接免疫PCR和夹心免疫PCR两种。

用间接免疫PCR和夹心免疫PCR检测BoNT/A的灵敏度达到50fg[13]。

由于夹心免疫PCR是以扩增的DNA量来反映待检抗原的量,所以,用不同浓度的标准抗原同时进行PCR,根据生成的DNA量可获得标准抗原的剂量反应曲线,然后从标准曲线上读取待检抗原量,从而达到对抗原定量的目的。

2.3以受体为基础的检测方法

BoNT相对分子质量100@103的Hc,又分为Hc-N端的跨膜区和Hc-C端的细胞膜受体结合区,Hc-C端可介导毒素与神经细胞膜上的特异性受体结合,借助Hc-N端的跨膜区形成通道使LC进入细胞内以发挥其毒性作用。

BoNT的细胞膜受体主要是神经节苷脂（ganglioside,G）,如神经节苷脂GT1b,GD1b,GQ1b,GT1a等[14]。

在此基础上发展了神经节苷脂-脂质体免疫试验（ganglioside-liposomeimmunoassay）方法。

通过自然插入的方法将神经节苷脂受体GT1b插入脂质双分子层,得到神经节苷脂掺入脂质体（ganglioside-incor-poratedliposomes）,这种脂质体作为高亲和力的受体被固定于固相载体上,待样品中的BoNT与之结合后,再加入经标记物标记的抗BoNT抗体,通过探测标记物就可以检测到BoNT。

其操作方法类似于夹心ELISA,以96孔聚苯乙烯酶联板或硝酸纤维素膜作为固相载体。

检测时间可以缩短至20min以内,最低检测量为15pg/ml[15]。

这种检测方法快速、灵敏、简单、可靠,且对操作人员及仪器没有较高要求,特别是可用于未知毒素的监测。

目前已有神经节苷脂受体芯片应用于霍乱毒素检测的报道[16]。

2.4核酸检测技术

PCR可以快速地使pg水平的起始DNA混合物扩增达到ng级的特异性DNA片段,从而可以将样品中的微量成分检测出来,具有敏感性高、特异性强的优点,但对实验条件和设备要求较高,操作人员要经过技术培训,必须预防样本污染,费用较高。

2.4.1基因探针杂交PCR

该方法敏感性高、特异性强,可及时提供快速、准确的病原学诊断,但目前的技术尚不能进行定量分析。

2.4.2多重PCR

多重PCR（multiplexPCR）方法可以同时检测多个血清型的肉毒梭菌。

1999年,王兴民等[17]运用多重PCR方法成功检测了C、D型肉毒梭菌,灵敏度分别为450pg和10pg。

2001年,Lindstrom等[18]运用多重PCR方法同时进行A,B,E和F型肉毒梭菌的检测[18]。

该方法对于A,B,F型肉毒梭菌的检测灵敏度可达0.01个孢子/g样品,对于E型肉毒梭菌的检测灵敏度为0.1个孢子/g样品。

2.4.3PCR-ELISA

PCR-ELISA是定量PCR方法的一种。

该方法的特异性和灵敏度均高于小鼠生物学试验方法[19]。

PCR-ELISA用微孔板作为反应载体,适于大量检测,且只需热循环仪和酶标仪,因而应用最广。

如何将这一过程自动化是发展方向。

值得注意的是,免疫PCR方法和PCR-ELISA方法均综合运用了免疫学和PCR的原理,但是侧重点不同。

免疫PCR方法的免疫学部分使用了抗BoNT的特异性抗体,与ELISA方法的检测原理基本相同,只是将ELISA方法的显色系统改进为PCR扩增系统。

所用探针不一定是针对BoNT的特异性探针。

该方法的原理偏重于免疫学,利用了BoNT的免疫学特性,本质是检测BoNT的氨基酸序列。

PCR-ELISA方法的原理则是偏重于PCR。

PCR-ELISA使用了BoNT特异性的引物进行扩增,对扩增产物的检测使用了酶显色系统,因此该方法中不需要制备抗BoNT的特异性抗体,其本质是检测BoNT分子的核酸序列。

2.5生物传感器技术

20世纪90年代以来,以生物传感器技术为基础的各类生物检测系统迅速兴起,该技术亦逐渐应用于生物毒素检测领域。

针对BoNT的检测,目前已经发展的多是以光学检测元件作为信号转换器的生物传感器,如时间分辨荧光光纤生物传感器、光寻址电位传感器、顺磁珠电化学发光传感器等。

用时间分辨荧光分析法检测A型和B型BoNT只需要2h,灵敏度达到4~20pg/ml[20]。

国外已发展了用于BoNT检测的生物传感器,并装备部队。

2.6质谱技术

质谱（massspectrometry,MS）应用于细菌检测始于1975年。

基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）很适合研究蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子。

电喷雾电离（ESI）一大优势是可方便地与分离技术联用,例如,在使用ESI离子化前使用高效液相色谱（HPLC）和毛细管电泳（CE）可方便地除去待测物中的杂质。

质谱技术应用于微生物检测和鉴定具有检测范围广、灵敏度高、快速、简便的特点,显示出这一技术在微生物鉴定中的潜力。

质谱技术可以直接检测BoNT蛋白,但是样品的前处理技术是关键,高效的分离纯化技术决定了能否获得较高的检测灵敏度。

不同血清型的BoNT其对底物的裂解位点不同,裂解产生的肽段也不相同。

用质谱技术检测BoNT裂解底物产生的肽段,从而可以检测和鉴定A,B,E和F型BoNT[21]。

这种方法综合了BoNT的生物学活性和质谱方法的特点,因此被称为Endopep-MS。

Endopep-MS不仅可以用于检测临床、食品和环境样品中的BoNT,在治疗或研究用的BoNT制剂活性的标准化方面也有较好的应用前景。

该方法比小鼠生物学试验快速,比ELISA灵敏,且没有交叉反应现象。

但仪器昂贵,需要专业技术人员操作,而且对样品的前

处理技术要求比较高,需要将样品纯化和浓缩,以去除大部分的内源性蛋白酶并将样品中的毒素蛋白浓缩到一定的浓度范围内,这就大大增加了检测程序的繁琐性和复杂性,并且在分离纯化过程中还造成了样品的损失。

因此,发展更为简单有效的分离纯化技术是完善生物质谱技术的关键。

2.7芯片技术

生物芯片技术自20世纪末开始发展以来,已经受到了广泛的关注,但是针对BoNT的生物芯片研究还不多,仍有很大的发展空间。

近几年,有研究者将荧光技术与芯片技术相结合,发展了微流控装置（microfluidicdevices）对生物毒素进行分析,已经应用于BoNT/A的检测及其拮抗剂的筛选。

20世纪90年代中期,美国Luminex公司将流式细胞仪、数字信号处理器和一种激光检测装置相结合,开发了一种具有多指标同步分析（xMAP）功能的芯片技术,也称为液态阵列（liquidchip）或悬浮阵列（suspensionarray）。

目前,xMAP液态芯片技术在国内的发展还刚刚起步,未得到足够的重视。

我们实验室研究运用液态芯片技术对包括BoNT在内的几种生物毒素恐怖剂进行了检测与鉴定,灵敏度可达100pg/ml。

3.肉毒梭菌与食物中毒

肉毒梭菌分布广泛，主要存在于自然界的土壤及海洋沉淀物中，偶尔存在于动物的粪便中。

在厌氧环境中，此菌分泌强烈的肉毒毒素，能引起特殊的神经中毒症状，病死率很高。

肉毒梭菌主要依靠其强烈的外毒素致病。

肉毒毒素是已知最强烈的毒素，毒性比氰化钾强一万倍。

小鼠经腹腔注入，LD50为0.00625ng。

纯化结晶的肉毒毒素1mg能杀死2亿只小鼠，对人的致死剂量为0.1μg，即1kg结晶毒品足够使目前全世界人口致死（可毒死100亿人）。

我国报告由肉毒毒素致病的大多为A型毒素。

与所有其他细菌的典型外毒素不同，并非由生活的细菌释放，而是在细菌细胞内先产生无毒的前体毒素，待菌死亡自溶后游离出来，经肠道中的胰蛋白酶或细菌产生的蛋白酶激活后方始具有毒性，其能抵抗胃酸及消化酶的破坏，但不耐热，煮沸1min即可被破坏。

3.1成人肉毒中毒

食品在制作过程中被肉毒梭菌芽胞所污染，制成后未彻底灭菌，芽胞可在厌氧环境中发芽繁殖、产生毒素。

食前又未经加热烹调，已产生的毒素被食后可发生食物中毒。

该病是单纯性毒素中毒，而非细菌感染。

肉毒中毒在国外多见于食入被肉毒芽胞污染的罐头食品、火腿、腊肠及冰箱中储藏不当被肉毒芽胞污染的奶酪、色拉、生食蔬菜（如青豆）等食品所致。

但在我国，肉毒中毒大多由发酵的豆制品和面制品所致。

据我国肉毒病发病最多见的新疆统计，由发酵豆制品（臭豆腐、豆瓣酱等）引起的占80%以上，发酵面制品（甜面酱等）引起占10%左右，二者合计占肉毒中毒病例的90%以上。

但近来我国随着物质生活的提高，食品中肉食制品及冰箱冷藏食品比例增高，也应对肉类食品及冷藏不当食品引起的肉毒毒素中毒保持警惕

3.2肉毒中毒的临床表现

肉毒中毒的临床表现与其他食物中毒不同，胃肠道症状少见，主要为运动神经末梢麻痹，潜伏期18～72h，先有一般不典型的乏力，头痛等症状，随后眼肌麻痹，开始出现复视、斜视、眼睑下垂等。

以后发展至咽喉部肌肉麻痹，吞噬、咀嚼困难。

进而隔膜麻痹，呼吸困难。

很少见肢体麻痹，神智清楚，不发热。

重者可死于呼吸困难与衰竭。

病死率在30%以上。

如及时给予支持疗法与控制呼吸系统的继发感染，病死率可适当降低。

愈后不产生抗毒素，也无免疫力。

3.3婴儿肉毒病

此病发病年龄通常在2周至8个月。

年龄在9个月以上的婴儿未见有婴儿肉毒病的报道。

婴儿中A型中毒多于B型，F型极罕见。

在国外，据查发病婴儿多被喂食了被肉毒杆菌污染的蜂蜜。

其他被污染食物也可感染致病。

芽胞在人体内一般不能发芽，但由于婴儿肠道的特殊环境，可能引起感染和中毒。

临床表现常是先有便泌，继而（约1～2周后）出现头颈部肌肉软松、允乳无力、吞咽困难、眼睑下垂、全身肌肉松弛减退，可持续8周以上。

只要注意营养与护理，大多在1～3月内自然恢复，严重者亦可因呼吸肌麻痹而导致婴儿猝死。

婴儿肉毒病是肉毒梭菌感染后在体内繁殖产生毒素所致，属于感染性中毒，与单纯性中毒不同。

3.4创伤性肉毒症

较少见，1977年美国仅记载18例。

肉毒梭菌本身或同其他微生物一起感染伤口，在伤口繁殖并产生毒素，随血流到达神经系统后引起肉毒中毒。

4食品中肉毒梭菌的检验与控制

具有卫生学意义的检验在于是否检出肉毒毒素。

若只检出肉毒梭菌，但未检出肉毒毒素，不能证明此食物会引起肉毒中毒。

在原料卫生管理方面，由于肉毒梭菌芽胞在自然界的广泛分布，控制食品原料带菌比较困难，也没有卫生学意义，通常不做特殊要求。

在终产品卫生管理方面，由于检验方法复杂，一般不作为食品出厂常规检测。

下表简单列举了与肉制品有关的内容

注：

+有效-无效

F0肉毒梭菌芽胞降低12个对数值，在121℃所需时间（分钟）。

类别1指的是单纯靠热处理杀死肉毒梭菌芽胞，要求121℃加热至少2.5分钟。

类别2是将热处理和添加亚硝酸盐、食盐三个因素一同实施，达到抑制（而不是杀死）肉毒梭菌芽胞的目的，这样可以减少热处理时间。

类别3降低了热处理温度，除了要利用亚硝酸盐和食盐抑制芽胞外，还要增加冷藏措施。

无论何种方式，目标只有两个:

将芽胞杀死或抑制。

由于不可能将所有食品都制成罐头供人们食用，因此，以杀死芽胞为目标的处理方式是不可取的，更多的时候，或曰绝大多数肉制品是以抑制芽胞发育为目标设计和生产的。

巴氏杀菌虽然不足以杀死芽胞，但可以灭活肉毒毒素，若食品原辅料曾污染有肉毒毒素，通过这个过程可以达到安全食用的效果。

若要求产品具有一定的保存性，添加150ppm的亚硝酸盐与5.3%的食盐，对肉毒梭菌芽胞有很好的抑制效果。

终产品检验对防止肉毒梭菌食物中毒具有重要的意义，高危食品如罐头产品在出厂前通常要作商业无菌检验。

这项检验可以验证产品的热加工工艺是否满足食品安全要求，能够引起胀袋及产毒的芽胞是否已被全部杀死，从而判断产品是否可以常温流通。

商业无菌检验方法简便、准确率高，容易判断，是常温流通食品的首选方法。

低温肉制品冷链流通是不容忽视的，低温肉制品的热加工工艺不足以杀死肉毒梭菌的芽胞，科学的态度是认可它的存在但控制它的繁殖，由于肉毒梭菌繁殖及产毒的最适温度为18～35℃，对于真空包装及塑料肠衣灌制的低温肉制品，保持0～4℃流通是重要的。

[参考文献]

[1]GillMD.Bacterialtoxins:

atableoflethalamounts[J].Micro-biolRev,1982,46

（1）:

86-94.

[2]SchiavoG,SantucciA,DasGuptaBR,etal.Botulinumneuro-toxinserotypesAandEcleaveSNAP-25atdistinctCOOH-term-inalpeptidebonds[J].FEBSLett,1993,335

（1）:

99-103.

[3]YamasakiS,BinzT,HayashiT,etal.BotulinumneurotoxintypeGproteolysestheAla81-Ala81bondofratsynaptobrevin2[J].BiochemBiophysResCommun,1994,200

（2）:

829-835.

[4]SchmidtJJ,BostianKA.Assayfortheproteolyticactivityofsero-typeAfromClostridiumbotulinum[P].USPatent,743894,1996-11-06.

[5EkongT.Immunologicaldetectionofbotulinumneurotoxins[J].Anaerobe,2000（6）:

125-127.

[6]JohnsonEA,GoodnoughMC,LarsonAE,etal.DetectionofbotulinumneurotoxinsusingELISAandmicrofluidicsystems[R].FRIresearchreportsonClostridiumbotulinum,2001.19.

[7]左庭婷.肉毒毒素的中毒和检测方法[J].微生物学免疫学进展,2003,31

（2）:

87-90.

[8]王兴民,孟筱琦,王成怀.多重聚合酶链式反应检测C、D型肉毒神经毒素基因[J].中国人兽共患病杂志,1999,15

（1）:

14-16.

[9]FachP,PerelleS,DilasserF,etal.DetectionbyPCRenzyme-linkedimmunosorbentassayofClostridiumbotulinuminfishandenvironmentalsamplesfromacoastalareainnorthernFrance

[J].ApplEnvironMicrobio,l2002,68（12）:

5870-5876.

[10]PeruskiAH,JohnsonLH3r