三氧化二砷对骨髓瘤细胞系U266抑制增殖及诱导凋亡的机制研究Word文档格式.docx

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U266cell;

cellsapoptosis;

caspase3;

hTERT

多发性骨髓瘤是一种以骨髓中单克隆浆细胞恶性增殖并分泌大量单克隆免疫球蛋白为特征的浆细胞肿瘤，多引起广泛骨质破坏、反复感染、贫血、高钙血症、高粘滞血症、肾功能不全等一系列临床表现。

目前，MM仍无法治愈。

近几年来国内外研究报道，三氧化二砷在复发和难治性MM的治疗中取得了可喜的疗效。

相关基础研究也发现，As2O3在体外通过使细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子P15、P16和P21重新表达或表达增强，下调癌基因cmyc的表达以及影响黏附分子表达等多种机制影响骨髓瘤细胞增殖周期，促进其凋亡并影响其归巢。

但是，As2O3对骨髓瘤细胞的作用机制尚未完全清楚［1-6］。

因此，我们以骨髓瘤细胞株U266为体外模型，探讨As2O3对骨髓瘤细胞的作用及相关机制。

材料和方法

材料和试剂

As2O3为黑龙江伊达药业公司产品，用注射用水稀释至1×

103μmol/L的储存液，使用时用RPMI1640培养液稀释至工作浓度。

MitoCaptureMitochondrialApoptosisDetectionKit购自美国Biovision公司。

实验中使用的单克隆抗体及二抗均购自SantaCruzBiotechnology公司。

骨髓瘤细胞株U266由上海第二军医大学附属长征医院血液科侯健教授惠赠。

U266细胞培养于含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的孵箱中培养。

取对数生长期细胞用于实验。

As2O3对U266细胞生长影响的MTT法检测

将不同浓度As2O3处理48小时及一定浓度的As2O3处理不同时间后的样本置于酶标仪上检测波长492nm的吸光度，每组设6个平行孔，以对照组细胞增殖率为100％，按下述公式计算细胞增殖率。

细胞增殖率＝×

100%

细胞凋亡的DNA凝胶电泳检测

调整U266细胞浓度至2×

105/ml，加入As2O3使终浓度为2μmol/L，作用0、24、48、72小时后，将5×

105细胞移入无菌的mlEppendorf管中，4℃2000r／min离心5分钟，弃上清。

加入20μl溶解缓冲液，用移液管尖混匀细胞沉淀。

加10μlRNA酶A（500U/ml），轻弹管尖混匀。

37℃孵育90分钟。

加10μl蛋白酶K（20mg/ml），轻弹管尖混匀，50℃孵育过夜。

样品于20g/L琼脂糖凝胶，25V，电泳3小时后，在凝胶成像系统中成像观察。

细胞凋亡的流式细胞术检测

收集细胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液接种于25ml培养瓶，细胞浓度为2×

105/ml，加入As2O3使终浓度为2μmol/L和5μmol/L，空白对照组只含培养液，处理0、24、48、72小时后，收集处理后细胞，计数，然后按MitoCaptureMitochondrialApoptosisDetectionKit试剂盒说明书进行操作后,立即送流式细胞仪检测。

hTERTmRNA表达的RTPCR检测

收集2μmol/LAs2O3不同时间处理组细胞，提取总RNA,按照Promega公司反转录试剂盒说明书合成cDNA。

hTERT基因及内参βactin基因扩增引物由上海生物工程有限公司合成。

hTERT基因上游引物：

5‘CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA3‘，hTERT基因下游引物：

5‘GGATGAAGCGGAGTCTGGA3‘,扩增片段145bp。

内参βactin基因上游引物：

5‘CGCTGCGCTGGTCGTCGACA3‘,βactin基因下游引物：

5‘GTCACGCACGATTTCCCGCT3‘,扩增片段为619bp。

PCR条件：

94℃变性30秒；

60℃退火60秒；

72℃延伸60秒；

共30个循环,产物在20g/L琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统显示及分析结果。

procaspase3、bcl2、hTERT蛋白表达的Westernblot检测

收集As2O3处理的U266细胞，提取总蛋白，用考马斯亮蓝法检测蛋白浓度。

每孔加等量的蛋白样品，进行不连续的SDSPAGE电泳，电转移至NC膜，用5％脱脂奶粉PBS于室温下封闭1小时，一抗作用1小时,洗膜30分钟,二抗作用1小时,洗膜30分钟，ECL显色系统显示蛋白条带，曝光在柯达胶片上。

　　统计学处理

采用SPSS统计处理软件进行方差分析，以为差别有统计学意义。

结果

As2O3对U266细胞生长和活力的影响

不同浓度的As2O3处理U266细胞48小时后，U266细胞的增殖率与药物剂量呈负相关，IC50为2μmol/L。

同时，用2μmol/LAs2O3处理U266细胞

Figure1.EffectofdifferentconcentrationsofAs2O3onthevitalityofthemyelomacelllineU266.

后，U266细胞的增殖率与药物处理时间也呈负相关。

Figure2.Effectof2μmol/LAs2O3onthevitalityofmyelomacelllineU266atdifferenttimepoints.

As2O3诱导U266细胞凋亡的能力

DNA电泳U266细胞经2μmol/LAs2O3处理24小时即出现细胞凋亡特征性条带，且随着时间的延长细胞凋亡逐渐增加。

Figure3.DNAelectrophoresisofU266cellstreatedwith2μmol/LAs2O3atdifferenttimepoints.M:

marker.Lane1:

0hour.Lane2:

24hours.Lane3:

48hours.Lane4:

72hours.

流式细胞术检测2μmol/LAs2O3处理后，U266细胞凋亡率随处理时间的延长而增加。

2μmol/LAs2O3处理0、24、48、72小时后的凋亡率分别是%、%、%、%。

同时，不同浓度As2O3处理48小时后，U266细胞凋亡率随药物剂量的升高而增加。

0、2、5μmol/LAs2O3处理48小时的凋亡率分别是%、%、%。

As2O3对U266细胞caspase3及bcl2蛋白表达的影响

Westernblot检测显示，2μmol/LAs2O3处理后，U266细胞内procaspase3蛋白表达下降，提示了caspase3的活化。

同时，我们还观察到在此过程中Bcl2蛋白的表达未发生明显的变化。

Figure5.Expressionofprocaspase3andBcl2proteininU266cellstreatedwith2μmol/LAs2O3atdifferenttimepoints.Lane1:

6hours.Lane3:

12hours.Lane4:

24hours.

As2O3对U266细胞hTERTmRNA和蛋白表达的影响

2μmol/LAs2O3处理U266细胞，随着处理时间的延长，hTERTmRNA表达逐渐下降。

同样，hTERT蛋白的表达也随着处理时间的延长而逐渐降低。

讨论

三氧化二砷（As2O3）俗称砒霜，是我国的传统中药，有上千年的用药史。

近几年来，As2O3用于各类恶性肿瘤的治疗是肿瘤防治研究的热点之一。

国内外研究显示，As2O3在体外对多种实体瘤和血液肿瘤，

包括MM，均有作用，但其机制尚未完全清楚。

我们的研究也证实，As2O3在体外能抑制骨髓瘤细胞的增殖，诱导骨髓瘤细胞的凋亡，并呈现时间和剂量依赖性［1、3-6］。

线粒体跨膜电位（Δψm）的变化是细胞凋亡的早期事件,它可以导致促凋亡因子，如细胞色素C、凋亡诱导因子等的释放，激活caspase家族成员，诱导细胞凋亡。

我们通过流式细胞术检测As2O3作用后U266细胞Δψm的改变，以反映U266细胞的凋亡率。

结果显示，As2O3作用后U266细胞凋亡率与药物处理时间和药物剂量均呈正相关。

同时，DNA凝胶电泳也显示As2O3可以诱导骨髓瘤细胞出现典型的DNA梯形条带的凋亡表现。

Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase3是关键的执行分子，在细胞凋亡的线粒体、死亡受体途径中发挥作用。

Westernblot检测显示：

As2O3处理U266细胞6小时后，procaspase3的表达就开始减少，并随时间的延长逐渐减少，说明caspase3的激活参与了As2O3诱导U266细胞凋亡的过程。

Bcl2蛋白是Bcl2家族的抑制凋亡成员之一。

它定位于线粒体膜上，可以影响线粒体膜的稳定性和PT通道开放，抑制线粒体释放促凋亡蛋白，如：

细胞色素C、凋亡诱导因子，抑制促凋亡成员Bax、Bak蛋白的细胞毒作用，从而抑制细胞凋亡，并可以降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

文献报道，As2O3可以通过下调BclXL、Bcl2的表达进而诱导肿瘤细胞凋亡［6、7］，但我们研究的结果显示，As2O3激活caspase3诱导U266细胞凋亡过程中，Bcl2蛋白的表达未发生变化。

因此，As2O3诱发的U266细胞线粒体跨膜电位的改变并不是通过改变Bcl2蛋白的表达实现的。

端粒酶在细胞的恶性转化中起到关键作用，其活性调节和肿瘤细胞的生长密切相关。

端粒酶催化亚单位hTERT是端粒酶活性的唯一限制性组分。

有学者报道，端粒酶有抗凋亡的作用，抑制其活性可以诱导细胞的凋亡［8］。

本研究的结果显示：

在As2O3诱导U266细胞凋亡的过程中，随着hTERTmRNA和蛋白水平的表达的逐渐下降，U266细胞的凋亡率逐渐增加。

这一结果提示，As2O3可以通过抑制hTERT的表达，降低端粒酶的活性，从而诱导或促进U266细胞的凋亡。

总之，我们的研究发现，As2O3抑制骨髓瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，是通过改变线粒体跨膜电位，触发线粒体凋亡途径，激活caspase3实现的。

此外，As2O3可以通过下调U266细胞hTERT的表达诱导细胞凋亡。

As2O3诱导U266细胞凋亡是否通过下调bclXL、Mcl1等Bcl2家族中的其他抑制凋亡成员和/（或）上调促凋亡成员实现仍需我们进一步研究。

【参考文献】

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2HusseinMA,SalehM,RavandiF,etal.Phase2studyofarsenictrioxideinpatientswithrelapsedorrefractorymultiplemyeloma.BrJHaematol,2004;

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470-476

3KajiguchiT,YamamotoK,IidaS,etal.SustainedactivationofcjunNterminalkinaseplaysacriticalroleinarsenictrioxideinducedcellapoptosisinmultiplemyelomacelllines.CancerSci,2006;

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activationofcaspasesanddownregulationofBcl2protein.BrJHaematol,1998;

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8JiangF,BaoJ,LiP,etal.Inductionofovariancancercellapoptosisby1,25dihydroxyvitaminD3throughthedownregulationoftelomerase.JBiolChem,2004;

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53213-53221