小鼠肝脏组织中ABCA1基因的检测与分析Word格式文档下载.docx
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2.3.2cDNA的合成过程……………………………………………………………6
2.3.3荧光定量过程…………………………………………………………………6
3结果与分析…………………………………………………………………………7
3.1RNA的提取的纯度分析…………………………………………………………7
3.2荧光定量的分析…………………………………………………………………7
3.3基因相对定量的结果……………………………………………………………9
3.3.1相对定量的实验结果…………………………………………………………9
3.3.2相对定量的结果分析…………………………………………………………9
4讨论………………………………………………………………………………10
4.1RNA提取操作中的常见问题……………………………………………………10
4.2cDNA合成操作中的注意事项…………………………………………………10
4.3PCR荧光定量的注意事项………………………………………………………10
5结论………………………………………………………………………………10
参考文献……………………………………………………………………………11
致谢…………………………………………………………………………………12
附录1相关英文文献………………………………………………………………13
附录2相关英文文献翻译…………………………………………………………23
摘要
本文运用RT-PCR方法从患有颈动脉粥样硬化的小鼠肝脏组织中提取总的RNA，然后合成cDNA序列，最后应用Real-timePCR法检测了服用不同时长的通心络药品的实验小鼠肝脏组织中ABCA1基因的表达情况。
通过研究表明，服用通心络可以增强小鼠肝脏组织中ABCA1基因的表达水平，并且药品的服用时长与ABCA1基因的表达水平的高低成正相关，进而得知通心络治疗颈动脉粥样硬化的作用机理。
小鼠肝脏组织中ABCA1基因的研究，可以为进一步探讨ABCA1基因变异有关的疾病的课题提供理论依据和基础。
关键词：
ABCA1；
Real-timePCR；
小鼠；
检测；
肝脏组织
ABSTRACT
Inthispaper,thetotalRNAisextractedfromlivertissueinmicewithcarotidatherosclerosisbyRT-PCRmethod.NextcombiningthesequenceofcDNA,theapplicationofReal-timePCRwasusedtodetectexperimentalmicelivertissueexpressionofABCA1gene,themicehadbeentakentongxinluodrugsindifferenttime.StudieshaveshownthattakingTongxinluocanenhancetheexpressionlevelsofABCA1geneinmouselivertissue,andthelengthofthedrugtakingtimeispositivelycorrelatedwiththelengthofABCA1geneexpressionlevel,thenlearnedthattongxinluo’smechanismforthetreatmentofcarotidarteryatherosclerosis.InvestigationofABCA1geneinmicelivertissuecanprovidetheoreticalbasisandfoundationforexploringthefurthersubjectofthediseasesaboutABCA1genemutation.
Keyword:
ABCA1;
Real-timePCR;
mice;
determination;
livertissue
刘芳
（天津农学院动物科学系）
1.前言
1.1ABCA1基因的作用及特点
ABCA1是到目前为止研究最多、最重要的促进胆固醇流出的细胞表面蛋白。
ABCA1是ATP结合盒转运子（ABC）超家族的成员。
人们证明了ABCA1基因的缺陷是Tangier病的病因,后来又发现ABCA1基因变异与家族性HDL缺乏（FHD）有密切的相关性[1]。
现在已经证实ABCA1的主要功能是作用于胆固醇的逆转运（RCT）。
随着对ABCA1基因的研究的不断深入,人们发现不仅在具有家族遗传病的人群中ABCA1的突变发挥作用,在普通人群中ABCA1单核苷酸多样性（SNP）也可导致ABCA1基因功能发生改变。
胆固醇的逆转运是外周组织通过血浆脂蛋白转将过多的胆固醇转运到肝脏并通过肝脏作用后排泄的过程。
人们对细胞内胆固醇的流出的过程和载脂蛋白在胆固醇流出过程中的作用早有认识,但对于ABCA1在胆固醇流出中作用的重要性是在后来才发现的。
由于人类ABCA1基因特殊的结构组成，以及其编码的ABCA1膜蛋白的特殊性，使得ABCA1不直接作用于胆固醇,而是转运磷脂。
磷脂被转运出去后,与细胞外的apoAⅠ形成复合物,胆固醇才能扩散出去,然后盘状的磷脂apoAⅠ复合物将其捕获,形成前β-HDL。
在卵磷脂胆固醇酯酰转移酶（LCAT）的作用下,转变成含有胆固醇酯（CE）成熟的球状HDL。
由于ABCA1可以促进细胞内胆固醇和磷脂转移至HDL前体apoAⅠ,因此ABCA1蛋白在RCT中起限速作用。
ABCA1活性也是血浆HDL细胞水平的一个重要的决定因素。
1.2ABCA1基因研究的目的和意义
ABCA1基因的启动子区SNP对ABCA1的表达起着重要的控制作用。
到目前为止,已经发现了90多个与疾病有关的ABCA1基因的变异或SNP位点,但是这些SNP在人群中的发生概率差异特别大，需要我们根据对ABCA1基因的结构特点以及与疾病之间的关系，建立致病机理进行差异性的研究，来解决这些疾病问题。
随着人们对ABCA1基因认识的不断深入,对于ABCA1所介导的RCT及基因多样性的研究将有助于研究人类的重大疾病——冠心病的发病机制,预测出疾病的临床表型,并指导差异化的临床治疗方案[2]。
由于目前来调节ABCA1表达的药物特别少，只有辛伐他丁，通心络少数药物,因此深入探讨ABCA1的功能及ABCA1表达的调控机制,对于未来开发和找寻对ABCA1表达有特异性作用的调控药物,起到预防、治疗高脂血症，AS，CAD等疾病，在人类健康方面具有特别重要的意义。
1.3基因检测及定量的基本原理
从真核生物的组织或细胞中提取mRNA或总RNA,通过用反转录酶合成cDNA第一链,聚合酶合成cDNA第二链,PCR转化扩增,即可获得cDNA文库,构建所得的cDNA文库可用于基因的结构、表达和调控的分析或比较cDNA和相应基因组DNA序列差异。
即是利用实时定量PCR和2－△△CT法分析基因相对表达量相对定量方法比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异，从而确定基因的扩增的效果。
1.4PCR扩增目的基因
1.4.1RNA的提取要求
基因分离是研究基因结构、功能、表达与调控的必需条件，同时也是进行基因治疗的重要条件。
首先是总RNA的提取，要获取正确的总RNA，提取总RNA所使用的基本材料必须选择合适。
因为在总RNA中的mRNA具有其明显的组织，细胞特异性。
因此，某组织，细胞材料选取不当，则不可能获得预期结果[3]。
组织细胞的选择除了种类的选择之外还有细胞状态的选择。
我们可以采用目的基因表达的刺激剂来促进细胞表达目的RNA，使其含量增加到期望值。
此外，在各种操作中应严格防止RNA酶污染。
1.4.2cDNA的合成
1.4.2.1cDNA第一链的合成条件
合成cDNA第一链的方法依赖于反转录酶来催化反应。
目前商品化反转录酶有禽类成髓细胞病毒（AMV）逆转录酶和鼠白血病病毒（MLV）反转录酶。
AMV反转录酶包含两个具有很多种酶活性的多肽亚基,这活性中包括依赖于RNA的DNA合成,依赖于DNA的DNA合成，对DNA:
RNA的杂交体的RNA进行内切降解（即RNA酶H活性）。
而MLV反转录酶只有单个多肽亚基,兼备有依赖于RNA与依赖于DNA的DNA合成酶活性,但是降解RNA:
DNA的杂交体中的RNA的能力比较弱,且较AMV对热的稳定性的反转录酶作用差。
MLV反转录酶能够合成较长的cDNA。
AMV，MLV反转录酶在利用RNA为模板合成cDNA时，其最适pH值、最适盐浓度、最适温室各不相同,因此在合成第一链时调整相应条件是非常重要。
但是AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有引物来引导DNA的合成。
而与真核细胞mRNA分子3"
端结合的核苷酸的oligo（dT）是cDNA合成最常用的引物。
1.4.2.2cDNA第二链的合成
cDNA第二链的合成方法有2种，自身引导法和置换合成法。
自身引导法，合成单链cDNA的3"
端能够形成一个短的发夹结构,这为第二链的合成提供了自身的引物,当第一链合成的DNA:
RNA的杂交链变性后能够利用大肠杆菌的DNA聚合酶ⅠKlenow片段或者反转录酶来合成cDNA第二链,最后用对单链有特异性的S1核酸酶来消化该环,即可进一步合成。
该方法能够容易造成错误故不常使用。
置换合成法，这种方法利用第一链在反转录酶的作用下产生的cDNA:
mRNA的杂交链不用碱变性,而是在dNTP存在的条件下,利用RNA酶H在杂交链mRNA链上制造成切口和缺口。
从而产生一系列的RNA引物,使其成为合成第二链的引物,进而在大肠杆菌的DNA聚合酶Ⅰ的作用之下合成第二链。
1.4.3PCR荧光定量特点及原理
1.4.3.1PCR技术的特点
PCR技术操作简便；
只要把扩增反应所需的特定程序输入到DNA自动扩增仪中，把所需要的全部反应材料混合均匀，放入仪器内，反应就会按照输入的正确的程序进行。
如果需要的话，还可随时加以调整。
该方法省时；
在基因的分离，突变体的构建，DNA的测序等方面，PCR方法均较常规方法快速得多。
跟常规的克隆，培养扩增，纯化的制备等步骤比较获得测序片段更加简便，省时。
灵教度高；
PCR方法可用于单一的双倍体细胞、一根头发、单一精子进行DNA定型。
特异性强；
由于TaqDNA聚合酶的耐高温性，导致反应中引物和模板退火的步骤可以在较高的温度条件下进行，结合特异性大大增强，被扩增的目的基因也保持很高的正确程度。
对原始材料质t要求低；
用石蜡包埋的组织切片，几千年前的出土文物，只需要经过适当的处理，都可用PCR技术进行扩增。
PCR技术应用范围广；
PCR技术可用于核酸结构和功能的研究各个领域[4]。
1.4.3.2实时荧光定量PCR技术的原理
实时荧光定量PCR技术,系指在PCR反应的体系中加入荧光基团,然后利用荧光信号的积累实时监测整个PCR的进程,最后通过标准曲线对未知的模板进行定量分析的方法[5]。
实时荧光定量PCR技术工作原理是在常规PCR技术的基础上添加了荧光染料或荧光探针。
而常规PCR的专门热循环仪具备可监测扩增时的荧光信号的荧光检测模块。
荧光染料具有特异性，它能够掺入DNA双链,发出荧光信号,未掺入的则不发出信号。
从而使得荧光信号的增加量与PCR产物增加量成正相关。
荧光探针法系指标记在探针的5′端荧光报告基团没被标记在3′端淬灭基团抑制时,报告基团的荧光信号可以被检测到。
而荧光信号的强度与反应产物的量正相关,也就是说DNA链每扩增出一条,就会有一个荧光分子形成。
实时荧光定量PCR技术定量原理是PCR循环数，扩增反应的荧光强度与反应管中扩增产物的量成比例关系。
由于扩增曲线有两个时期，分别是指数增长期与非指数平台期。
在指数增长期,PCR产物量在每个循环大约增加一倍。
随着反应的不断进行,反应体系中的成分被消耗,就会进入到平台期。
为了在指数期检测到PCR产物的量，需要扩增期PCR产物量与起始量存在一定的关系,才可以在指数期的来检测PCR产物的量,最后推断模板最初的含量。
设定一定的荧光信号域值。
如果荧光信号被检测到超出域值,就被作为真正的信号,便可以定义域值循环数Ct（C代表循环cycle,t代表域值threshold）。
Ct值是:
每个反应管中的荧光信号达到设定的域值时所要经历的循环数[6]。
研究证明,各个模板的Ct值与此模板的起始拷贝数的对数存在有线性关系,即起始拷贝数越多Ct值越小。
公式表示:
Ct=-klogX0+b（X0是原始模板数）。
利用已知的起始拷贝数的标准品来做标准曲线,只要获得未知的样品的Ct值,便可从标准曲线上得到此样品的起始拷贝数目。
1.5实时荧光定量基因检测方法的应用
随着基因的诊断技术不断发展与成熟,在临床中基因诊断的地位显得更为重要。
实时荧光定量PCR（real-timefluorescentquantitativepolymerasechainreaction,real-timeFQ-PCR）技术于1996年被美国AppliedBiosystems公司推出后，由于此技术不仅实现了PCR技术从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR技术相比较它所具有的特异性强，灵敏度高，重复性好，定量准确，自动化程度高，速度快，全封闭反应等优点使该技术很快成为科研，临床诊断的热点技术[7]。
目前已得到了很广泛的应用,包括mRNA表达的研究，各种基因的定量分析，点突变的分析和等位基因的分析，单核苷酸多态性的分析，DNA甲基化的检测以及对各种传染病进行定量定性的分析。
1.6ABCA1基因研究的现状及发展趋势
到目前为止,已经发现90多个与疾病相关的ABCA1基因变异或者SNP位点,而这些SNP在人群中的发生率差异很大。
于是人们从ABCA1基因位点和药物治疗方面进行了该基因的研究。
在ABCA1基因位点方面，对于ABCA1基因的报道已经有R219K型的ABCA1与HDL-C的水平的升高或者动脉粥样硬化（AS）的发生下降趋势呈正相关。
通过对R219K的深入研究已经解决了很多与SNP研究方面相关的问题。
也有研究表明I883M型的ABCA1可以提高HDL-C，降低TG水平，可以导致心脏事件的发生。
但是对于此类研究仍有特别大的争议,因为该基因研究时需要特别大的样本的支持,因而目前对其的认识尚不成熟。
在CAD患者的研究方面，有人表明R219K型ABCA1基因的多态性中,R219K等位基因和家族性的高胆固醇血症患者TG水平的降低和HDL-C水平的增高相关,有可能对家族性高胆固醇血症患者的不早发CAD起到保护作用。
在Tangier病家族中，中外的研究有所差异，可能是与种族差异有关。
需要我们日后进行试验来解决。
在研究药物方面，他汀类降脂药物的作用机理是有效减少血浆总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇减少CAD患者的死亡率[8]。
目前如何通过提高HDL-C水平来进一步减少CAD的发生是个热门的研究内容。
1.7本研究的目的和意义
ABCA1基因测定与分析是研究ABCA1基因的作用功能以及其与各种遗传疾病关联度的基础。
本文运用RT-PCR方法从小鼠肝脏中提取总RNA中克隆了ABCA1基因的cDNA的序列，然后运用Real-timePCR法检测了ABCA1基因的扩增效果，从而确定患有颈动脉粥样硬化的小鼠在服用不同时长的通心络之后ABCA1基因表达水平的变化，为进一步研究与ABCA1基因有关的疾病的课题提供理论依据和基础。
2材料与方法
2.1试验的时间、地点
2.1.1实验时间
2013年10月至2014年1月
2.1.2实验地点
动物分子育种与转基因创新中心
2.2实验材料与器材
2.2.1样品的选取
将患有颈动脉粥样硬化的1，2，3，4号四只小鼠作为实验样品。
其中1号小鼠不做任何处理当做空白对照，2，3，4号小鼠分别服用通心络（1g/kg.d，1次/d）1周，2周，4周。
取其新鲜的肝脏组织，标注为1，2，3，4，每30-50mg组织在液氮中充分研磨，也可以加入1mlTotalRNAExtractor，用匀浆器匀浆处理。
样品体积一般不要超过TotalRNAExtractor体积的10%。
2.2.2主要仪器
一次性手套，口罩，坩埚，坩埚棒，基因枪，枪头，酒精棉，玻璃器皿，干燥烘箱，离心机，电泳仪，试管，水浴锅，定量PCR仪：
LightCycler480SoftwareSetup（Roche罗氏）。
2.2.3主要试剂
液氮，氯仿，异丙醇，75%乙醇，甲酰胺，焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液，蒸馏水，总RNA提取试剂盒，反转录酶，大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片，S1核酸酶，cDNA合成试剂盒，TRIzol试剂，无水乙醇，DEPCH2O,定量PCR试剂：
ABISybrGreenPCRMasterMix（2X），UltraSYBR二步法荧光定量PCR试剂盒。
2.3主要试验方法
2.3.1RNA的提取过程
此过程是在总RNA提取试剂盒的基础上进行的，分别取小鼠1，2，3，4新鲜组织，置于-20度预冷的无菌无RNA酶的研钵中，迅速倒入液氮降温，并同时快速将组织研磨成粉末状；
接着向研磨好的组织中加入1MLTRIZOL待其溶解后，迅速移至1.5ML离心管；
进行离心，条件是4℃12000rpm下运行10min，取上清；
紧接着加入0.5ml异丙醇，混匀，冰上静置20-30min。
再在4℃12000rpm下离心10min，弃上清；
加入1ml75%乙醇，洗涤沉淀。
4℃，7500rpm的条件下离心5min，弃上清；
室温放置晾干或超净台中吹干5min左右，加入适量的Rnase-freeH2O溶解，充分溶解RNA。
可将所得到的RNA溶液置于-70°
C保存或用于后续试验。
2.3.2cDNA的合成过程
cDNA的合成需要两步，第一步为cDNA第一链合成即在0.2mlPCR管中加入如下试剂：
分别取5l的上述提取的1，2，3，4的totalRNA；
1l的RandomPrimerp（dN）6（0.2g/l）；
5l的Rnase-freeddH2O（cDNA合成试剂盒中的物品）。
在70°
C温浴5min后冰浴10s，接着离心时加入下列试剂：
4.0l的5*ReactionBuffer；
2.0l的dNTPMix（10mmol/L）；
1.0l的Rnaseinhibitor（20U/l）；
2.0l的AMVReverseTranscriptase（10U/l）；
20.0l的Totalvolume（cDNA合成试剂盒中的物品）。
再在37°
C温浴5min；
42°
C温浴60min；
70°
C温浴10min。
终止反应；
收集cDNA在-20℃保存，接着进行实时荧光定量PCR[7]。
2.3.3荧光定量过程
首先要应用PCR反应体系（20ul）配置反应混合液，具体试剂如下：
10ul的2×
UltraSYBRMixture；
1ul的ForwardPrimer；
1ul的ReversePrimer；
1ul的TemplatecDNA最后加RNase-FreeWater到20ul。
其次进行PCR循环条件，如下表：
表1：
PCR循环条件
ThermalCycler
TimesandTemperatures
LightCycler480SoftwareSetup（Roche罗氏）
InitialSteps（HOLD）
Melt（40cycles）
Anneal/Extend（40cycles）
3min95℃
15sec95℃
40s60℃
资料来源：
UltraSYBR二步法荧光定量PCR试剂盒说明书
最后是进行仪器的操作，将完成上述步骤后，把加好样品的孔板放在LightCycler480SoftwareSetup（Roche罗氏）中进行反应。
3.结果与分析
3.1RNA的提取的纯度分析
在进行完RNA的提取操作后需要进行其纯度的分析，以便之后实验的正常进行，电泳检测-RNA电泳结果如下图：
图1RNA电泳图
在RNA电泳中条带比较清晰，且在28s这条电泳带比18s电泳带亮度多，说明总RNA提取纯度较高，适宜接下来cDNA的合成。
3.2荧光定量的分析
根据引物序列（PrimerPremier5.0软件设计）以及管家基因（GAPDH）引物序列：
M-Gapdh-F：
5'
GGTTGTCTCCTGCGACTTCA3'
58.2
M-Gapdh-R：
TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC3'
58.2；
扩增产物的序列大小为183bp
目的基因引物序列：
M-ABCA1-F:
5'
GTTTGACGCCATCACAGAGC3'
58.6
M-ABCA1-R:
CAACCTTGCCAACTTCCTTTT3'
58.9；
扩增产物的序列大小为95bp
进行适当的实验步骤的优化和改进后，通过PrimerPremier5.
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