生物工艺学复习资料往届整理汇总Word下载.docx
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快速利用碳源的分解产物抑制了产物形成的关键酶
生产上采取的方法：
（1）缓慢利用碳源的使用
（2）流加葡萄糖（3）用混合碳源
氮源：
（1）种类：
有机、无机
（2）作用：
构成细胞构质，含N代谢物
（3）不同氮源差别①有机氮源
②无机氮源与有机N相比，更容易被微生物吸收
1°
生理酸性物质：
经微生物生理作用，能形成酸性物质的无机氮源
2°
生理碱性物质：
经微生物生理作用，能形成碱性物质的无机氮源
无机盐及微量元素：
（1）作用：
为微生物生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物。
一般低浓度时，对微生物合成产物促进，高浓度对微生物合成产物形成抑制。
（2）各元素作用①P：
核酸和蛋白质必要成分，ATP，代谢调节
②Ca：
细胞透性
③Mg：
多数酶激活剂，芽孢的重要成分
④S：
含硫AA的组成和某些酶（CoA）活性剂
⑤Fe：
细胞色素，细胞色素氧化酶和过氧化酶成分
⑥Cl：
啫盐菌必需，改善啤酒味
⑦Na+，K+：
Na维持渗透性，K渗透压和透性
⑧微量元素：
酶的辅基和激活剂，机体对其需求很少
前体：
某些化合物加入到发酵培养基中可直接被微生物合成中结合到产物中去，而其自身的结构并没有多大变化，但产物的产量却因加入前体而有较大提高。
促进剂：
非常营养，非前体物，却能提高产量的添加剂。
抑制剂：
发酵中加入抑制剂会抑制某些代谢途径进行，同时使另一代谢途径活跃，从而获得人们所需的某种产物，或使正常代谢的某一中间代谢产物积累起来。
生物素、VB1、提供成长因子的农副产物
培养基配置原则：
（1）营养物质应满足微生物需要；
（2）营养物浓度及配比应当适当；
（3）物理化学条件合适；
（4）根据培养基的目的。
培养基种类：
（1）天然培养基：
凡利用生物的组织、器官及其他抽取或制品配成的培养基。
优点：
配制方便，经济，营养
缺点：
化学成分不清楚或不稳定
（2）合成培养基：
使用成分完全了解的化学药物配制而成的培养基。
优点：
成分已知，精确，重复性好
价格昂贵，培养微生物生长较慢
（3）半合成培养基：
由部分天然材料和部分已知的纯化药物组成的培养基。
（4）液体培养基：
各营养成分按一定比例配制而成的液体状态或水溶液状的培养基。
（5）固体培养基：
液体培养基中加入一定量的凝固剂配制而成的固体状态的培养基，此外，固体营养物与水和盐等混合构成的疏松状培养基也属于固体培养基。
理想固体培养基凝固剂条件：
1、不被微生物液化、分解和利用
2、在微生物生长的温度范围内保持固体状态，凝固点温度对微生物无害
3、不会因消毒、灭菌而破坏
4、配制方便，价格低，透明性好
（6）半固体培养基：
指琼脂加入量为0.2~0.5%而配制的固体状态的培养基
（7）种子培养基：
是为下一步发酵提供数量较多、强壮而整齐的种子细胞。
一般要求氮源、维生素丰富、原料要精
（8）发酵培养基：
碳为主要元素，用于生产预定发酵产物的培养基
（9）繁殖和保藏培养基：
用于菌种保藏，采用斜面培养基
（10）基本培养基：
满足某种野生型菌株最低营养要求的合成的培养基
（11）加富培养基：
普通培养基加入血、血清、动植物组织液或其他营养物，用于培养某种或某些营养要求苛刻的异样型微生物或选择性培养（分离、富集）某种微生物使本身大量繁殖，其他菌受抑制。
（12）选择性培养基：
根据微生物某种对特定营养要求或物化条件，利用此根据把某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。
（13）鉴别培养基：
一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼判别颜色就能方便地从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。
种子扩大培养
将休眠的生产菌种经斜面培养基活化，经扁平或摇瓶及种子罐逐级扩大数量，至一定数量和质量的纯种的过程。
种子培养任务：
保持生产菌种的优良生产性能，得到比较纯净的种子，菌健壮，还要有足够的量，以供大规模生产用，好坏关系到产物产量和质量。
生产菌种的基本要求：
一个发酵产物可有多种生产菌，但产生菌不等同于生产菌，作为生产菌要有一定条件和要求
产生菌：
可产出所需代谢产物的菌生产菌：
用于生产所用的产生菌
（1）高产稳产性能、合成能力高，遗传性相对稳定，菌种不衰退，难变异；
（2）要求粗放，较易培养，生长繁殖较快，可利用比较多的原料，比原料要求经济易得；
（3）非病原菌，对发酵操作如此，且发酵产品用于食品、医药有很大部分，用于此类的菌还要求不产生毒素；
（4）最好能耐受自身代谢产物，最好是可耐高低温，可耐高温则热天可生产，省下冷却水，最好可耐酸、碱，产泡沫少，泡沫多需消耗消泡剂多，产品提炼困难。
发酵生产方法的类型
按发酵过程状态分：
（1）间歇①培养基的加入和发酵液放出是一致的
②发酵一次一次进行
（2）连续①培养液加入到放出是连续的
②培养罐中处于稳定状态
（3）半连续发酵：
培养基连续加入发酵液分批或分别放出
分批发酵
一封闭系统内含有初始限量基质的发酵方式。
环境在发酵过程中不断变化。
物理、化学、生物参数都随时间而变化，是一个不稳定的体系。
操作简单，操作引起染菌的概率低，不会产生菌种老化和变异等稳定。
缺点：
非生产时间较长，设备利用率低。
连续发酵
培养基料液连续输入发酵罐并同时放出含有产品的相同体积发酵液，使发酵罐内料液量维持恒定，微生物在近似恒定状态（恒定的基质浓度、恒定的产物浓度、恒定的PH、恒定菌体浓度、恒定的比生长速率）下生长的发酵方式。
能维持低基质浓度，可提高设备利用率和单位时间产量，便于自动控制。
菌种发生变异可能性大，要求严格的无菌条件。
半连续（补料分配比）发酵
在发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。
使发酵系统中维持很低的基质浓度和连续相比，不需要严格的无菌不产生菌种老化、变异等问题。
存在一定的非生产时间和分批发酵比，中途要流加新鲜培养基，增加了染菌的危险。
类型：
（1）补料方式：
连续流加、不连续流加、多周期流加
（2）补料成分：
单一组分流加多组分流加
（3）控制方式：
反馈控制、无反馈控制
发酵过程的动力学类型
发酵动力学：
各种发酵中变量在活细胞下变化规律，以及各种条件对变量变化速度的影响，以数学、工程学的原理定量描述。
产量常数=产物的量/基质的量=Z/S
类型Ⅰ类型Ⅱ类型Ⅲ
（一）类型Ⅰ乳酸发酵
1、特点：
①菌生长的比碳源消耗速率Mc比，产物形成速率Mp都有一个高峰；
②三个高峰同时出现，基本平行；
③产物和碳源消耗有一定的化学剂量关系，可进行理论计算。
2、产物类型：
菌体、代谢产物、次级代谢产物
（二）类型Ⅱ谷氨酸发酵
①分为两个时期：
菌体生长期、产物形成期；
②c源利用的比速度有两个高峰，在产物形成期菌株第二次生长；
③c源利用和产物形成无明确的化学剂量关系，但还是有一定关系。
①在产物形成时有中间产物积累
②无中间产物积累
（三）类型Ⅲ大多次级代谢产物（抗生素）
①分为两个时期，但产物形成比类型Ⅱ早，在菌体接近或达到最大值时产物开始生长；
②菌体生长碳源利用无第二个高峰；
③c源利用与产物形成无量化关系，为次级代谢产物，产物量占发酵液0.1~2%。
①将预知某个发酵按什么情况进展
②作为发酵的中间产物控制的理论基础，实践上指导生产、监督生产
③连续发酵的设计上，（Ⅰ）用于单级，（Ⅱ）（Ⅲ）用于二级以上使菌体生长和产物形成都得到保证
连续发酵动力学
连续发酵优点：
1、提高了生产率，罐利用率上升，减少菌的非旺盛生长期
2、便于管理控制
T温度对发酵的影响及其控制
一、影响发酵温度的因素
（1）产热因素：
生物热，搅拌热
（2）散热因素：
蒸发热，辐射热
生物热
分解营养物释放出大量能量
用途：
高能化合物，生长代谢，热量散发
影响因素：
利用营养速率越大，培养基成分越丰富，旺盛期，呼吸强度
发酵热的测定：
（1）冷却水流量，进出口温度；
（2）罐温自动控制，罐温达到恒定再关闭，测温度随时间上升的速率。
二、温度对发酵的影响
1、T低，反应速度低，周期长
2、T高，反应速度低，但菌易衰老，影响产量
3、菌合成与产物合成温度要求不同
三、影响途径
1、影响各种酶的反应速率和蛋白质性质；
2、影响发酵液物理性质；
3、影响生物合成的方向。
四、最适温度的确定：
在该温度下最适干菌的生长或发酵产物的生成。
五、温度的控制发酵罐：
夹套（10立方米以下）、盘管（10立方米以上）
微生物的耗氧量及氧的供给
影响：
生长代谢、改变代谢途径
需氧量与以下因素有关
（1）菌种特性
（2）生理状态（3）培养基成分与浓度（4）细胞浓度（5）温度
氧的溶解度：
25℃1atm氧气水1.26mmol/l
25℃1atm空气水0.26mmol/l
25℃1atm空气发酵液0.20mmol/l
氧的传递：
（1）搅拌成为细胞，阻力有培养液和微生物细胞
（2）氧不足，微生物缺氧窒息
（3）耗氧，溶氧要平衡
（4）溶氧低于耗氧，氧下降生长受影响
溶氧速率：
单位体积的培养液在单位时间里溶耗的氧量，单位mM/l.h
提高培养液溶解氧速率常用方法：
1、提高氧分压
（1）通入的空气中掺入纯氧
（2）提高罐压；
2、提高氧的吸收速率（最重要的一种方法）
（1）搅拌，适合细菌生产
（2）提高通气量，带走液体水分使发酵液浓缩；
3、降低培养液粘度，粘度越大，就湍流下降，液膜变厚，气泡越稳定性；
4、降低培养液温度，在允许的条件下降低，可增加溶解速率；
5、添加某些物质增加溶氧。
表面活性剂可增加溶氧，但不得对菌生长产生影响，不使产物提纯度难，要经济；
6、与培养液液柱体积有关。
PH值、二氧化碳、基质浓度对发酵的影响
PH影响及控制
背景
（1）菌类在一定的PH内繁殖代谢
（2）发酵过程中PH变化。
外界变化不大时，菌本身可以调节，但有限
引起PH下降的因素：
（1）CN比C过多，中间补空气溶氧不足
（2）消泡油过多
（3）生理酸性物存在，氨被利用
引起PH上升的因素：
（1）CN比N过多，AA释放
（2）中间补料中氨水或尿素等碱性物加入过多
（3）生理碱性物质过多
PH值控制：
（1）培养基的配比
（2）中间补料控制PH值，补Glc或补氨水、尿素
（3）PH电极控制加补料或酸、碱来控制PH
二氧化碳和呼吸商
RE＝CER／OUR
CER：
二氧化碳释放率RQ：
呼吸商OUR：
菌的耗氧速率
对发酵影响：
（1）对菌体有抑制作用微生物的糖代谢和呼吸率下降，对产物合成影响着具体产品，多为抑制，少为促进
（2）对发酵的促进作用半链球菌发酵生产多糖
（3）影响发酵液酸碱平衡
控制：
通常通过调节痛通风和搅拌来控制
基质浓度对发酵影响及补料控制
补料：
（1）采用丰富培养基，成分全，浓度高达10~15%
（2）补料：
在发酵过程中，中途补加的料液，补偿作用
（1）控制营养物质浓度控制菌生长速率，不致太快衰老，自溶推迟，达到增加合成时间，提高产量作用
（2）作为控制，扭生异常发酵的手段
（3）增加发酵液的总体积
泡沫的产生影响、控制
产生：
通气搅拌，代谢气体逸出，培养基中糖、蛋白质、代谢物等表面活性剂促进
（1）降低装料系数；
（2）增加菌群非均一性；
（3）增加染菌机会；
（4）产物损失；
（5）消泡剂的加入增加提取困难。
机械搅拌、消泡剂、分散剂
发酵终点的判断：
（1）放罐时间晚，菌自溶，延长过滤处理时间，产物不稳定；
（2）放罐时间早，残留过多养分，不利提取；
（3）缩短发酵周期，可提高总得生产率；
（4）放罐前，补料慎重。
生产率（kg/m3h）得率（kg产物/kg基质）发酵系数（kg产物/罐容积m3发酵周期h）
污染的防止与挽救
污染：
微生物发酵为纯种发酵，如有其他菌侵入称为污染（杂菌污染、噬菌体污染）
杂菌污染的防治与挽救
表现：
（1）生产菌生产受抑制，测OD值，菌浓度下降；
（2）C、N消耗加速，PH值的不正常变化；
（3）泡沫一般增多，粘稠颜色加深，使培养液发酵发臭；
（4）发酵周期缩短，产量下降。
1、产物产量
2、影响产物提炼，使产物质量不得保证，如溶媒存在，使培养液乳化，不易分层
①有机溶剂萃取工艺；
②离子交换工艺
3、对产品质量的影响（内在质量和产品外观）
4、对过滤的影响粘度提高，菌体大多自溶，发酵不彻底，基质的残留浓度
影响设备的周转使用，破坏生产平衡，大幅度降低过滤吸率
5、染菌对三废处理的影响
与危害程度相关的几个方面
1与产品的品种有关，酒精和丙酮丁酸较小，AA破坏严重
2染菌与发酵周期有关，发酵周期长，较易染菌，如前中期染菌后果较严重
3染菌类型时间越早、量多，危害越大
④染菌原因：
公共系数引起染菌，影响面大，后果严重，公共系数为空气，总过滤器，空气管道不严密、公共补料系数、公共系统染菌就会引起连续染菌、大面积染菌。
发酵过程染菌的检查判断
检查方法：
①显微镜检查②平板划线检查③肉汤培养检查
检查中注意事项：
（1）检查结果以AB结果为主要根据
（2）做三个平行样
（3）定期取样
（4）放罐后12h，确定为无菌时方可弃去
（5）取样时防外界杂菌混入
引起染菌的主要途径和原因
生产环节
1、种子培养阶段可能染菌
①生产菌种在保存、转移时
②种子扩大培养，种子罐可能染菌，培养基带菌
防治方法：
抗污染强的菌株，定期进行分离，严格无菌操作，培养基首先要进行无菌试验，种子本身也要无菌试验。
2、培养基要求灭菌彻底，培养基尽量不能破坏，灭菌过程中培养基要达到预定体积，培养基灭菌后泡沫不可太多。
培养基灭菌方法：
连续灭菌（优点：
高温、短时间、培养基破坏小）、实罐灭菌、空消
培养基灭菌的几个环节易造成染菌的：
①冷空气排除不彻底造成假压，有空气混入水蒸汽（三路进气：
列管、排料管、进空气管）
②防止蒸汽走短路，由于空气走阻力小的管路
③负压抽吸，无菌空气保压
④泡沫过多（由于其传热性差，使其中杂质保留）
3、空气系数过滤系统出问题，主要是过滤介质失效
4、设备渗透安装不当，有死角存在
情况分析
1、杂菌类型
染芽孢：
设备死角，使芽孢存活，培养基不彻底
染霉菌：
培养基灭菌不彻底
染球菌：
大部分从空气来，主要是空气过滤系数失效
染G-：
大部分从水中来，是由于设备的渗透
2、染菌规模
多罐：
同时，同类型——公共系统染菌
单罐连续——大多设备问题，染菌时间会往前推
偶然染菌情况较复杂，几种情况都可能，偶尔单罐染菌，操作不慎引起
3、从染菌时间来分析
（1）早期：
可能是种子罐培养基灭菌不彻底，设备渗透，管道有死角，操作不慎，染菌防治，以防为主；
（2）应把染菌的位置时间和染菌的类型等各种现象加以综合分析，才能正确判断从而采取相应的对策和措施；
（3）严格无菌操作，加强对染菌的检测。
发酵染菌的原因及防止
1、种子带菌的原因
①无菌室的无菌条件不符合要求；
②培养基灭菌不彻底；
③操作不当。
2、种子带菌的防止
种子带杂菌是发酵前期染菌的主要原因之一
每次接种后，取少量的种子悬浮液进行平板检测，肉汤培养基说明是否染菌
染菌后的挽救措施
种子罐染菌：
先灭菌再倒灌，再空消取用备种或倒种
发酵罐染菌：
根据染菌时间不同采取相应的方法
前期染菌：
染菌危害不大，采取补种方法，使生产菌在发酵罐中占绝对优势
染菌危害大，先补加营养再重新灭菌，再接种
染菌危害极大，先放掉一部分发酵液，新配培养基加入，先灭菌接种，再发酵
中后期发酵：
①用降低罐温，调PH，改变通气量，降低染菌繁殖发酵；
②对分法，降低染菌数量及有害物质浓度；
③加抑菌体、杀菌剂，如抗生素、添加量根据实验来定；
④提前放罐提炼杂菌会分解产物情况下，可加磷、玉米浆，让菌加速代谢，提前放罐。
噬菌体的污染防治
比染菌要严重得多，极其普通
①其个体极小，过滤介质都易受之污染，甚至厌气性发酵也会受之污染；
②其繁殖快，引起生产菌大量裂解，子代数量大；
③会产生发酵侵染噬菌体的恶性循环，可能引起整个车间连续倒灌。
污染途径：
①溶源菌为生产菌，其感染的温和噬菌体，在转移中，由于条件的改变，可能发生变异，可能变为裂解性或烈性噬菌体，从而引起危害
②感染的三个基本条件：
环境中有噬菌体，环境中有活菌体，要有接解条件
工厂周围一般都有噬菌体，通过气流、尘埃、人车来往，因而可能从生产的各种环节中侵染
环境中活菌体，随排气，从泡沫中排出，倒灌中取样口，洗罐液中
预防方法：
①消灭噬菌体，检查出噬菌体，对周围环境普查，琼脂平板，生产菌为指标菌，检查噬菌斑。
有威胁时，经常检查种子液、发酵液是否正常
倒灌前要灭菌，洗罐取样要集中在一个地方，废气也要药物处理
②选育抗噬菌体的菌株
注意：
（1）耐受性因变异而消失
（2）噬菌体变异
③采取专一性不同的生产菌株
选噬菌体不侵染的种，噬菌体侵染特性不同的菌株
④采取药物防治的办法
在生产已受到噬菌体的威胁和侵染时，可采用药物防治，螯合剂、表面活性剂、抗生素、聚胺类
挽救方法：
种子罐：
重消→倒罐→空消
前期：
补料→重消（温度可低一点80~90℃）课接入抗性菌株
中后期：
加热处理再提取，适于产物耐热
耐热，药物处理染了噬菌体都要灭菌，最好用甲醛熏蒸
氨基酸工艺学
氨基酸发酵工业是利用微生物的生长和代谢活动生产各种AA的现代工业。
氨基酸发酵代谢控制
（1）控制发酵条件
（2）控制细胞渗透性（3）控制旁路代谢（4）降低反馈作用物浓度
（5）消除终产物的反馈抑制与阻遏作用（6）促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合成
谷氨酸发酵机制
（1）菌体代谢调节机制；
（2）细胞膜通透性的特异调节；
（3）菌种选育模型与控制方法。
谷氨酸生长水平好坏有关因素：
（1）菌种、工艺、设备条件协同配合
（2）正常条件下，菌体产生谷氨酸在发酵液中为1mg/ml（1%）
（3）谷氨酸代谢调节，细胞膜透性调节与环境条件协调配合
谷氨酸生物合成途径
（1）二氧化碳固定1Glc~1Glc81.7%
（2）乙醛酸循环1.5Glc~1Glc54.4%
包括EMP、HMP、TCA、DCA（乙醛酸循环）、二氧化碳固定
谷氨酸合成的理想途径：
（1）产生菌必须具备（内在因素）
①a-kGAC脱氢酶活性微弱或缺失
②谷氨酸产生菌体内的NADPH的氧化能力欠缺或丧失
③DCA关键酶—异柠檬酸裂解酶
④菌有强烈的谷氨酸脱氢酶活性
体系中存在二氧化碳固定反应，二氧化碳酶需Mn离子，培养基中加入微量Mn离子
生物素：
由一个噻吩环和一个脲基构成的双环化合物，作为羧基的载体在多种酶促催化反应中接受和供出羧基
提高生产能力具体表现：
①强化二氧化碳固定，具体措施，控制好Mn离子和生物素浓度
②控制溶氧浓度
氨导入：
还原氨基化反应为主导
（2）外在因素
1、生物素对GA发酵的影响：
①参与糖代谢，影响糖降解速度，不影响EMP、HMP比率
②控制生物素浓度，以实现对DCA的封闭
当生物素缺乏时：
①PEP有氧氧化就会减弱，则乙酰辅酶A的生成就会少，醋酸浓度降低，它的诱导作用降低；
控制生物素，异柠檬酸裂解酶活性消失；
②生物素对TCA的促进作用下降，使琥珀酸上升，阻遏作用加强。
乙醛酸循环基本上是封闭的，代谢流向异柠檬酸→a-kGAC→谷氨酸，两者作用使异柠檬酸丧失，DCA封闭；
③生物素对氮代谢的影响。
生物素丰富时，出现“只张菌，不产酸”现象，GA发酵中晚期，一定量的生物素是必须的，但在产物合成期，则要限制生物素浓度，以保证产物正常合成。
生物素缺乏时，铵离子影响N代谢速度
生物素丰富时，铵离子不影响N代谢速度
④生物素对菌的细胞膜通透性，生物素是菌体合成细胞膜的必需物
2、供氧浓度：
低，需氧发酵；
高，NADPH氧化，产物少。
3、铵离子浓度①PH②产物形成低，不利于a-kGAC还原氨基化；
高，产生Gln
铵离子的供给体：
液氨、流加尿素
4、磷酸盐过量①促EMP，积累PEP，产生乳酸；
②产生并积累缬氨酸
缬氨酸①抑制Glc→PEP，使GA的生物合成受到阻止；
②消耗了PEP，降低了糖酸化；
③缬氨酸严重影响了GA结晶提取。
谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养
谷氨酸生产菌的主要特征与菌学性质
现有葡萄糖生产主要是四个属：
短杆菌属（短杆菌科），棒杆菌属、小杆菌属、节杆菌属（棒杆菌科）
现有谷氨酸生产菌的主要特征：
1、细胞形态为球形，棒形以至短杆
2、G+无芽孢，无鞭毛，不能运动
3、都是需氧型微生物
4、都是生物素缺陷型
5、腺酶强阳性
6、不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白及明胶等
7、发酵中菌体发生明显的形态变化，同时发生细胞渗透性的变化
8、、二氧化碳固定酶系活力强
9、异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，乙醛酸循环弱
10、a-酮戊二酸能力缺失或微弱
11、还原性辅酶Ⅱ进入呼吸链能力弱
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