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3Enzyme

酶通论

Thekinetics（动力学）oftheenzyme-catalyzedreactionwerefoundtoberatherdifferentfromthoseofatypicalchemicalreaction.TherateisproportionaltotheconcentrationtheEnzymeshowedofreactantinatypicalchemicalreaction.

二.酶催化作用的特点

1.高效性

2.专一性

3.条件温和

4.可调控性

5.酶的催化活性与辅酶、辅基和金属离子

有关

三.酶的化学本质及其组成

绝大部分酶具有蛋白质属性，主要表现在：

1.含N量为16%。

2.是两性电解质，有确定的pI。

3.分子量大，其水溶液具有亲水胶体的性质。

4.具有一、二、三、四级结构。

5.受某些物理化学等因素作用失活。

6.水解后的产物也为氨基酸。

绝大多数的酶化学本质是蛋白质。

只有具催化作用的蛋白质才称为酶。

酶的组成

1.单纯蛋白酶

酶的活性仅取决于蛋白质结构，不含其它成分。

如脲酶、蛋白酶等一般水解酶。

2.结合蛋白酶

含蛋白质（酶蛋白）和非蛋白小分子物质（辅助因子）。

酶蛋白与辅助因子单独存在时，均无催化活力。

两部分结合称全酶。

全酶=酶蛋白＋辅助因子

酶蛋白:

决定反应底物的种类，即该酶的专一性。

辅助因子:

决定底物的反应类型。

辅助因子有金属离子、小分子等有机化合物。

通常将这些小分子有机化合物称为辅酶或辅基。

辅酶（coenzyme）：

与酶蛋白结合比较松、容易脱离酶蛋白，可用透析法除去的小分子有机物。

辅基（cofactor）：

与酶蛋白结合比较紧、用透析法不易除去的小分子物质。

二者之间无严格的界限，只是它们与酶蛋白结合的牢固程度不同。

3.单体酶、寡聚酶和多酶体系

A.单体酶

由一条多肽链组成的酶称单体酶，分子量约为13000～35000。

大多是水解酶等。

B.寡聚酶

由几个或多个亚基组成的酶称为寡聚酶。

分子量

35000到几百万。

如乳酸脱氢酶等。

C.多酶体系

由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。

有利于细胞中连续反应的进行，提高催化效率,便

于调控,分子量几百万以上。

如丙酮酸脱氢酶系。

四.酶的命名和分类

1.酶的命名

A.习惯命名法

把底物的名字、底物发生的反应以及该酶的生物来源等加在“酶”字的前面组合而成。

按作用的底物：

如淀粉酶、蛋白酶、脲酶。

按催化的反应：

如水解酶、转氨基酶、脱氢酶。

按酶的来源：

如胃蛋白酶、细菌淀粉酶。

B.系统命名法

要求能确切地表明酶的底物及酶催化的反应性质，即包括酶作用的底物名称和该酶的分类名称。

若底物是两个或多个则通常用“:

”号把它们分开，供体底物的名字排在前，受体的名字在后。

如乳酸脱氢酶的系统名称是：

L-乳酸:

NAD+氧化还原酶。

2.酶的分类

根据酶所催化的反应类型，可分为六大类。

1）.氧化还原酶类

催化底物发生氧化还原反应的一类酶。

氧化:

脱氢加氧

还原:

加氢脱氧

有脱氢酶、加氧酶、氧化酶、还原酶、过氧化物

酶等。

其中种数最多的是脱氢酶。

2）.转移酶类

能催化底物发生基团转移或交换的一类酶。

常见的有氨基转移酶、甲基转移酶等。

3）.水解酶类

能催化底物发生水解反应的酶。

常见的有淀粉酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。

A-B＋H2O=AH＋BOH

4）.裂解酶类

催化底物分子中C-C（或C-O、C-N等）化学键断裂，断裂后一分子底物转变为两分子产物的酶，均称为裂解酶。

A-B=A＋B

从左向右:

裂解反应

从右向左:

合成反应

所以裂解酶又称裂合酶。

5.异构酶类

催化底物分子发生几何学或结构学同分异构变化的酶。

几何学上的变化有顺反异构、差向异构和分子构型的改变；结构学上的变化有分子内的基团转移（变位）和分子内的氧化还原。

如顺反异构酶、变位酶和消旋酶。

反应通式：

异构酶所催化的反应都是可逆的。

6.合成酶类

催化两个分子连接在一起，并伴随ATP分子中高能磷酸键断裂的一类酶，又称连接酶。

反应通式：

A＋B＋ATP=A-B＋ADP＋Pi

或A＋B＋ATP=A-B＋AMP＋PPi

多数不可逆。

反应中必须有ATP（或GTP等）参与。

如丙酮酸羧化酶、谷胱甘肽合成酶等。

五.酶的活力测定和分离纯化

酶的活力也称为酶活性，即酶的定量测定。

1.酶活力

指酶催化某一反应的能力，大小可用一定条件下所催化的某一反应的反应速率表示，两者呈线性关系。

酶催化的反应速率越大，活力愈高，反之亦然。

测酶活力即测酶促反应的速率。

酶促反应的速率可用单位时间内底物的减少量和产物的生成量来表示。

2.酶活力单位

酶活力的大小即酶含量的多少，用酶活力单位表示，即酶单位，用IU表示国际单位。

IU:

每分钟能催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量。

催量：

最适条件下，每秒钟能催化1摩尔底物转化为产物所需的酶量定为1Kat单位。

1Kat=60x106IU

3.酶的比活力

代表酶的纯度，用每mg蛋白质所含的酶活力单位数表示，比活力越大表示酶纯度越高。

比活力=活力U/mg蛋白=总活力U/总mg蛋白

两个有实际意义的指标：

4.纯化倍数＝每次的比活力/第一次的比活力

5.回收率＝每次的总活力/第一次的总活力×100%

六.核酶和抗体酶

1.核酶（Ribozymes）

核酶的发现——四膜虫rRNA成熟中RNA的剪接

Ribozymes的类别

目前主要有四种具有切割功能的Ribozymes

A.四膜虫自身剪接内含子

B.大肠杆菌的RNaseP

C.锤头状Ribozyme

D.发夹状Ribozyme

2.抗体酶（Abzymes）

20世纪80年代后期才出现的一种具有催化力的蛋白质，本质是免疫球蛋白质，但在其可变区赋予了酶的属性。

医学上抗体酶有广阔的应用前景。

可设计降解可卡因的催化性抗体，用于治疗可卡因的毒隐。

Summary

酶催化作用的特点:

高效、专一、温和、可控、

辅助因子

酶的化学本质及其组成：

绝大部分是蛋白质

酶的命名和分类：

上千种酶分为六大类

酶的活力测定和分离纯化：

酶活力、酶活力单

位、比活力、纯化倍数、回收率

核酶：

发现、定义、功能、意义

抗体酶

酶促反应动力学

一.底物浓度对酶反应速度的影响

1.底物浓度与酶促反应速度的关系----核心内容

实验得到的关系如图：

一级反应：

当底物浓度[S]很低时，酶促反应速度v

与[S]呈直线关系（OA段）。

随[S]增加，v按比率

加快。

混合级反应：

当[S]增加到一定程度后，虽然v仍随

[S]的增加而加大，但比率已不是定值，呈逐渐减

弱的趋势（AB段）。

零级反应：

当[S]足够大时，v达到极限值Vm，v

不再受底物浓度的影响（BC段）。

v-[S]的变化关系，用中间产物学说解释:

[S]较低时，只有少数的E与S作用生成中间产物;增加[S]，会增加中间产物，故增加v.

[S]足够大时，所有的酶都与底物结合生成中间产物，体系中已无游离的酶，v增加缓慢。

[S]过量时，继续增加[S]，对v已毫无作用。

酶活性中心都被底物结合时的[S]称饱和浓度。

酶影响反应的速率而不改变反应的平衡

E+S⇌ES⇌EP⇌E+P

or

E+S⇌ES⇌E+P

用热力学描述:

S=可逆P

K´eq=[P]/[S]平衡常数

△Go´=-RTlnK´eq（标准自由能的变化）

R-气体常识数8310-3kJ/mol

T----绝对温度，298K（250C）

几个概念：

groundstate（基态）:

正向或逆向反应的开始点。

transitionstate（过渡态ES）：

在酶促反应中底物转化为产物的过程中所经过的状态,是不稳定的化学状态，并非ESorEP。

ReactionIntermediates（反应中间体）：

ESorEP

biochenmicalstandardfreeenergychange（生化标准自由能变化△G0'）：

pH7.0下标准自由能的变化。

Activationenergy（活化能△G）：

基态和过渡态之间的能量差异。

Rate-limitingStep（限速步骤）：

当一个反应需要多个步骤时，总反应速率由反应活化能最高的一步决定。

2.酶促反应的动力学方程式——米氏方程

Michaelis-Menten于1913年，利用中间产物学说，推导出了表示[S]与v之间定量关系的米氏方程。

1）单底物的酶促反应----米氏方程的推导

该学说的前提:

反应速度为初速度v0,此时v0与[E]成正比,避免了反应物及其他因素的干扰。

酶底物复合物处于稳态,即[ES]不发生变化。

符合质量作用定律。

按中间产物学说，单底物的酶促反应，表示为：

2）关于Km

将米氏方程式进行整理后，可得：

Km=[S]（Vm/v0－1）

米氏常数的物理意义

当酶促反应处于v0=1/2Vm时，则Km=[S]

即Km是反应速度v达到最大反应速度Vm一半时的底物浓度,单位为mol/L或mmol/L。

Km值是酶的特征常数，与酶的浓度无关。

不同的酶有不同的Km，催化同一个反应的双底物，每个底物有各自的Km。

若一个酶有几个底物，则对每一个底物都有Km，且受pH,温度等影响，其中最小的称为天然底物.

当k3<

Km值越大，达到Vm的一半时所需底物浓度也大，酶与底物之间的亲和力弱。

Km=（k2+k3）/k1

3）关于Vm

酶的特征常数，现实条件下，酶促反应很难达到此

值。

随着[S]增加，v只能接近此值。

某些情况下，能得到的最大反应速度远低于理论值，

原因：

a,底物溶解性不好

b,酶的活性会被高浓度的底物抑制，即底物抑制。

Km与Vm的求法—双倒数作图法

为得到准确的Km值，把米氏方程变成为相当于y=ax+b的直线方程，再用图解法求Km值即双倒数作图法。

选择不同的测定相应的v0，求出两者的倒数，以1/v0对1/[S]作图，绘出直线。

此法方便而应用广泛，但点过分集中于直线的左端，作图不易十分准确。

Hanes-Woolf作图法：

4）关于催化常数（catalyticconstant）----kcat

米氏方程对许多酶适用，但不能说明一个连续

反应步骤的数目、速度和化学本质。

此时,大多数酶以饱和状态存在,则Vm=k3[Et]。

K3

是限速的。

为描述任何酶促反应在饱和情况下的限速步骤，引入另一个速度常数kcat，kcat整合了在ES和E+P之间所有反应的速度常数。

如果一个多步反应中有一个限速步骤，kcat就等于此步骤的速度常数，Vm=k3[Et]=kcat[Et]。

当限速步骤多时，kcat就是这几个步骤的速度常数的复杂函数。

kcat也称转换数（turnovernumber）在酶被底物饱和时，一个酶或酶的活性部位在单位时间内被转变为产物的底物分子数。

是酶最大催化活性的一种量度。

kcat=Vm/[Et]

或是每摩尔酶活性部位每秒钟转化为产物的底物的量（摩尔）。

单位为时间-1（s-1）。

5）关于kcat/K

当[S]<

kcat/Km是表观二级速率常数,用于评价酶的动力学效率。

可比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率。

比值越大表明酶的催化效率越高。

上限约为108-109M-1S-1,是两个不带电分子在生理温度下，通过扩散相遇的最快速度。

比值接近上限的酶被认为达到‘完美催化’。

2.多底物的酶促反应

二.抑制剂对酶的抑制作用

失活作用（inactivation）:

凡可使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用。

抑制作用（inhibition）:

由于酶的必需基团化学性质改变，但酶未变性，故引起酶活力降低或丧失.

抑制剂（inhibitor）:

引起抑制作用的物质。

抑制作用类型:

可逆抑制作用

不可逆抑制作用

（一）可逆抑制作用

可逆抑制作用:

抑制剂与酶非共价可逆结合，可用透析、过滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶的活力可逆抑制剂与游离状态的酶之间存在着一个平衡。

根据抑制剂与底物的关系，分为三种:

1.竞争性抑制作用

竞争性抑制剂分子结构与底物分子结构非常近似。

能以非共价键在酶分子的活性中心处与酶分子结合。

抑制剂（I）与底物分子竞争酶的活性中心。

竞争性抑制剂的作用

机理：

占据了酶分子的活性中心，使酶的活性中心无法与底物分子结合。

结果：

没破坏酶分子的特定构象，酶分子的活性中心没解体。

解除：

加入大量底物，提高底物竞争力。

竞争性抑制作用小结：

1.Vm：

不变，但达到Vm时所需底物的浓度明显增大。

Km：

变大，K'>KK'随[I]的增加而增加。

K'm>Km，K'm2.双倒数作图直线相交于纵轴，抑制率与[I]成正比，而与[S]成反比。

例1:

丙二酸、草酰乙酸、苹果酸对琥珀酸脱氢酶的

抑制。

例2：

磺胺药杀菌作用

磺胺药是对氨基苯甲酸的竞争性抑制剂，抑制二氢叶酸合成酶。

对氨基苯甲酸是叶酸结构的一部分，缺少叶酸,细菌生长繁殖会受到影响。

2.非竞争性抑制

抑制剂与底物的分子结构相差很大

机理：

I与酶活性中心以外的基团结合后，活性中心构象改变，但还可与S继续结合，生成的IES,不能进一步分解为产物，降低酶活。

类型：

纯粹非竞争性抑制:

I与E或ES结合时，具同等亲和力,

两者没有竞争作用。

混合非竞争性抑制:

I与E或ES结合时，具不同亲和力。

纯粹非竞争性抑制作用小结：

1.Vm减小，Km不变

I与E生成不受[S]影响的IE和IES，降低了正常中间产物ES的浓度。

Km是特征常数，不受[ES]变化的影响；但Vm与[ES]有关，因为v=k3[ES]，Vm是v的极限值。

2.双倒数作图直线相交于横轴。

抑制率与[I]成正比，与[S]无关。

即[I]不变时，任何[S]的抑制率是一个常数。

3.反竞争性抑制作用

机理：

有些抑制剂只能和ES复合物结合，形成EIS，不能和酶直接结合，但EIS不能转变成产物，从而抑制酶的活性。

特点：

恰恰与竞争性抑制作用相反，称为反竞争性抑制作用。

反竞争性抑制作用小结：

1.Vm变小Km变小

且K’

2.双倒数作图为一组平行线，抑制率既与[I]成正比，也与[S]成正比。

（二）不可逆的抑制作用

抑制剂与酶分子的活性中心的某些必需基团以共价键相结合，而使酶失活。

这种结合不能用简单的透析、超滤等物理方法解除抑制剂而恢复酶活性，必须通过化学反应才能把抑制剂从酶分子上除去。

不可逆抑制剂分为三大类

（1）基团特异性不可逆抑制剂

I与E共价结合，作用于酶的一类或几类基团，这些基团包含必需基团，作用后引起酶的失活。

有机磷化合物强烈地抑制对神经传导有关的乙酰胆碱酯酶活力,使乙酰胆碱不能分解而积累，引起神经中毒症状，因此这类化合物又称为神经毒剂。

（2）自杀性抑制剂（底物）----基于机制的抑制剂

根据酶的催化过程设计的抑制剂

特点：

与天然底物结构类似

本身是酶的底物,有潜伏的反应基团,当酶催化时，潜伏基团被活化，作用于酶活性部位，使酶失活。

自杀性抑制剂可完成正常酶促反应的前几步，但不能转化成产物，而是形成一种活泼的化合物不可逆地与酶结合。

三.影响酶反应速度的因素

1.酶浓度对酶促反应速度的影响

由米氏方程可推导出酶反应速度与酶浓度成正比的关系。

底物浓度足够大时，[S]在反应过程中改变很小，

可视为常数。

因此V0∝[E]。

2.温度对酶促反应速度的影响

温度对酶促反应速度影响很大，表现为双重作用：

（1）与非酶的化学反应相同，温度升高，活化分子数增多，酶促反应速度加快。

温度系数Q10多为1～2，即每增高反应温度10℃，酶反应速度增加1～2倍。

（2）随温度升高，酶蛋白逐步变性，即通过酶活力的减少而降低酶的反应速度，为稍有倾斜的钟罩形。

曲线顶峰称最适温度。

动物:

酶最适温度一在35～45℃

植物：

酶的最适温度为40～55℃

大部分酶在60℃以上即变性失活，少数酶能耐受较高的温度。

如：

牛胰核糖核酸酶（100℃）最适温度不是酶的特征性常数，不是一个固定值，与酶作用时间的长短有关仅仅在酶反应时间已经规定了的情况下，才有最适温度。

3.pH值对酶促反应速度的影响

酶具有最大活力时的pH值称为酶反应的最适pH。

曲线为较典型的钟罩形。

最适pH有时因底物种类、浓度及缓冲液成分不同而不同，不是一个常数，只一定条件下才有意义.动物：

最适pH大多在6.8～8.0;植物/微生物：

最适pH多在4.5～6.5;例外：

胃蛋白酶为1.9;精氨酸酶（肝脏中）为9.7

pH影响酶促反应速度的原因：

（1）过酸、过碱会影响酶蛋白构象，使酶变性失活。

（2）pH影响酶分子侧链上极性基团的解离，改变它们的带电状态，使酶活性中心的结构发生变化。

（3）pH能影响底物分子的解离。

pH的改变影响了这些基团的解离，使之不适于与酶结合，反应速度亦会减慢。

pH改变，会影响酶与底物的结合、产物的生成，从而影响酶反应速度。

4.激活剂对酶促反应速度的影响

凡能提高酶活性的物质称激活剂，分为三类：

（1）无机离子

K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+等，其中Mg2+是多种激酶及合成酶的激活剂。

Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。

金属离子作为激活剂的作用：

a.作为酶的辅因子；

b.是在酶与底物的结合中起桥梁作用。

（2）中等大小的有机分子

某些还原剂，如Cys、GSH等能激活某些酶，提高酶活性。

（3）具有蛋白质性质的大分子

这类激活剂专指对某些无活性的酶原起作用的酶。

酶的作用机制

一.酶的活性中心

（一）酶的活性中心

1.概念

反应中酶与底物接触结合时，只限于酶分子的少数基团或较小的部位。

酶分子中直接与底物结合，并催化底物发生化学反应的部位，称为酶的活性中心（activesite）。

2.特点

只占整个酶分子体积的1-2%。

在一级结构上可能相距很远，但在空间结构上可

能很近。

并非和底物的形状正好互补----而是诱导契合。

位于酶分子表面的一个裂缝内。

底物与酶的结合通过非共价键。

具有柔性和可运动性。

酶变性过程中，活性部位最先被破坏。

4.活性中心的两个功能部位

结合部位:

与底物结合的,决定酶对底物的专一性。

催化部位:

催化底物发生键的断裂及新键的形成，

决定酶促反应的类型，即酶的催化性质。

常见AA:

Asp、Glu、Ser、Thr、His、Cys、Lys

5.必需基团

AA侧链基团若经氧化、还原等化学修饰而发生改变，则酶的活性丧失，称这些基团为必需基团。

（二）酶与底物分子的专一性结合

指酶对底物及其催化反应的严格选择性程度。

通常酶只催化一种或一类相似的反应。

不同的酶具有不同程度的专一性，分为三种：

1.绝对专一性

酶对底物要求很严格，只能催化一种底物向一个方

向发生反应。

若底物发生细微的改变便不能催化。

2.相对专一性

酶对底物的专一性程度要求较低，能催化一类具

有类似的化学键或基团的物质反应。

分为两类：

（1）键专一性

该酶只对底物中某些化学键有选择性催化作用，

对此化学键两侧连接的基团无严格要求。

如酯酶作用于底物中的酯键，而对酯键两侧的酸和醇的种类均无特殊要求。

（2）基团专一性

酶作用底物时，除要求底物有一定的化学键，还对键的某一侧基团有特定要求。

α-D-葡萄糖苷酶:

酶对α-糖苷键和α-D-葡萄糖基团具有严格选择性，而R基团则可以是任何糖或非糖基团。

3.立体专一性

一种酶只能对一种立体异构体起催化作用，对其对映体则全无作用。

该类酶相当普遍。

L-乳酸脱氢酶:

只催化L-乳酸脱氢生成丙酮酸，对其旋光异构体D-乳酸则无作用。

4.酶作用专一性的假说

钥匙-锁学说

1890年由EmilFischer提出的“钥匙-锁学说”。

该学说属刚性模板学说，可较好地解释酶的立体专一性。

锁钥学说的不足：

虽然说明了酶与底物结合成中间产物的可能性及酶对底物的专一性，但对于可逆反应，很难解释酶活性中心的结构与底物和产物的结构都非常吻合，因此“锁钥学说”把酶的结构看成是固定不变是不切实际的。

诱导契合学说

1958年由D.E.Koshland提出：

诱导是双向的

酶:

大分子，可转动的化学键多，易变形；

底物:

小分子，可供选择的构象有限。

底物对酶的诱导是主要的。

二.影响酶催化效率的有关因素

（一）酶和底物间的弱相互作用力是催化作用的关键

1.酶和底物间的弱相互作用在过渡态----过渡态稳定学说

为催化反应的进行，酶必须同反应的过渡态互补。

意味着酶与底物间的最佳相互作用（通过疏水作用）仅发生在过渡态。

过渡态中形成的弱相互作用是对催化作用作出主要贡献的部分。

2.结合能对反应特异性和催化高效性做出贡献

结合能（bindingenergy，△GB）：

是酶与底物相互作用的能量。

是酶用来降低反应活化能的主要自由能来源。

结合能为催化提供了能量，也赋予了催化的专一性。

酶的大多数催化力最终来源于酶与底物形成多个弱键和相互作用时释放的自由能。

结合能与酶的催化作用和作用的特异部位都有关。

3.酶与底物的过渡态互补的证据

1）结构与活性的关系

酶与过渡态互补，则酶与底物的一些功能团必须在过渡态中而不是在ES复合物中优先结合。

改变这些功能团应对ES复合物的形成影响不大，即对E+SES平衡的动力学参数如Km影响不大。

但对总的反应速度（kcatorkcat/Km）影响很大。

2）过渡态类似物

可利用对反应机制的了解来推测过渡态的近似结构，设计一些与过渡态类似的稳定分子，称过渡态类似物。

有些类似物与酶的结合是底物与酶结合的102到106倍。

很好地证明了酶的活性部位与底物的过渡态是互补的。

如抗艾滋病的高效药物就是根据HIV蛋白酶的活性部位设计的与之紧密结合的过渡态类似物。

3）催化性抗体

即抗体酶，是抗体的高度特异性与酶的高效催化性巧妙结合的产物，是一类在可变区赋予了酶活性的免疫球蛋白。

设计一种S-P的过渡态类似物，则与这种类似物紧密结合的抗体就有可能催化S-P的反应。

动物的免疫系统能制造大约1010种不同的抗体分子，意味着可制造出能合成的任何分子的抗体。

Q1：

如何选择和合成正确的过渡态类似物？

基于对反应本身的性质、复杂性及反应机制的了解。

Q2：

如何制造出大量的合适抗体？

与一个特定抗原结合的相同抗体----单克隆抗体。

（二）酶和底物复合物的形成伴随着熵减

在ES复合物中,E和S并不完全互补，只涉及部分作用力。

ES复合物的形成，引起反应物向过渡态转变，但还未达到过渡态。

在形成ES复合物时底物特异性地失去水合作用溶液中的酶、底物迫使