HPLC仪器确认.docx
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HPLC仪器确认
欧洲委员会官方药品控制实验室（OMCL）网络质量保证文件
PA/PH/OMCL（07）17DEF
仪器确认
ANNEX1:
QUALIFICATIONOFHPLCEQUIPMENT
附件1：
HPLC仪器的确认
文件全名和索引号
仪器的确认
HPLC仪器的确认
PA/PH/OMCL（07）17DEF
文件类型
指南
立法基础
本文件也被EA接受并作为推荐文件，将其用于OMCLs的质量管理体系审核中
首次发行日期
2005年5月
首次执行日期
2005年6月
修订后执行日期
2007年2月
原文件名/其它索引号
本文件取代文件PA/PH/OMCL（06）85DEF
保管机构
本文件由欧洲委员会的OMCL网/EDQM拟定
相关网络
GEON
OMCL网络指南“仪器的确认”附件Ⅰ
HPLC仪器的确认
概述
本文件是核心文件“仪器的确认”第1个附件，在计划、实施和记录HPLC仪器的确认过程时，应将本文件与核心文件一起使用。
核心文件包括了第一级和第二级确认的通用介绍，适用于所有类型的仪器，本附件包括了HPLC仪器相关的需要检查的参数和相应典型的可接受标准的推荐，以及可用于进行这此检查的实用方法学举例。
在进行HPLC仪器确认时，应注意也可以对第三级和第四级几个提到的参数采用联合检测程序同时进行检查（例如“全面”系统性能检查，同时给出峰面积精密度、保留时间精密度、梯度重复性等的信息）。
表III
第III级定期主动的仪器检查
HPLC仪器和检测器要求举例
仪器模块
需检查的参数
典型允差限度
溶剂传送系统
•流速
•准确度和精密度（梯度测试）
•配比波纹
•±5%
•±2
•≤0.2%
进样器
•进样量精密度
•残留
•RSD≤1.0%
•见附件Ⅰ
自动进样器
•恒温准确度和精密度
•±3°C
柱温箱或冷却装置
•恒温准确度
•±2°C
UV/DAD检测器
•线性
•波长准确度
•r2≥0.999
•±2nm
荧光检测器
•波长准确度激发
•波长精密度发射
•灵敏度
•±3nm
•±3nm
•见附件Ⅰ
电化学检测器
•信号精密度
•信号稳定性
•见附件Ⅰ
•见附件Ⅰ
RID检测器
•信噪比
•漂移
•见附件Ⅰ
•0.1mV/min
CD检测器
•信噪比
•灵敏度
•漂移
•线性
•见附件Ⅰ
•见附件Ⅰ
•见附件Ⅰ
•r>0.999
表IV
第IV级在用仪器检查
配备UV或DAD检测器的HPLC仪器的要求举例
需检查参数
限度
方法系统适用性检查
根据欧洲药典或MAH文件或公司内部经过验证的方法
峰面积准确度（适用于供试液中主峰面积）
RSD≤1.5%
除非在方法的系统适用性里有描述，例如EP2.2.46特定要求，原料药各论或MA文件
保留时间精密度
RSD±5%
残留（通过比较连续（进行定量检测的物质）标准和空白进样）
≤0.2%
信噪比（用于有关物质检测）
根据欧洲药典
附件I
第III级定期主动的仪器检查
本附件包括一些实用几个与HPLC不同模块相关的参数检测举例及其相应的可接受限度。
这些例子可以认为是OMCL实验室可能的进行第三级仪器确认的方法“周期主动仪器检查”。
高压液相溶剂传输系统
以下测试作为HPLC溶剂传输系统周期性主动检查：
流速和梯度检查。
流速
材料：
5ml或10ml的容量瓶
校正过的气压计
设置：
流动相：
脱过气的水
无柱（开放式）*
流速：
调节在0.5到3.0ml/min
如果有安装高压混合系统，本测试应在每一溶剂通道进行。
*对于一定的仪器，例如，流速较低时，采用一根柱子或背压调整器进行检查。
方法:
将流速设定在一个合适的水平，测量将容量瓶装满至刻度的时间。
记录所用的时间。
f＝V/tf＝（V×60）/t
f.................测量的流速[ml/min]
t.................充满至刻度所花的时间[s]
V...............容量瓶的体积[ml]
D＝100×（f－F）/F
D...............偏差[%]
F..............调节后的流速.[ml/min]
f.................测量的流速[ml/min]
限度:
±5%
梯度组成和波动
设置：
不锈钢毛细管，例如2000*0.12mm，代替色谱柱安装于仪器
检测器：
紫外检测器调节至265nm
流动相A：
脱气水
流动相B：
含0.5%的脱气水
流速：
1.0ml/分钟
方法:
按下列方法进行测试，根据通道数量不同使用下列不同系统参数和梯度进行洗脱：
A-B
A-B和A-C
A-C,A-B和B-D
时间[分钟]
%流动相A（水相）
%流动相B
（水-丙酮混合物）
0.0
100
0
0.1
90
10
10
90
10
10.1
50
50
20
50
50
20.1
10
90
30
10
90
30.1
0
100
40
0
100
40.1
100
0
开始测试前，先用水平衡系统至少10分钟。
开始时的0%值是基线值。
所有步骤均在开始时测量基线的水平部分，由软件或手动在纸上用衬垫打印。
100%水/丙酮混合物的高度在以下计算中作为100%值。
%H＝100*h/H
%H............计算组成
h................测量线的高度
H...............100%水/丙酮混合物线的高度（流动相B）
d＝%H－G
d................偏差
G...............梯度组成调节【%丙酮/水溶液混合物=流动相B】
限度:
绝对偏差：
调整值的±2
梯度组分的波动为梯度程序噪声基线的50%
%R＝100*N/h50
%R............波纹
h50.............50%的线高度
N...............噪声线高度，在线性区域1分钟测量的结果
限度:
≤0.2%
进样器
建议在HPLC进样器周期性主动检查中进行体积精密度和残留检查。
体积精密度和残留
溶液：
溶液A：
乙醇：
水（试剂）=60：
40
对照液（a）：
取15.0mg乙基、甲基和尼泊金丙酯溶于100.0ml溶剂A中
对照液（b）：
取1.0ml对照液（a）用溶于10.0ml溶剂A中
对照液（c）：
取1.0ml对照液（b）用溶于100.0ml溶剂A中
设置：
色谱柱：
Lichrospher100RP8,5um,125x4mm,无衬管
流动相：
乙醇：
水=60：
40
流动速度：
1.0ml/分钟
检测器：
254nm
进样体积：
20ul
方法:
进样序列
—对照液（b）6针
—对照液（a）1针
—溶剂A（空白）1针
—对照液（b）1针
—溶剂A（空白2）1针
—对照液（c）1针
限度s:
峰面积重复性：
对照液（b）色谱图中所有峰的峰面积相对标准偏差应≤1.0%。
残留：
尼泊金丙酯在空白图谱中的峰面积不超过在空白后进样的对照液（b）中尼泊金丙酯的对应峰面积的10倍的0.5%。
在对照液（c）中尼泊金丙酯对应的峰面积为空白后进样的对照液（b）中尼泊金丙酯峰面积的0.9-1.1%。
液相色谱仪自动进样器
HPLC自动进样器的周期主动检查可以进行温度准确度和精密度检查。
温度准确性
材料
校正过的温度探头
方法:
在可操作范围或要求的温度范围内选择并设定一个温度，等待系统平衡。
采用校正过的温度探头，测量自动进样器的实际温度，与设定的温度进行比较。
在选定的温度范围内不同温度点重复相同的步骤。
限度:
实际温度与设定的温度相比差值不超过±3°C
温度准确性
材料
校正过的温度探头。
方法:
选择一个操作温度或要求的仪器温度范围，等待系统平衡。
采用校正过的温度探头，在预设的时间内进行n次测量，比较n次测量值的平均值与设定的温度。
限度:
实际温度与设定的温度之间差值不超过±3°C。
色谱仪柱温箱/降温设施
热力学准确性是在本例对HPLC柱温箱/降温设施周期主动检查的参数。
温度准确性
材料：
校正过的温度计
方法:
设定柱温箱温度为40°C，等待约30分钟平衡系统，将校正过的温度计放入柱温箱中，在10分钟后读取温度。
限度:
38-42°C.
紫外/DAD检测器
对于HPLC紫外/DAD检测器的周期主动检查，可以对线性和波长准确性进行检查。
线性
溶剂配制
标准2：
0.5μg咖啡因/1ml色谱级甲醇
标准2：
1.0μg咖啡因/1ml色谱级甲醇
标准3：
5.0μg咖啡因/1ml色谱级甲醇
标准4：
25.0μg咖啡因/1ml色谱级甲醇
标准5：
50.0μg咖啡因/1ml色谱级甲醇
标准6：
色谱级甲醇（空白）
标准5：
称取9.0至11.0mg咖啡因，用HPLC级别甲醇稀释至200.0ml
标准4：
取50.0ml标准5溶液用甲醇稀释至100.0ml
标准3：
取10.0ml标准溶液5用甲醇稀释至100.0ml
标准2：
取20.0ml标准3溶液用甲醇稀释至100.0ml
标准1：
取10.0ml标准3用甲醇稀释至100.0ml
设置
色谱柱：
RP-185um30-50x2,1-4.6mmorcapillary2000mmx0.12mmID
流动相：
色谱级甲醇
柱温箱温度：
40°C
流速：
1.0ml/min（用100%甲醇调整）
检测波长：
273nm
进样量：
20ul
方法:
进样序列
2xblank
1xStd.1
1xStd.2
1xStd.3
1xStd.4
1xStd.5
2针空白，标准1-5依序各一针
限度:
r2≥0.999
注：
由于此检测中要注入不同溶液，因此也包括了自动进样器样品瓶位置正确性的确认。
波长准确度
如果内置检测程序可以检测和调节波长准确度，则根据操作手册进行操作。
在所有其它情况下采用以下程序：
溶液
线性测试中咖啡因标准溶液5号
蒽水溶液
设置：
流动相：
15%乙腈水溶液
色谱柱：
RP18，5μm,30-50×2.1-4.6mm或毛细管柱20m×0.12mm内径
柱箱温度：
40℃
流速：
1.0ml/min（用15%的乙腈水溶液调节）
检测：
自230至290nm扫描（DAD）
进样体积：
20μl
方法:
DAD:
咖啡因溶液进样20μl，记录色谱图，最大吸收波长为272nm，最小为244nm。
UV/可见光：
向池中注入蒽溶液，将波长以1nm的步距从248变化至254nm，记录最大吸收值。
理论值为251nm。
限度:
≤2nm
荧光检测器
下面三个参数建议作为荧光检测器性能周期自主检查。
波长激发准确度
方法：
用去离子水淋洗并充满检测池
调节激发波长为350nm
测量发射波长减去397nm（理论值）
限度:
±3nm
波长发射准确度
方法：
用去离子水淋洗并充满检测池
调节发射波长为397nm
测量激发波长减去350nm（理论值）
限度:
±3nm
灵敏度
溶液：
二水盐酸喹啉溶液，浓度0.015μg/ml（=15ppb）。
喹啉溶液用以下流动相制备：
溶解6.8g磷酸二氢钾和3.0g己胺于700ml试剂级水中，用稀磷酸调pH至2.8，加90ml乙腈并用试剂级水稀释至1000.0ml。
设置：
色谱条件设定依据欧洲药典“盐酸喹啉”（01/2005:
0018），检测“金鸡纳生物碱”，改变流速和乙腈浓度。
流动相：
同上
色谱柱:
RP18,5μm,250×4.6mm
流速：
1.2ml/min
激发波长：
350nm
发射波长：
397nm
流动池体积：
8μl（此例中，使用的是Waters2475多荧光检测器，流动池体积可能根据仪器厂商不同而不同）。
方法:
进样喹啉溶液10μl，测量峰高度
进样空白溶液10μl，测量噪音峰高
将喹啉溶液峰高除以3倍噪音峰高
将喹啉溶液浓度除以之前的系数
限度限度s:
≤0.5ppb
高效液相电化学检测器
电化学检测器的信号准确度和稳定性是定期自主检测中需要测定的参数。
信号准确度和稳定性
设定：
空白池电压：
800mv
增加时间过滤：
0.1s
范围：
0.1nA
温度：
30℃
方法:
准确度：
检测电流并减去2.67nA（理论值）
稳定性：
连续5分钟测量噪音
限度：
准确度（池电流）：
0.05nA
信号（噪音）稳定性：
最大2pA或20mV
高效液相RID检测器
高效液相RID（折光率）检测器的信噪比和对时间的漂移是定期自主检测中需要测定的参数。
信噪比
溶液:
标准溶液：
D-左旋糖溶液4.0mg/ml（将200.0mg左旋糖+20ml水+25.0ml乙腈，用色谱纯水稀释至50.0ml）。
设置:
色谱柱：
spherisorbNH2（或相当的）250×4.6mm或其他
柱温箱温度：
38℃
流速:
1.0ml/min
进样量:
20μl
流动相：
0.253g磷酸氢二钠溶于220ml+780ml乙腈
方法:
平衡后，以流动相为空白进样三针，系统稳定运行适当时间，测定适当时长内噪音基线。
可接受基线噪音：
三次平行进样平均值<1000μV。
计算信噪比，左旋糖溶液0.4mg/ml进样三针，计算平均值。
限度：
信噪比≥10
指定时长漂移
方法：
计算任意一分钟信号随机波动幅度的斜率。
限度:
±0.1mV/min
也可以表达为△RI/min或者以选择量程的全范围%。
高效液相色谱CD检测器
建议配备有CD（圆二图谱）检测器的HPLC进行以下周期和主动检查。
线性和信噪比
溶液：
对照溶液（a）：
溶解25.0mgD（-）泛酰内酯于50.0ml水中
对照溶液（b）：
取对照溶液（a）2.0ml用水稀释至10.0ml
对照溶液（c）：
取对照溶液（a）4.0ml用水稀释至10.0ml.
对照溶液（d）：
取对照溶液（a）6.0ml用水稀释至10.0ml.
对照溶液（e）：
取对照溶液（a）8.0ml用水稀释至10.0ml.
对照溶液（f）：
取对照溶液（b）0.5ml用水稀释至25.0ml.
设定：
色谱柱:
C18,150×4mm,5μm
流动相:
acetonitrile乙腈:
water水=10:
90
流速:
1.0ml/min
检测波长:
225nm
进样量:
20μl
方法:
检查CD和UV对D（-）泛酰内酯对照溶液a,b,c,d,e信号的线性关系。
检查CD对对照溶液（f）在1-10分钟的噪声
—计算池中绝对浓度（μg）
—计算池中0.01μg信噪比（S/N）
—计算所得信噪比及信噪比为2（0.01x2/S/Ncalculated）时的灵敏度
限度:
线性：
由对照液（a,b,c,d,e）所得的校正曲线线性系统应>0.999。
灵敏度：
信噪比为2时灵敏度应好于0.01μg。
信噪比：
信噪比为1.0时的限度和灵敏度最大为0.020μg。
指定时间内漂移值
设定:
色谱柱:
C18,150x4mm,5μm
流动相:
乙腈:
水=10:
90
流速:
1.0ml/min
检测波长:
290nm
进样量:
20μl
方法:
进水样，停泵，5分钟后测量CD信号，持续1小时。
用标尺测量5到65分钟间的基线飘移
限度:
不超过0.1mdeg/h
谱图比较
溶液:
对照溶液（a）：
溶解5.0mg地塞米松于10.0ml40%乙腈中。
设定:
色谱柱:
C18,150x4mm,5μm
流动相:
乙腈:
水=40:
60
流速:
1.0ml/min
检测波长:
230nm
进样量:
20ul
方法:
比较检测器安装结果（见下表）
CD最大
CD最小
UV最大
222nm
224nm
236nm
230nm
252nm
284nm
限度:
最大和最小之间差异不可超过4nm。
HPLC离子阱质谱检测器
在本例中，使用一个热电液质联用仪。
为了使其适用于来自不同制造商的质谱参数，可能需要调整测试参数来适用于仪器性能。
通过选择内置选项“诊断测试”和设备“校准测试”进行定期的主动性离子阱质谱检测器检查。
此外，清洁离子源（电喷射离子化，ESI和大气压化学电离）和接口组件，进行以下测试（这些测试也可以按照质谱的“仪器使用中检查”进行）。
溶液：
利血平溶液：
标准溶液（a）：
称取10.0mg利血平，用7ml酸化甲醇溶解（含1%乙酸的甲醇）。
超声处理15分钟，振摇直至利血平溶解。
用酸化甲醇稀释至10.0ml。
（浓度：
1.0mg/ml）。
标准溶液（b）：
取1.0ml标准溶液（a）用甲醇/水混合溶液（60/40）稀释至100.0ml。
（浓度：
10.0μg/ml）。
设置：
离子源：
ESI和APCI
色谱柱：
XTerraMSC182.1*100mm，3.5μm
洗脱液A：
甲醇
洗脱液B：
用水稀释1.0ml蚁酸至500ml，用氨水调节pH至4.5。
流动相：
洗脱液A：
洗脱液B=60:
40
ESI离子源是通过“直接注入”，APCI离子源由“流动注射”。
光谱应采取的“轮廓”模式。
质谱中设定分离宽度1.0amu。
表1：
MS2中ESI和APCI的设置
m/z
@1）
范围（m/z）
MS2
609.4
35.00
165-800
1）@碰撞能量
方法：
MS1和MS2谱的质谱参数使用10.0μg/ml的利血平溶液进行检测。
另外，MS2谱采取无碰撞能量。
这种强度应与MS1选择的离子强度幅度有相同的顺序，如果不是，MS应该被重新校准。
为了进行测试，采取MS2谱，在每一个20扫描。
限度：
表2：
ESI和APCI的离子和质量
m/z
范围（m/z）
MS1
609.5
±0.5
MS2
577.3
±0.5
448.2
±0.5
436.1
±0.5
397.2
±0.5
365.2
±0.5
195.0
±0.5
解析力：
在配置模式下m/z=609.5，610.5和611.5的峰谷，不应超过10%。
HPLC质谱仪四极探测器（API-ESI）
比例中使用AgilentG1946CLC/MSDModelVL。
为了使其适用于来自不同制造商的质谱参数，可能需要调整测试参数来适用于仪器性能。
调整
调整（信号优化）是调整MS调谐参数使其达到最大灵敏度的过程。
为了得到调谐过程结果，进行质量轴校准（校验中对应的目标块中的），并调整质量峰宽/分解和离子光度（最佳的离子传输）。
材料：
校准：
LC-MSESI调整，G2421A，目标质量112.99,601.98和1033.99amu。
设置：
分辨率设置目标PW（半高）0.65（前设置值，取决于分子质量）。
方法：
在正电荷和/或负电荷模式中，人为或自动优化时使用质谱校准器。
优化的质谱调整参数保存在一个调谐文件中（*.tune）。
限度：
质心轴差异≤0.13amu
峰宽差异≤0.1amu
灵敏度（ESI）
溶液：
缓冲液：
50:
50甲醇/水，使用1%乙酸酸化。
利血平溶液浓度：
2.0pg/μl
量取1.0ml5.0ng/ml利血平溶液（安捷伦G2423A）至50ml容量瓶中配置利血平溶液。
使用50:
50甲醇/水稀释至50ml刻度线。
量取1.0ml第一种稀释液至第二个50ml容量瓶中。
使用50:
50甲醇/水稀释至50ml刻度线。
设置：
分析前在质谱方法中定义调整文件。
进样量：
5μl（样品进样总量：
10pg）
峰宽：
0.08min
流速：
1.0mi/min
进样间隔：
1.0min
SIM（正电荷模式）离子609.3，碰撞诱导解离150，增益3.0，SIM高分辨率。
方法：
使用流动注射分析检测API-ESI（正电荷SIM模式）。
限度：
在609.3m/z处S/N比率（利血平）>10:
1
可以在时间趋势控制图中绘制S/N的结果。
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