取小鼠脑组织Word格式文档下载.docx

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若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。

做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。

先麻醉小鼠

剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳

先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了

再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬

小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。

具体步骤：

常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。

然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。

用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。

生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。

然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。

取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。

放多聚里固定24h后包埋切片即可。

具体操作如下：

实验操作步骤：

1） 

小鼠称重，以每克小鼠0.0025ml4%戊巴比妥钠剂量的实施腹腔麻醉。

也可以用10%的水合氯醛，3-5ul/g腹腔注射麻醉。

2） 

将麻醉的小鼠仰放在操作台上，去毛。

3） 

解剖小鼠，暴露心脏。

4） 

找到心尖部，左手用镊子提起心尖部，右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约0.5cm（最好是用小点的针头，用止血钳固定针尖，剪开右心耳。

5） 

将灌流器的导管部开口放到生理盐水中里，打开灌流器灌流，直到从右心耳流出的液体为无色，同时小鼠肝脏色淡，肠管肿胀为止，停止灌流。

没有灌流器的用注射器或者吊瓶都可以。

6） 

将灌流器的导管小心的移至4%多聚甲醛或2.5%戊二醛中，注意不要产生气泡，开始灌流。

此时如果看到小鼠四肢突然紧张，尾部卷曲，说明达到固定效果。

7） 

灌流大约5分钟，灌流液用量约150毫升左右结束。

（小鼠的用量没这么多）

8） 

取材。

取实验所需的标本。

9） 

将取出的材料放到事先准备的多聚甲醛（戊二醛）中固定2——4小时后移至30%蔗糖中4度冰箱保存过夜。

我们实验室鼠脑冰冻切片采用4%的多聚甲醛固定，小鼠直接灌注saline20ml，4%多聚甲醛20ml经左心室固定然后取材在4度4%多聚甲醛后固定4-6h，浸20%-30%糖沉底，就可以切片，切片首先需要冰冻切片机，我们的leica1900的，不知道lz那里有没有这个机子，还有一种原始的自己刷冻台的那种，比较麻烦，切片厚度大概选择20-40um差不多

开胸时要把肋骨提起，大U字剪开左右肋弓后掀起，血管钳固定一下（以免挡遮视野）；

平头针插入后稍许打开输液器开关并迅速剪开充盈的右心耳（可见血涌出），用血管钳将心室和平头针一起钳夹固定再推（但滴速也不能太快以免血管被冲破，使灌流液流进肺里）。

另：

开胸时动作尽量要快；

针头可以不插入主动脉，留置于左室也行。

试剂名称：

4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠

所需药品及剂量：

A液：

多聚甲醛　　　　40g

　　蒸馏水　　　　400ml

　　B液：

Na2HPO4·

2H2O　　6.88g

　　蒸馏水　　　　　　　　300ml

　　C液：

NaOH　　　　　　　3.86g

　　蒸馏水　　　　　　　200m

操作过程：

A液最好在500ml的三角烧瓶中配制，至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。

注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。

B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1nNaOH或1NHCl将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合

应用范围：

光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛

保存期限及温度：

4℃冰箱保存备用，长期保存

我在很多方面是个新手，经常在园子里逛，学到了很多东西，但同时也看到了关于同一个问题有很多不同的回答，我想结合自己的实验，希望各位老师能就我提出的问题说说自己的经验看法，给我启示，因为很多自己未做过，怕自己哪里操作不恰当而影响实验结果，非常感谢各位老师的不啻赐教！

首先，我做的是大鼠（体重约230-250g），模型是大脑中动脉栓塞，在不同的时间点取脑标本，准备做荧光实时定量PCR、Westernblot和冰冻切片，我提的问题主要是在于脑标本的取和存方面。

问题如下：

荧光实时定量PCR方面：

1、标本需要灌注么，有战友说不需要，你是怎么做的，有灌注的话什么溶液灌注，温度？

2、标本取下后液氮速冻，然后转-80度冰箱，这样保存一般可以多久？

3、抽提后的中RNA放-80度冰箱会很容易降解么，还是说要放液氮？

Westernblot方面：

4、标本用什么溶液灌注，温度？

5、同一个标本可以同时用于RT-PCR和Westernblot检测么？

（如果灌注手段一样的话）

冰冻切片方面：

6、灌注冲血用什么溶液，温度？

7、4%多聚甲醛灌注固定一般灌注多常时间？

多少毫升？

8、4%多聚甲醛后固定时间是多久为宜？

9、蔗糖梯度脱水，蔗糖是用什么配置的，PBS还是PB，浓度是多大的？

蔗糖梯度是15%到20%再30%么？

在每种浓度里沉底后就换另一种还是？

10、我试做过一次，做法为：

常规多聚甲醛灌注固定后，再多聚甲醛后固定过夜，然后30%的蔗糖脱水，这些都是用0.1M的PBS配的，结果发现蔗糖脱水3天了都还没沉底（中间换过一次蔗糖溶液）。

有战友提议可以切几块后脱水效果会更好，如果你有跟我做一样的模型标本，你是怎么处理的，如何切？

11、还有什么需要注意的地方或tips。

灌注冲血用什么溶液，温度？

用的是含有肝素钠的生理盐水。

每瓶500ml的生理盐水加入80mg的肝素钠，肝素钠要避光保存，而且必须使用前临时加入到生理盐水中。

肝素钠生理盐水需要用4度预冷。

我们用注射器推，大概推100ml，10min。

就可以将血液冲干净。

速度要自己掌握。

每支肝素钠每亳升含12500U，相当于100mg，用20ml生理盐水稀释，分装成40支，消毒备用（4℃贮存）。

临用时，注射器吸取肝素钠溶液一支，而后将肝素液来回抽动，使针筒局部湿润，多余肝素液全部排出弃之，注射器内死腔残留的肝素液即可抗凝。

纯的肝素10mg能抗凝100ml血液（按1mg等于100个国际单位，10个国际单位能抗凝1ml血液计）。

如果肝素的纯度不高，或过期，所用的剂量应增大2～3倍。

用于试管内抗凝时，一般可配成1%肝素生理盐水溶液，取0.1ml加入试管内，加热80℃烘干，每管能使5～10ml血液不凝固。

作全身抗凝时，一般剂量为：

大鼠2.5～3mg·

（200～300g体重）-1,兔或猫10mg·

kg-1,狗5～10mg·

kg-1。

一般多聚甲醛灌注20min，100ml。

标准是动物的尾巴会甩动，全身四肢收缩（这是因为蛋白变性所致），一般看起来像动物活过来了一样。

随后就可以将动物的头断掉，来取脑了。

这个不一定。

对于石蜡切片，可以固定很久。

但是对于冰冻切片，估计是隔夜或者24h。

但是先固定一晚上后再取出来，将不需要的大脑组织切掉，比如脑干、小脑等等。

擦干，放在蔗糖溶液里。

蔗糖用0.1M的PB配置。

我一般配20%和30%两个浓度。

我个人感觉每个浓度需要沉糖48h。

至少我发现24h是不够的。

沉糖必须完全沉底。

我不知道你是看哪个部位的表达。

如果是海马的话，我建议从前囟-1.40mm到前囟-6.30mm左右。

确实提的问题很多，看样子还是有所思考，值得赞扬，我也只能说出我个人的经验，讲几个大概的原则，具体细节还要你自己在实验中体会。

RT-PCE与WB都是分子生物学方面的实验，可以共用一个标本，一般不需要灌注，文献上都如此，需要新鲜的脑组织，液氮速冻，-80度保存，半年应该没问题，既然是MCA栓塞，那就要取MCA供血区域，嗅极后3-9mm，如果要分半暗带，园子里有类似的帖子，可查找。

至于不灌注，存留的血液可能会影响结果，我一般断头后用生理盐水把血液冲洗干净，然后再敲开露骨取脑，这样，效果会好些。

至于你的脑组织灌注固定，蔗糖脱水3天还没沉底，可能与脑组织太大及梯度脱水有关，我一般在脱水前用双面刀片沿冠状面将多余的脑组织休掉，20%蔗糖1天，30%蔗糖2天，总共3天就足够了，希望对你有帮助。

你在断头后用生理盐水把血液冲洗干净，然后再敲开露骨取脑，我想没通过灌注应该没办法冲掉脑内血管的血吧？

我现在取RT-PCR和WB的标本的做法是：

用临床上用的静脉留置针（相对会比较粗些，而且质软不会刺破血管）插到升主动脉快速灌注冰PBS50ml左右（一般1分钟内灌完），然后快速取脑放入液氮速冻，尽量缩短时间，不知这种做法是否尚可？

（个人觉得灌注后的脑标本相对未灌注的会好取些，视野感觉也更好，不会血淋淋的）

至于冰冻切片标本的灌注固定已经是按照你和甲醛版主的方法去做了，期待会有好的结果。

我也说两句冰冻切片，灌注用生理盐水还是PBS这个问题不是主要问题，主要作用在于你能否冲干净血管内的血液，而且一般观点认为灌注液最好在10分钟之内冲完（原因可能在于缺血后脑细胞在10分钟后会大量死亡），而且灌注液最好不要用冰冻的（原因有时候冰冻的液体也会使老鼠抽搐，造成你的判断失误）冲洗液的速度越快越好，量要适当控制，过量的话细胞会肿大，一般我们以肝脏变白为标准，如果还不放心的话，再稍微延长点时间，但是最好不要超过10分钟。

灌注时，有一点小技巧，就是把心脏稍微往大鼠的右边向上扭一点，以进针没有阻滞感为佳。

后固定我认为时间不宜太长，因为过多的甲醛会增加片子的背景颜色。

一般以6到12小时为佳。

还有一种方法就是当你的老鼠灌注的不好时，可以后固定以及脱水两个步骤一起进行。

这是别人介绍的，个人没有试过。

脱水我们一般是30%的蔗糖水（pbs配置）等它沉底了就可以切了。

脱水不好的话会使片子出现冰晶。

该切片了，其实切片时冰冻的过程是最容易出现冰晶的，我解决的办法比较简单就是速冻，让标本快速的变白。

但是问题也不要太低了，太低的话容易碎片，一般在-20左右，脑组织的话最好不要低于-35度。

另外大家可有去找找莱卡CM1850的冰冻切片机说明书，里面有详细的介绍切片过程。

其它类型的切片机我想原理也应当差不多。

弄明白了一台其它的也就相应的熟悉了。

灌注冲血可以用生理盐水、0.1M的PB0.01M的PBS都可以（注意调pH值）。

我们实验

室灌注的时候用常温的，我们认为冷的会引起血管收缩。

快速冲到肝脏变白或者右心耳

流出的液体变白为止。

多聚甲醛灌注固定速度先快后慢。

灌得好就会看到老鼠抽搐、四肢变硬。

如果只取脑，

可以夹住腹主动脉，这样灌注固定的快，而且省液体。

我们后固定和沉糖都在4度进行。

4%多聚甲醛和蔗糖溶液也是4度保存。

关于多聚甲醛灌注以后，确实对于石蜡切片可以固定很久，但是如果做组化的话，一般都是24小时，时间长的话，比如超过1周，可能抗原就会丢失，不容易出结果。

对于大脑：

灌注取脑后是继续放到4度多聚甲醛进行24小时后固定，24h之后进行蔗糖梯度脱水，那么下一步的保存，假如2天后已经沉底。

因为没有做过大脑，所以我的问题是：

第一：

蔗糖溶液是否需要和多聚甲醛溶液一样一般是20倍体积于组织？

第二：

这个时候的脑组织是否是和石蜡块里的脑组织一样，保存时间可以很长，会不会很快出现抗原丢失的问题。

第三：

保存的条件是什么，石蜡块可以室温，最好4度，甚至-20度。

但是其外面包有石蜡。

而大脑还是裸体的，我见到多用OCT包埋后。

那么是否必须包埋，不包埋的话该如何处理；

包埋之后是放到-20度，还是-80度，还是？

？

第四：

这样作出来的冰冻切片在做免疫荧光的时候，是否需要抗原修复吗？

我觉得是需要的，因为是多聚甲醛固定的吗，抗原都被封闭了。

但是没有做过，所以急切想听听大家的看法。

第五：

可否不进行灌注和固定，直接动物麻醉，断头处死，然后直接-80度冰箱，用的时候取出，OCT包埋，切完片子后丙酮固定5-10min啊，我做心肌组织的时候就是这样做的，结果非常好。

而且少了多聚甲醛固定这一步，就不用考虑抗原修复的问题了。

但是看文献上好像做脑的组化都进行了灌注固定，不知其中有何奥秘？