芦荟提取物对肝癌Bel7402细胞的影响毕业设计论文Word文档格式.docx

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Livercancerismalignant,itiscommonprimarylivercancer.Accordingtothelateststatisticsshowthateachnewissueoftheworld'

slivercancerinpatientswithaboutsixhundredthousand,occupyfifthplacemalignancy.TheworldhasthelargesthepatitisBpatientsinChina,themajorityofourpatientsevolvedfromlivercirrhosis,inpatientssufferingfromhepatitisCisalsoincreasing,hepatitisBandfinallydevelopintolivercancer.AloeVerahasagoodChinesemedicineattributes,haveagoodanti-inflammatoryanti-bacterialeffect,aloeverahasagoodanti-inflammatorysterilization,beusedasthebasisofwhethertheextractBel-7402hepatomacellswasinhibited,forthetreatmentHCChasgreatsignificance.ThetopicstoaloeextractasrawmaterialforthepreparationoftheextractisonhepatocellularcarcinomacellBel-7402affected.Aloe（AlondraBranch）asrawmaterial,throughcutting,dissolving,refluxcondenserforthecrudeextractofaloe.Afterfiltration,addedtothecells,thegrowthstateofthecellswasobserved.Thestudyfoundthataloe（AlondraBranch）extractonlivercancercellswasinhibited,canprovidethebasisfortheanti-hepatomaresearch.

KeyWords：

Aloeextract;

hepatomaBel-7402;

inhibitionrate;

halfinhibitionrate

Abstract.............................................................................................................................II

2.2实验方法8

第1章绪论

1.1天然植物产品的研究发展

从植物里提取的产物被称为天然植物提取物，大部分是用作纯自然药物和健康食品以及食物添加剂等产品的原料。

一个方面，伴随着世界范围的口号“回归自然”的不断升温，天然药物、天然无公害食品已经成为21世纪最热门的药品和食品【1】；

另一个方面，是伴随着社会和人们生活水平的不断进步，使得人们对疾病的关注已经由最单纯的如何治疗发展到重点关心如何预防疾病，也就使得具有各种药用价值的绿色产品备受青睐。

从1980年开始，从植物中提取的纯自然产品受到的关注大部分是来自医药和食品方面的，已经成为不断推动使中药的形势现代化和中药的技术创新的关键性环节，也成为了中药进入国际市场的一种实际有效的方式。

1.1.1天然植物产品的应用基础

我国是植物资源特别丰富，在世界排名特别靠前，全世界范围内最大的植物提取物药物生产地在我国，还有使用中药数个世纪之久，在我国天然植物提取的产物的大部分使用在制作香剂和食物保存方面，现在全球范围内的各种产品基本上以各种矿物质原料通过各种途径合成的【2】。

随着人类的发展，各种不可再生的资源逐渐减少，终有一天将会完全消耗完，这就逼迫人类必须尽快寻找到新的化工原料，所以发展以天然植物质为原料的提取和合成是走可循环发展的道路的第一选择。

通过化学方法制作的药品有明显的附属作用，且大部分是不好的，并且特别容易使使用对象产生抗药效果，然而纯植物制作的药品在这方面则拥有着十分明显的优势；

单纯的化学成分的新药开发具有难度大、周期长、费用高的特点，也使得植物制作的药品和运用复合方法合成的药品的研究变成为药厂的第一考虑。

为了提高以植物为原料合成的产品的得率和产品效果以及尽可能的减少生产工艺产生的废品，这就让人们对无公害的生物以及分子技术进行了各种实验。

纯植物制作的产物具有十分广泛的应用【3】。

仅仅2009一年全世界植物提取的产品的销售额高达70亿美元，而且年均市场的发展速度将近20%。

最近8年来，我国的纯植物制作的产品出口以的每年平均在18.6%持续增长。

最近几年全球范围对纯植物制作的产品需求增长很快，特别是经济发达地区的人们对纯植物制作的产品要求，这就也大大推动了纯植物制作产品的发展。

跟据中国进出口商会对全国进出口的统计数据显示，仅仅2010年我国纯植物制作的产品的对外毛衣就打到了9亿美元，与去年相比增加40%【4】。

1.1.2天然植物产品的技术发展

生产工艺包括四大步骤，即浸泡植物、澄清、滤去渣物和干燥等步骤的是传统的生产过程。

按照原先的生产方法操作，则含有能源浪费、原料利用率低，产品纯度低，产品得率低，且极易对环境造成污染和破坏【5】。

为了改变这一现状，人们加强了对生物技术萃取和超导临界以及微波提取进行了不断的改善。

包括发酵、酶、细胞和基因等方式的是生物技术方法萃取。

其中，在制作香剂的生物合成中最普遍的方式是通过发酵完成，是以各种生产中的有机废料为原料，然后依靠各种微生物就可以生产各种纯自然的香剂。

如今以中草药为原料，应用生物方法进行有效成分的提取的是酶工程【6】。

现在最先进，最具有研究价值微波萃取，这是一种新的通过微波萃取的提取产物的方式，它同时具备多个优点，具有提取产品快、可挑选、可多次使用、使用溶剂较少、造成的废品少、可以实现全自动化等特点【7】。

有人通过对家用微波炉改造，然后使用改造好的微波炉对取鸢尾进行提取时，影响产品质量和产率的影响因素进行多次实验，然而通过GC—MC得到的数据证明：

通过微波对植物进行萃取相比较其它方式来说，更加适用用于提取鸢尾香精。

与其它方法对该品的提取比较可以发现，具有提取产品快、消耗溶剂少、可重复使用、产率高等特点。

王刚等通过微波破壁法以高山红景天根茎为原料，从中提取红景天苷，该法与传统乙醇回流工艺相比具有作用时间短、作用效果好、无危险、能源消耗少等特点，并且在特别少的时间内，拥有较高的产品得率，并且提取液中杂质明显较少【8】。

有人对灵香草精萃取的方式实验，是通过超临界状态下的二氧化碳进行的。

实验结果证明，用超临界CO2萃取技术可以提取到香气纯正、效果良好的灵香草萃取物，该法具有比较高的得率。

通过GC—MS的数据，可以很好的证明，导致香气更纯正的原因是灵香草萃取物比按照原先的方式进行操作得到的产品具有更多的分子。

1.2芦荟提取物的研究

所谓芦荟提取物,顾名思义,即以芦荟为原料,制作的提取物,国内外的研究员通过不断的探索与努力,取得了不少的成绩,也为以后的研究提供了经验。

目前主要有三种工艺提取,即传统工艺法、McAnalley和Coats冷处理法、Cobble和Coats热处理法【9】。

（1）传统制作芦荟提取物产品的方法：

最开始对芦荟进行选取，是从汁液含量高的芦荟上摘取，用器械对芦荟叶片进行初步粉碎，将粉碎后的芦荟挤压得到汁液，进行炉内熬制，将熬好的芦荟冷却得到产品。

这里所说的芦荟胶只能说是一种粗提取产品，主要用作泻下药，注定了要被淘汰。

（2）Cobble和Coats热处理法：

Cobble最先提出一种能够制取稳定透明芦荟胶的方法，在得到的芦荟胶的提取物的产品质上有所提高。

与Cobble方案相比，Coats对Cobble的工艺提出厂改进方案，降低了提取过程中使用的氧化剂。

（3）McAnalley和Coats冷处理法：

经过冻干后不再降解的活性黏多糖就是芦荟的主要活性成分是由美国McAnalley教授领导的Carrington实验室经过多年的研究证明的，其制作过程可以简单的叙述为：

将摘取的芦荟用清水洗净，去掉表皮，用器具将芦荟制作成浓稠状，用乙醇溶解，静止后除去沉淀，用离心机离心，然后将得到的产品置于冰箱保存。

他们通过这种方式得到的芦荟多糖取得了惊人的医疗效果，现在已获得美国FDA的批准。

所得到的多糖仍然不是纯物质，Coats又提出了一套新的提取稳定芦荟胶的改进方案，使得到的芦荟提取物产品效果更好。

芦荟含有多种成分，仅仅已经确定具有药用价值的成分就一百多种，按照成分的功能还划分，主要包括两大类【10】：

（1）芦荟多糖：

目前已被检出的有葡甘聚糖、乙酚化葡聚糖、阿拉伯-半乳聚糖等，芦荟内含有的多糖的种类主要跟种类有关，但也与所处的环境以及所处的生长阶段有一点联系。

（2）蒽醌类化合物：

包括芦荟素、后莫那特芦荟素、芦荟苫素、芦荟霉素等几十种，是芦荟提取物产品中的具有明显活性的组分，主要存在于芦荟表面。

1.2.1芦荟的由来

芦荟（学名：

Aloevera（Linn.）N.L.Burmanvar.chinensis（Haw.）Berg.）在叶子的边缘有齿状，尖齿状刺生长于边缘【11】。

花序为圆锥形、伞形、总状、穗状等，色呈红、黄或具赤色斑点。

芦荟具有多种品种，按照地区分，马达加斯加大约有40种，非洲大陆就有250种左右，其余10种分布在阿拉伯等地。

1.2.2芦荟提取物的应用

（1）在医疗保健，饮食等方面的应用：

分析表明，芦荟中含有20种微量元素和氨基酸，还含有锶，锗，芦荟大黄素，芦荟食品矿物质，可以有效的提高人体免疫力，抗能够十分明显的增加白细胞消炎杀灭细菌的作用，缓解便秘症状，消除有毒的自由基，预防结肠炎，有效提高人的食欲，有效防止消化类系统产生病变，可以使人睡的更好，防止失眠等功效【12】。

（2）在化妆品中的应用：

天然提取物芦荟汁，其中包含了各种有益的营养成分和保湿成分。

中国古代有芦荟化妆品应用。

（3）在医学中的应用：

美国卡林顿实验室生产多糖含芦荟的产品，已被批准用于治疗人类艾滋病的芦荟胶囊。

根据得克萨斯大学健康科学中心大学W.博士温特斯，至少有140种芦荟成分，具有消炎成分，控制组成细胞的生长和分化，促进愈伤组织成分，刺激增长的白血细胞和其他免疫细胞的成分。

芦荟也有辐射，增强免疫力，促进肠蠕动，抗心血管疾病等功能【13】。

1.3肝癌的治疗

1.3.1什么是肝癌以及肝癌的危害

我国的最新数据证明，全球范围内肝癌的发生每年大约有60万，在各种已知的恶性癌症中排名前五。

根据不同细胞引发的肝癌，可以将肝癌分为三大类：

细胞型、混合型肝癌以及胆管细胞型肝癌【14】。

现在世界范围内拥有数量最多的乙肝患者的是中国，中国的肝癌患者很大一部分都是由乙肝转化的，患有丙肝的病人也在逐渐增加，乙肝到最后很有可能转化癌症。

根据统计显示，我国的发病人数大概有世界的乙肝病人人数的百分之五十五，所以说肝癌危害十分严重，不近是危害我国，还是危害世界人类的一大杀手。

1.3.2现今肝癌的治疗研究

目前对于癌症的有效的治疗的主要方式比较单一，现在对于肝癌治疗方式主要是靠向于研究蛋白质，治疗时主要运用蛋白质使肝癌细胞凋亡，在Williams提出蛋白质组，指细胞内含有的全部由基因控制的全部蛋白质，它的研究主要包含两个内容：

一方面是研究细胞内的蛋白质的对于细胞所起到的应有作用；

第二方面是研究细胞内含有的蛋白质的组合方式，研究主要有哪几种成分，它们结合的方式又是如何【15】。

证明是肿瘤的是一种生物分子，这种生物分子可以测量出含有的具体含量，主要是从体液以及器官组织中提取，并且对于治疗肿瘤有一定的意义的一整分子，这种分子一般认为是肿瘤的标志。

人们如今已经在分子水平研究这方面的内容。

目前对于肿瘤的治疗最有效的是通过化疗的方式，但是这种方式不仅对于肝癌细胞有危害，对于正常细胞的危害更大，而且通常无法彻底消灭肝癌细胞。

1.4芦荟提取物抗癌的可能性

对于芦荟，我国在很早以前就在医疗方面有很广泛的使用，对于龙爪科芦荟拥有十分明显的消炎抗菌的作用。

能杀灭细菌、真菌、霉菌、病毒等病菌，是一种抗菌性很强的药用物质【16】，能够很大程度上消灭病菌和抑制病原体的不断增殖。

芦荟具有很好消炎抗菌作用，可以以此为依据研究抗癌的可能性。

1.5国内外植物提取物抗癌的研究进展

自1957年以来，美国国立癌症研究所（NCI）每年评价1500～5000种植物提取物的抗癌活性，现如今被选择出来提取物具有抗癌作用的品种已经超过三万，本筛选的植物制作的产品已经超过十万被评价。

发展到1994年时，根据数据统计显示，已经用于临床治疗的近90种药物中，竟然有近60种为植物提取的产物或者是提取的产物合成的。

2003至2013年间，短短的十年，欧美以及日本等国家通过各种操作，先后完成了对喜树碱类似物的合成，且数量以及种类都很可观，这些产品中的部分已经开始了临床实验，在治疗癌症方面取得了可喜的成果【4】。

现在医院所使用的众多抗癌药物中，就有很多是属于喜树碱类似物的，其中的佼佼者属于irinotecan，目前在全世界范围内的多个国家已经允许用于治疗在标准药物没有作用时对于晚期癌症的治疗【5】。

现在通过活性作用引导机制，以自然植物为原料，从而制作出新的异构酶。

这种植物就是老鹳草，从它体内可以萃取出两种酶，其作用效果比之前的要高出几十倍，是目前世界上已知的最好的酶类的抑制剂【6】。

之前有报道，李风琴【7】等人以芦笋作为原料，通过必要的工艺流程，成功的从已经完全变干的皮中提取出了多种化合物，经过多次实验，已经可以确定的有十二种，并且其中含有三种化合物，可以以异构酶为中介，发现了抗癌的关键部分，表现出明显地特异性的作用点，无论是在任何地方，均有很好的抗癌作用【18】。

据最新研究证明，鞣质体外抗拓扑异构酶Ⅱ作用高于临床常规化疗药物在当在体外作用癌症细胞的时候常用的抗癌药品的作用效果与鞣质作用肝癌细胞的效果相比，很明确的表示出低于鞣质的作用效果【19】。

Tsai等人通过不断的实验证明：

已知的多聚鞣花鞣质不近近有效果十分显著的抗聚葡萄糖水解酶活性，而且往往还可以通过抑制体内基因的正常表达，从而表现出抗癌的效果。

并且具有这种效果的还不是一种，二十多种【20】。

鞣质类的化学成分是现今拥有抗癌潜力十分大的一种分子，由于对各种原因导致癌症的发生的多个机制有不一样的抵抗效果，所以将来的应用肯定十分广泛，是很值得研究一种物质【21】。

苦马豆素如今一段时间内收到了各界的广泛关注，主要原因是由于它是α-甘露糖苷酶Ⅱ，是一种作用效果十分显著的的抑制剂，且已经被制作成了具有良好效果的抗癌药品，已经被广泛的用于实验，在国外已经部分开始临床的实验。

作为被广泛应用的药品，它对于癌症有很好的治疗效果，能够有显著的控制肿瘤的发展，增强免疫力对于肿瘤细胞的灭杀效果，还能促进新的细胞的快速繁殖【22】。

1.6本实验的目的以及意义

目的：

研究芦荟提取物对肝癌细胞Bel-7402的影响，是否有抑制效果。

意义：

肝癌就是恶性肿瘤，我国的最新数据证明，全球范围内肝癌的发生每年大约有60万，在各种已知的恶性癌症中排名前五，常见的是原发性肝癌。

我国的乙型肝炎的发病率大概占全世界的病人的一般，随着病情的严重，乙肝随时可以发展为肝癌，严重危害我国人民的健康，并且目前并没有对于癌症有很好的治疗方式。

研究芦荟提取物对肝癌Bel-7402的影响，是至今没有人研究的一项课题，还没有人对这一内容进行研究，如果芦荟提取物对肝癌Bel-7402细胞有良好的抑制效果，则可以为治疗癌症打开一道新的大门，并且由于该产品是以芦荟作为原料，通过生物的方式进行提取制成的，属于纯植物产品，所以基本没有太强的副作用。

1.7本论文的主要内容

本研究是以芦荟（龙爪科）为原料，通过必要的操作，提取制成干燥的产品，溶解后作用肝癌Bel-7402细胞，观察是否对它有抑制效果，测定细胞的生长曲线，测定细胞半数抑制浓度，初步研究其抗癌效果，得出相对应的结论，并且为了以后对细胞抑制效果的机制做好铺垫工作，还可以为以后芦荟提取物抗癌制作成药物，进行临床实验做理论依据。

第2章实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1细胞株

Bel-7402肝癌细胞株购于北京肿瘤医院

2.1.2主要仪器

SW-CJ-IFD型双人单面净化工作台苏州净化设备有限公司

液氮容器乐山市东亚机电工贸

80-2型离心沉淀机江苏金坛市中大仪器厂

HF90型CO2培养箱上海力申科学仪器有限公司

倒置显微镜日本OLYMPUS

4℃低温冰箱青岛海尔公司

TGL-16G型台式离心机上海安亭科学仪器厂

－20℃低温冰箱青岛澳柯玛公司

数码摄像机日本OLYMPUS

MLS-3780型灭菌锅日本三洋

DL-360A型智能超声波清洗器上海之信仪器有限公司

2.1.3主要药品

RPMI1640培养基干粉HyClone

琼脂糖上海生工

优基胎牛血清上海生工

Tris饱和酚北京鼎国

吖啶橙北京鼎国

2.1.4试剂及药品的配制

1．10％FBS的RPIM1640培养基

（1）1640培养基的配制【23】

10.4g1640干粉+2.00gNaHCO3+2.00gHepes溶于1L无菌三蒸水中，磁力搅拌至少4h，充分溶解，用90mm，0.2µ

m滤膜滤器过滤，分装成180ml/瓶。

4℃保存备用。

（2）双抗的配制

青霉素-链霉素溶液（100X）就是所谓的双抗溶液，该双抗溶液可以不做任何处理，而直接加入到需要实验的培养液中，该溶液只是为了抑制细菌在培养液内生长，尽量减少细胞被其它细菌污染，是专门为了培养细胞配置的，并没有其他的作用。

本实验所使用双抗配置方法是将含量为80万单位/瓶的青霉素加入到4ml的1640培养基，加经过消毒的蒸馏水，将溶液配成浓度2×

105单位/ml的溶液，分别装100µ

l/管；

将原本链霉素100万单位/瓶的溶液加入到5ml的1640培养基中，再加经消毒的蒸馏水牺牲，配成浓度200mg/ml，分装100µ

l/管。

均4℃保存备用。

（3）胎牛血清

胎牛血清现今所使用的最广泛的的一种培养基，主要用于培养各种实验细胞，是细胞实验中必不可少的一种培养基。

由于该培养基是由牛血清制得的，所以含有各种细胞所需要的物质，构建出一个利于细胞生长的环境。

在细胞实验时主要应用于培养细胞，为细胞提供各种已知的、未知的激素和营养物质，满足对细胞的各种培养需求，让细胞快速繁殖。

此外，由于是由血清制作的培养基，期内还含有某些对动物细胞起作用的因子、蛋白质以及各种酶，还可以用做培养细胞的缓冲剂，使细胞在生长环境变化时尽快的适应过来，免受伤害【24】。

200ml/瓶的溶液置于4℃环境下逐渐溶解，用经过灭菌处理的瓶子分别装溶液，置于-20℃的环境下冷冻保存备用。

（4）完全培养基：

180ml1640培养基+20ml胎牛血清+双抗（100µ

l/管青霉素和100µ

l/管链霉素），4℃备用【25】。

2．PBS的配制

称取8.00gNaCl，0.20gKCl，2.90gNa2HPO3.12H2O，0.20gKH2PO3溶于800ml双蒸水中，搅拌溶解，对浓盐酸调进行PH值调节，为了细胞的生长，一般调整至7.4，然后定容为1000ml，经过高压灭菌后存于4℃保存备用。

3．5×

TBE缓冲液

准确使用电子秤称量54gTris碱烧杯中，再用电子秤称量27.5g硼酸缓慢加入到之前的烧杯，最后再量取20ml0.5mol/LEDTA溶液，将烧杯中的溶液转移至容量瓶中，最后定容至1L。

4．0.5%台盼蓝染液

0.25g台盼蓝溶于50ml的双蒸水，4℃保存。

5．0.1%吖啶橙

1mg的吖啶橙粉末溶于10ml的PH=4.8的PBS缓冲液，避光保存。

2.2实验方法

2.2.1芦荟提取物的制备

1．酒精溶液的配置

量取95%酒精溶液，按照每量取274ml就添加蒸馏水至400ml的原则，用95%的酒精配置出含量为70%的酒精溶液。

将配好的酒精溶液置于干燥瓶内保存【26】。

2．芦荟的选取

由于随着芦荟的生长，其体内含有的糖是不断累积的，所以越是生长成熟的，含糖就越多，进行提取时得到的产物也就越多，所以，选择生长成熟的芦荟。

3．芦荟的冷凝回流

通过对气体降温使其变为液态回流入反应装置以继续利用。

回流的意义是尽量减少没有未反应的原料因为溶液温度太高而散逸出去,造成对原料的损失【27】。

将选取好的芦荟，用蒸馏水洗净，然后用小刀倾斜切芦荟，切割成（1x1）cm的斜片，要求厚度要均匀，越薄越好。

将切好的芦荟与酒精溶液按照1g:

12ml的比例冷凝回流4h；

1g:

10ml的比例冷凝回流3h；

按照1g:

8ml的比例冷凝回流2h，将这三次所得到的溶液收集到一个瓶子。

按照上述方法用不同温度的水进行水浴，即70、75、80、85、90摄氏度，分别记做1、2、3、4、5组【28】。

冷凝回流的具体实验方法是：

（1）将按照比例配制好的溶液加入到烧瓶中，然后将烧瓶放置到加热电炉上；

（2）按照操作步骤安装冷凝回流管；

（3）将上端接好后，上段接通凉水的管，下端接的管子放到水池中；

（4）检查安装的所有装置，确保没有问题；

（5）通入冷水，打开电源开关，设置好水浴温度【29】。

通过冷凝回流装置进行实验操作时应该注意的事项是：

（1）仪器安装时，要严格按照玻璃仪器从上到下,由左向右的安装顺序；

（2）金属夹子应套上橡皮管使用，用左手把双钳夹紧，一定要确保牢固，然后再用手把上面的螺丝拧牢固，保证不滑动，不过分紧；

（3）安装好装置后，要先检查安装是否正确，对检查好的装置要先通凉水，之后在对其进行加热；

（4）当冷凝管内液体沸腾后，应该控制加热过程，保证期内的气泡低于