高中生物选修3-基因工程的基本操作程序.ppt

高中生物选修3-基因工程的基本操作程序.ppt

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1.2基因工程的基本操作程序,补：

原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。

转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。

转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。

与RNA聚合酶结合位点,RNA聚合酶,RNA聚合酶,RNA聚合酶,不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。

：

能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞的基因结构,有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。

启动子,真核细胞的基因结构,一个典型的真核细胞基因结构示意图,编码区含有能够编码蛋白质的序列（外显子）不能编码蛋白质的插入序列（内含子）真核生物的结构基因是断裂基因,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,外显子：

能编码蛋白质的序列内含子：

不能编码蛋白质的序列,：

有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。

非编码序列：

包括非编码区和内含子,转录,mRNA前体,成熟mRNA,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？

连续,不连续,编码区,非编码,基因工程基本操作的四个步骤,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,一、目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,2、获取目的基因的常用方法有哪些?

（1）从基因文库中获取,

（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,请阅读P9第一和二两段,

（一）从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,1.基因文库,基因组文库与部分基因文库的关系,2.基因文库的构建方法,鸟枪法：

供体细胞中的DNA,许多DNA片段,运载体,限制酶,与载体连接载入,受体细胞,产生特定性状,导入,目的基因,分离,（直接分离法）,

（一）从基因文库中获取目的基因,反转录法：

以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。

目的基因的mRNA,杂交双链（单链RNA/单链DNA）,单链DNA,反转录酶,核酸酶H,2.基因文库的构建方法,DNA聚合酶,双链DNA（目的基因）,求异思维,你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？

反转录酶既可以利用DNA又可以利用RNA作为模板合成与之互补的DNA链。

像其他DNA聚合酶一样，反转录酶也以53方向合成DNA,cDNA合成过程是：

第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。

第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。

第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。

根据已知的氨基酸序列合成DNA法：

根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。

蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,2.基因文库的构建方法,上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？

操作简便广泛使用,工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因,专一性强,操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高,专一性最强,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因,思考:

为什么要构建基因文库?

直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗?

（二）利用PCR技术扩增目的基因,概念：

PCR全称为_，是一项在生物_复制_的核酸合成技术,条件：

_、_、_（做启动子）、_.前提条件：

原理：

_,方式：

以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,结果：

选修1P60,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,

（二）利用PCR技术扩增目的基因,b、PCR（聚合酶链式反应）技术扩增,由穆里斯等人于1988年发明，并于1993年获得若贝尔化学奖。

PCR反应的过程：

（变性、退火、延伸、多次重复）,结果：

双链DNA分子数为2n,可获取大量目的基因,过程：

a、DNA变性（90-94）：

双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性25-65）：

系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。

c、延伸（70-75）：

在Taq酶的作用下，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的_。

氢键,单链DNA,双链,DNA链,二、基因表达载体的构建,寻根问底,将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？

如果这么做，结果会怎样？

有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物,不好检测与筛选,同时也无法增强目的基因的表达水平,也不能确定目的基因产物的存在部位。

a、使目的基因在受体细胞中稳定遗传的b、使目的基因复制并遗传给下一代c、同时使目的基因能表达和发挥作用。

1.用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。

2.用_切断目的基因，使其产生__。

（二）基因表达载体的构建,核心,3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,核心,同一种,

（二）基因表达载体的构建,4.过程:

5.基因表达载体的组成：

复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,它们有什么作用？

（三）将目的基因导入受体细胞,转化,方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,阅读掌握（P12-13）,根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？

若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你应该如何做？

思考：

原因：

研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。

如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：

要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。

（四）目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交（注意与上不同之处）,抗原抗体杂交,四、目的基因的检测和鉴定,细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。

淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。

四、目的基因的检测和鉴定,多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。

淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。

例：

用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。

如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。

（从个体水平鉴定）,1）以下说法正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、运载体必须具备的条件之一是：

具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,练习,2）有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来B、限制性内切酶用于目的基因的获得C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,练习,3）有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制酶只在获得目的基因时才用B、重组质粒的形成在细胞内完成C、质粒都可作为运载体D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,练习,思考与探究,1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？

为什么？

不可以。

因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。

必须构建上述元件的主要理由是：

（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；,

（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；,（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；,（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；,（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因，如绿色荧光蛋白基因等,2、利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？

有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。

3、-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。

当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。

假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？

（1）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。

（2）将cDNA前序列接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。

（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌肠杆菌。

如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。

（4）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取-珠蛋白。