生化提取实验讲义文档格式.docx
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2、掌握水解法制备氨基酸的方法。
二、实验重点和难点
L-胱氨酸的制备与精制方法。
三、实验原理
蛋白质由一定数量的氨基酸经过特定的排列方式组合而成的。
因此,在一定条件下将蛋白质水解可得到各种氨基酸的混合液,再经过进一步的提取、精制,即可得到所需的氨基酸。
本实验是用已洗净并干燥的人发,先用酸水解,然后调节pH至胱氨酸等当点(5.05左右)时,胱氨酸从水解液中沉淀出来,经精制得到其结晶。
四、实验仪器、试剂与材料
1、仪器:
500ml短颈圆底烧瓶、冷凝管、电热套、玻璃漏斗、玻璃棒、抽滤瓶、布氏漏斗、恒温水浴锅、真空泵、表面皿、烧杯、滤纸。
2、试液:
(1)10mol/L盐酸溶液:
取盐酸90ml加水稀释至100ml,摇匀,即得。
(2)6%盐酸溶液:
取盐酸6ml加水稀释至100ml,摇匀,即得。
(3)10%氢氧化钠溶液:
取氢氧化钠10g,加水溶解,放冷,加稀释至100ml,摇匀,即得。
(4)25%氢氧化钠溶液:
取氢氧化钠25g,加水溶解,放冷,加稀释至100ml,摇匀,即得。
(5)10%氨水溶液:
取氨10ml加水稀释至100ml,摇匀,即得。
(6)2%硫酸铜溶液:
取硫酸铜2g,加水溶解并稀释至100ml,摇匀,即得。
(7)0.1%EDTA溶液:
取乙二胺四乙酸二钠0.1g,加水溶解并稀释至100ml,摇匀,即得。
(8)75%乙醇溶液:
取无水乙醇75ml加水稀释至100ml,摇匀,即得。
(9)0.5%茚三酮-丙酮溶液:
取茚三酮0.5g,加丙酮溶解并稀释至100ml,摇匀,即得。
3、试剂与材料:
胱氨酸对照品、粉末活性炭、苯酚、盐酸、氢氧化钠、氨、硫酸铜、乙二胺四乙酸二钠、无水乙醇、95%乙醇、茚三酮、丙酮、人发。
五、实验操作
1、人发的处理:
取无染色的人发,用碱性或中性洗涤剂洗净,用清水洗至水呈中性,晾干并剪短备用。
2、回流装置安装:
在回流冷凝管上端接一弯玻璃管,下连一小漏斗用水封住,漏斗刚好接触水面,但不能伸到水中以免倒吸,避免氯化氢气体自仪器中逸出到空气中。
3、水解:
称取人发50g,置圆底烧瓶中,加10mol/L盐酸溶液100ml,加沸石或玻璃珠3粒,加热回流6~7小时,回流过程保持缓缓沸腾。
水解完全后应不呈双缩脲反应,可停止反应,否则应继续水解至反应完全。
4、双缩脲检查:
取水解液3ml,加入少量粉末活性炭,在80℃水浴中脱色数分钟,过滤;
向滤液中加10%氢氧化钠溶液3ml使呈碱性,然后沿管壁加2%硫酸铜溶液4~5滴,观察有无紫红色出现,若出现,水解未完全需继续水解。
5、胱氨酸粗品制备:
将水解液趁热过滤除去残渣,滤液呈深棕色。
当滤液温度降至60℃左右时在不断搅拌下,逐滴加入25%氢氧化钠溶液调pH至4.8~5.0,即产生胱氨酸沉淀。
然后,置冷处过夜使沉淀完全,次日将沉淀置布氏漏斗中抽滤,并于50~60℃干燥,得到胱氨酸粗品Ⅰ。
6、结晶:
称取胱氨酸粗品Ⅰ放入100ml烧杯中,加粗品4倍量4%盐酸溶液,加热至80℃左右,在不断搅拌下加约相当于胱氨酸粗品量15%的粉末活性炭,搅拌50分钟趁热抽滤。
将滤液置于恒温水浴中加热至60℃不断搅拌下慢慢加25%氢氧化钠溶液,调pH至4.8~5.0,即有白色结晶迅速析出,放置5~6h后(在更长时间酪氨酸也可能与胱氨酸一同结晶出来)抽滤,得胱氨酸粗品Ⅱ。
7、再次脱色并脱铁:
取胱氨酸粗品Ⅱ放入100ml烧杯中,加8倍粗品Ⅱ量6%盐酸溶液、5%粗品Ⅱ量粉末活性炭与0.1%EDTA溶液2ml,在80℃恒温水浴中搅拌30分钟,趁热减压抽滤。
8、重结晶精制:
将滤液置于60℃恒温水浴中,逐滴加10%氨溶液,调pH值至4.0(必须一滴一滴加,并不停的搅拌)左右,白色的胱氨酸结晶逐渐析出,放置过夜,抽滤,用少量纯化水洗涤结晶,再用75%乙醇洗涤,抽干。
将胱氨酸纯品置表面皿上,于50~60℃干燥,称重,计算产率。
9、纯度鉴定:
称取胱氨酸样品与对照品适量,配成相同浓度的溶液,用纸色谱法检查,以苯酚:
水(7:
3)为展开剂,以0.5%茚三酮-丙酮溶液为显色剂。
在色谱图上应为单一斑点,Rf值应符合规定。
六、结果与讨论
1、计算胱氨酸收率,讨论影响收率的因素。
2、根据纸色谱结果分析所制备的胱氨酸纯度。
项目二溶菌酶的制备
1、熟悉鸡蛋清制备溶菌酶的原理。
2、掌握树脂吸附法、透析法及盐析法用于制备酶类药物的基本操作方法。
从蛋清中制备溶菌酶的工艺和操作方法。
溶菌酶(EC3.2.1.17),又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。
是一种碱性球蛋白,分子中碱性氨基酸、酰胺残基及芳香族氨基酸(如色氨酸)的比例很高。
pH在l.2~11.3范围内剧烈变化时,其结构几乎不变,遇热也很稳定。
在pH4~7,10O℃处理lmin仍保持原酶活性;
pH5.5,5O℃加热4h后,酶变得更活泼;
热变性是可逆的,变性的临界点是77℃。
随溶剂的变化变性临界点也有变化,当变性剂在pH1以下时,变性临界点降低到43℃。
变性剂能促进酶的热变性,但变性剂过量时则酶的热变性变为不可逆。
在碱性环境中用高温处理时,酶活性降低。
十二烷基磺酸钠等对酶有抑制作用;
滤纸也能抑制酶活性;
氧化剂能使酶纯化;
在6mol/L的盐酸胍溶液中酶完全变性;
而在lOmol/L尿素中酶则不变性;
用乙二醇、丙烯乙二醇、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、二氧杂环乙烷等有机溶剂进行变性实验,在5O℃以下时除乙醇、二氧杂环乙烷外,其他变性剂的浓度要在50%以上时才能使溶菌酶变性;
氢氰酸能部分恢复酶活力。
磁力搅拌器、电热套、电炉、蒸馏装置、压片机、真空抽滤装置、透析袋、电动搅拌器、真空干燥箱。
(1)0.15mol/L磷酸缓冲液(pH6.5):
取磷酸二氢钾0.68g,加0.1mol/L氢氧化钠溶液15.2ml,用水稀释至100ml,即得。
(2)10%硫酸铵溶液:
取硫酸铵10g,加水溶解并稀释至100ml,摇匀,即得。
(3)lmol/L氢氧化钠溶液:
取氢氧化钠4g,加水溶解,放冷,加稀释至100ml,摇匀,即得。
(4)3mol/L盐酸溶液:
取盐酸27ml加水稀释至100ml,摇匀,即得。
乙醇、乙醚、无水硫酸钠、丙酮、磷酸、硫酸铵、氢氧化钠、氯化钠、淀粉、砂糖、滑石粉、鸡蛋、724树脂、漏斗、滤纸、60~80目筛子。
五、操作步骤
1、原料处理:
新鲜蛋清250g,测pH为8左右,除去蛋清中的脐带、蛋壳碎片及其他杂质。
2、吸附:
温度降到5℃左右,在搅拌中加入处理好的724树脂50g(湿重)使树脂全部悬浮在蛋清中,在0~5℃搅拌吸附5h,再将蛋清在0~5℃静置过夜。
3、去杂蛋白、洗脱、沉淀:
渐渐倾出上清液,树脂用清水洗去吸附的蛋白质,反复洗4次,注意防止树脂流失,最后将树脂抽滤去水分。
另取0.15mol/L磷酸缓冲液(pH6.5)15Oml分3次加入树脂中搅拌l5min,每次搅拌后减压抽滤去水分,再取10%硫酸铵溶液200m1,分4次洗脱溶菌酶,每次搅拌半小时,过滤抽干,合并洗脱液,按总体积加入32%固体硫酸铵(质量体积比)使含量达到40%,有白色沉淀析出。
冷处放置过夜虹吸上清液,沉淀离心分离或抽滤,得粗制品。
4、透析:
将粗制品加纯化水50ml使溶解,装入透析袋中在0~5℃透析24~36h,除去大部分硫酸铵,得透析液。
5、盐析:
向澄清透析液中慢慢滴加lmol/L氢氧化钠溶液,随加随搅拌至pH值为8.5~9,如有白色沉淀应立即离心除去。
然后在搅拌下加入3mol/L盐酸溶液使pH为3.5,按体积比缓缓加入5%固体氯化钠,即有白色沉淀析出。
在0.5℃放置48h离心或过滤溶菌酶沉淀。
6、干燥:
沉淀加入10倍量冷至O℃的无水丙酮,不断搅拌使颗粒松散。
冷处静置数小时,用漏斗滤去丙酮,沉淀用真空干燥直至无水丙酮脱水,即得溶菌酶。
7、制剂:
取干燥砂糖粉,加入总量5%的滑石粉,通过120目筛;
加5%淀粉,在搅拌机内搅拌均匀,制成软材,12目筛制粒;
55℃烘干,用14目筛整颗粒,水分以控制在2%~4%左右为宜;
再按计算量加入溶菌酶粉混合,加1%硬脂酸镁,过16目筛2次,压制成溶菌酶口含片,每片含2Omg。
六、注意事项
1、注意原料的卫生,防止细菌污染变质,pH8~9,不要掺入蛋黄和其他杂质,避免影响收率和树脂对酶的吸附能力,操作的全过程要在低温(0~10℃)下进行,防止蛋清发酸、变质和酶失活。
2、树脂再生、转型要彻底,提高收率。
转为钠型后再用0.l5mol/L磷酸缓冲液(pH6.5)平衡过夜,平衡液的pH要保持在6.5。
用过的树脂可用饱和氢氧化钠及浓盐酸直接浸泡,再生和转型后,再用缓冲液平衡。
3、溶菌酶的洗脱峰较宽,有拖尾现象,可用三氯乙酸检查洗脱液,如沉淀不明显应另行收集,用作下次洗脱用。
4、透析液加碱去杂蛋白时,碱液应均匀加入,勿使局部浓度过高造成酶失活。
七、结果与讨论
1、称重,计算溶菌酶的收率。
2、讨论影响溶菌酶收率的因素。
3、分析提取溶菌酶所需要树脂的选择原则。
项目三卵磷脂的制备及鉴定
1、熟悉鸡蛋黄制备卵磷脂的原理。
2、掌握卵磷脂的制备与减压蒸馏的基本操作方法。
从蛋黄中制备卵磷脂的操作方法。
将卵黄中加乙醇,卵磷脂溶于乙醇溶液中,分离提取,蛋白质等某些杂质从沉淀物中除去。
但由于乙醇抽提时,其他脂质也一起被抽提,如甘油三酯、甾醇等。
利用卵磷脂不溶于丙酮的性质,用丙酮从粗卵磷脂溶液中沉淀磷脂,能使卵磷脂与其他脂质和胆固醇分离开来。
无机盐和卵磷脂可生成络合物沉淀,因此,可利用金属盐沉淀剂将卵磷脂从溶液中分离出来,由此除去蛋白质、脂肪等杂质,再用适当溶剂萃取出无机盐和其他磷脂杂质。
离心机、旋转薄膜蒸发仪、布氏漏斗、抽滤瓶、真空干燥箱、层析缸、紫外分光光度计。
l0%的ZnCl2溶液:
取氯化锌10g,加水溶解并稀释至100ml,摇匀,即得。
氯化锌、95%乙醇、丙酮、氯仿、碘、甲醇、无水乙醇。
1、粗提:
取鸡蛋卵黄适量,用2倍于卵黄体积的95%乙醇混合搅拌、提取,离心分离(300Or/min,5min),将沉淀物重复提取3次,回收上清液。
然后减压蒸馏(45℃)至近干,用少量石油醚洗下粘壁的黄色油状物。
加入丙酮溶解,抽滤,分离出沉淀,真空干燥(40℃,3Omin),得到淡黄色的粗卵磷脂,称重。
2、精制:
取一定量的卵磷脂粗品,加无水乙醇溶解,得到约10%的乙醇粗提液。
加入相当于卵磷脂质量的l0%的ZnCl2溶液,室温搅拌0.5h。
分离沉淀物,加适量冰丙酮(4℃)洗涤,搅拌lh,再用丙酮反复研洗,直到丙酮洗液为近无色止,得到白色蜡状的精制卵磷脂;
干燥;
称重。
3、鉴定:
(1)薄层色谱分析:
取卵磷脂样品与对照品分别制成2%氯仿溶液,用GF254硅胶板以氯仿:
甲醇:
水(65:
25:
4)为展开剂,展开,取出,干燥,碘蒸气显色。
(2)紫外吸收光谱测定:
将一定量卵磷脂制成0.l%无水乙醇溶液,照紫外分光光法在190~40Onm处测定,卵磷脂的紫外最大吸波长在215nm。
1、计算卵磷脂收率,分析影响卵磷脂收率的主要因素。
2、根据薄层色谱图谱、紫外吸收图谱分析所制备的卵磷脂的纯度。
项目四甘露醇的制备及鉴定
1、熟悉用海藻、海带制备甘露醇的原理。
2、掌握甘露醇的制备方法和沉淀、回流、重结晶、脱色等操作方法。
海藻、海带制备甘露醇的方法和精制方法。
甘露醇在海藻洗涤液和海带洗涤液中的含量分别为2%与1.5%。
以海带为原料,用饮用水浸泡提取甘露醇,调节酸度,沉淀除杂质。
煮沸浓缩后用乙醇沉淀甘露醇,再通过回流、重结晶、活性炭脱色等工艺精制甘露醇。
电炉、布式漏斗、抽滤瓶、回流装置。
(1)30%氢氧化钠溶液:
取氢氧化钠30g,加水溶解,放冷,加稀释至100ml,摇匀,即得。
(2)(1→2)硫酸溶液:
取硫酸10ml,边搅拌边加入10ml水中,放冷,即得。
(3)lmol/L三氯化铁溶液:
取三氯化铁27g,加水溶解使成100ml,摇匀,即得。
(4)lmol/L氢氧化钠溶液:
95%乙醇、粉末活性炭、pH试纸、海带。
1、浸泡、碱化、酸化:
取海带适量,加20倍量饮用水室温浸泡2~3h(第一次浸泡液作为第二批原料的提取溶液,一般浸泡4批后,浸泡液中甘露醇含量较高),收集浸泡液用30%氢氧化钠溶液调pH至lO~1l,静置8h,凝集沉淀多糖类黏性物质。
待海带糖液、淀粉及其他有机黏性物充分凝聚沉淀。
虹吸上清液,用(1→2)硫酸溶液中和至pH6~7,进一步除去胶状物得中性提取液。
2、浓缩、醇洗:
用直火或蒸汽加热(温度约为110~150℃)蒸发,有大量氯化钠沉淀析出,不断将盐类与胶污物捞出,直至呈浓缩液,取小样倒于玻璃板上,稍冷却应凝固。
将浓缩液冷却至60~70℃时立即加入95%乙醇(2:
1),不断搅拌渐渐冷却至室温后,离心甩干除去胶质,得灰白色松散物。
3、提取:
取松散物加入8倍量的95%乙醇,加热回流3O分钟,静置24小时后以2500r/min离心,得白色松散甘露醇粗品,同法再用乙醇重结晶1次。
4、精制:
甘露醇粗品加适量纯化水加热溶解,按5%质量加入粉末活性炭不断搅拌,加热至沸腾趁热过滤(或压滤),用少量水洗活性炭2次,合并洗液和滤液(如有浑浊重新过滤),浓缩至脓缩液相对密度为1.2左右时,在搅拌下冷却至室温,低温结晶,抽滤至干,得到结晶甘露醇,干燥,得甘露醇成品。
5、鉴定:
取甘露醇成品饱和溶液lml,加lmol/L三氯化铁溶液与lmol/L氢氧化钠溶液各0.5ml,即生成棕黄色沉淀,振摇不消失,滴加过量的lmol/L氢氧化钠溶液,即溶解成棕色溶液。
可初步断定为甘露醇。
1、称重,计算甘露醇的收率。
2、讨论影响甘露醇的收率因素。
项目五芦丁的提取与鉴定
1、熟悉黄酮类化合物的提取原理。
2、掌握芦丁的提取的基本方法。
芦丁的提取的基本方法。
芦丁亦称芸香苷,广泛存在于植物界中,其中以槐花米(槐树的花蕾)和乔麦叶中含量较高。
槐花米中的含量为12~16%,已知的成分为:
1、芦丁:
熔点为177~178℃,为淡黄色小针状结晶。
溶解度为:
冷水中1:
8000,热水中1:
200,冷乙醇中1:
300,热乙醇中1:
30。
难溶于乙酸乙酯、丙酮,不溶于苯、氯仿、乙醚及石油醚等溶剂。
2、槲皮素(Quercetin):
熔点为316℃,313~314℃,黄色结晶。
溶于热乙醇1:
60、冷乙醇1:
650,可溶于甲醇、冰醋酸、乙酸乙酯、丙酮、吡啶,不溶于石油醚、乙醚、氯仿和水中,实验室以稀硫酸水解,乙醇重结晶制得。
3、皂苷:
其粗品为白色粉末,经酸水解后得二种皂甙元及糖的部分,两种皂苷元为桦脂醇和槐花双醇,另外还含有槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。
本实验用芦丁在热水冷水溶解度差别较大的性质,用热水提取,然后再利用其在热乙醇和冷乙醇中溶解度的差异,进行精制。
棉花、500ml烧杯、1000ml烧杯、电热套、漏斗、架盘天平、真空泵、抽滤瓶、布氏漏斗、滤纸、剪刀、冷凝管、蒸馏烧瓶、乳胶管、研钵、量筒、容量瓶、试管、紫外分析仪、层析缸、聚酰胺酯薄层板。
(1)4mol/L硫酸溶液:
取硫酸24ml,边搅拌边加入60ml水中,放冷,加水稀释至100ml,摇匀,即得。
(2)1%三氯化铝乙醇溶液:
取三氯化铝1g,加水溶解使成100ml,摇匀,即得。
(3)0.1mol/L硝酸银试液:
取硝酸银1.75g,加水溶解使成100ml,摇匀,即得。
(4)10%氨试液:
取氨10ml,加水溶解使成100ml,摇匀,即得。
槐米、芦丁对照品、乙醇、硫酸、碳酸钡、盐酸、镁粉、醋酸铅、α-萘酚、正丁醇、醋酸、三氯化铝、硝酸银、氨水、氯仿、甲醇、丁酮、乙酰丙酮。
1、芦丁的提取:
取20g槐花米于烧杯中漂洗干净,捞取上浮的花蕾,弃去下沉的杂质,将洗净的花蕾置于1000ml烧杯中,加沸水500ml,煮沸50分钟,不断补充蒸发掉的水分,趁热过滤(用棉花),再用200ml水提取40分钟,合并两次滤液,浓缩1/2体积,放置过夜,析出芦丁。
抽滤,沉淀用少量冷水洗三次,抽干,60℃以下干燥,称重计算收率。
2、重结晶:
将粗制芦丁研细,加95%乙醇回流溶解(每2g芦丁加70ml左右乙醇)趁热过滤,滤液浓缩至原体积的1/3~1/4,放置,析出结晶,抽滤,干燥称重,得精制芦丁,计算收率。
取1/2量精制芦丁,加少量乙醇回流溶解,然后加4mol/L硫酸溶液(1g芦丁加80ml硫酸)水浴回流1小时,待全部水解后,蒸去乙醇,冷却,析去槲皮素,抽滤,滤液内含糖。
槲皮素沉淀经水洗、抽干、干燥,称重,计算收率。
再用乙醇重结晶一次,得黄色针晶,为槲皮素精品。
含糖的溶液,取10ml于水浴上加热,同时于搅拌下加碳酸钡细粉中各至中性,滤除白色的硫酸钡沉淀,滤液在水浴上浓缩至1~2ml,供纸层析用。
4、层析鉴定:
(1)槲皮素和芦丁的纸层析鉴定:
1)点样:
取层析滤纸距下端3cm处用铅笔划线,为原点线,每隔1.5cm处点样品,将点好样品的滤纸在层析缸中饱和30分钟,再上行展开。
2)试液:
芦丁乙醇液、芦丁标准品乙醇液、精制槲皮素乙醇液。
3)展开剂:
正丁醇-醋酸-水4:
1:
5。
4)显色:
可见光下观察色斑,紫外灯下观察萤光光斑点;
喷1%三氯化铝乙醇溶液再观察萤光斑点。
(2)糖的纸层析鉴定:
取一号滤纸距下端3cm处用铅笔划线,为原点线,每隔1.5cm处点样品,将点好样品的滤纸在层析缸中饱和30分钟,再上行展开。
水解液、葡萄糖水溶液、鼠李糖水溶液。
氨性硝酸银溶液(临用时等量0.1mol/L硝酸银试液与10%氨试液混合而成)喷洒,加热观察色斑。
(3)槲皮素和芦丁的薄层层析鉴定:
1)固定相:
聚酰胺酯薄层板。
2)样品:
精制芦丁、芦丁标准品、精制槲皮素。
氯仿-甲醇-丁酮-乙酰丙酮16:
10:
5:
1。
喷1%三氯化铝乙醇液再观察萤光斑点。
1、计算芦丁收率,讨论影响收率的因素。
2、根据色谱结果分析所制备的芦丁纯度。
参考文献
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人发卫生出版社.1998.
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[4]贾士儒.生物工艺与工程实验技术.北京.中国轻工业出版社.2002.
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