《医学细胞生物学》设计型实验.docx
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《医学细胞生物学》设计型实验
设计型实验设计报告
实验项目：
动物细胞融合
细胞核的分离与鉴定
小组成员：
班级：
医学细胞生物学设计型实验设计报告
姓名班级学号评分
实验项目：
动物细胞融合
实验原理：
细胞融合，即在自然条件下或人工方法（生物的、物理的、化学的），是两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。
有性繁殖时发生的精、卵细胞结合是正常的细胞融合。
诱导融合的方法很的，常用的主要有生物法（灭活的仙台病毒）、化学法（聚乙二醇）、物理法（电泳）。
灭活的仙台病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似，且病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。
PEG是一种去垢剂，能破坏互相的接触的磷脂双分子层，从而是相互接触的细胞膜之间的融合，形成一个双核或多核的细胞。
目前用得最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便、且融合效果稳定。
实验步骤：
（1）50%PEG夜的制备
称取一定量的PEG（Mv=4000）放入烧杯中，沸水浴加热，使之溶化，待冷却至0℃时，加入等体积预热至50℃的无血清1640液混匀，置于37℃中保温备用。
（3）大白鼠细胞的制备
左手抓老鼠，将大白鼠头部向下，右手持尖头镊子轻轻插入眼眶中，然后将眼球向外拉出。
①将流出的血置于事先盛有Alever溶液的烧杯中制成1：
4的悬液。
②取1ml的悬液加入4ml的生理盐水，混匀平稳之后，800r/min离心3min,弃去上清液，再按上述条件离心2次。
③最后弃去上清液加hanks液4ml离心1次，再弃去上清液后，将离心管倒置于滤纸上，尽量流尽剩余液体（液体残余会改变PEG浓度）
（4）诱导与温育
用手指轻弹离心管底壁，是沉淀物松散，然后吸取50%的PEG0.5ml,在37摄氏度水浴中，缓慢逐滴加入离心管中（90s以内），边加边摇动离心管，使之与细胞混合均匀，然后加入8-10ml左右hanks液轻轻吹打（防止融合的细胞分开）混匀，放入37℃水浴箱中静置5min（以稀释PEG），之后离心弃去上清液，加hanks液5ml离心1次，弃上清液，之后加入含小牛血清的1640培养液，在37℃的水浴中培养30分钟。
（5）染色观察
分别于温浴5min、10min、20min、30min的时段取细胞悬液一滴制成临时装片，以0.2%次甲基兰染液染色三分钟后，盖上盖玻片，放在显微镜下进行观察。
实验结果分为五个阶段：
1、两个细胞的细胞膜之间相互接触粘连
2、相接触的两细胞膜破口粘合。
形成细胞膜通道
3、两细胞之间的细胞质相通，形成细胞质通道
4、通道扩大，两细胞连成一体
5、细胞核并完成，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞
均能在不同时间的临时装片上看到
预期结果：
在显微镜下可看见有2个或2个以上的大白鼠细胞膜融合在一起，形成1个异核体细胞。
细胞融合率的计算：
融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞，其细胞核的总数与此视野内所有细胞的细胞核总数之比。
通常用百分数来表示，且进行多个视野测定，求平均值，在统计较为准确。
计算公式：
融合率=
×100%
注意事项：
1、pH为8.0-8.2是影响细胞融合与否的关键因素之一
2、制备50%PEG保温在37-39℃水浴中，不然冷却后晶体析出，且细胞融合对温度很敏感。
3、为观察细胞融合的形态需对细胞进行染色除詹姆斯绿外还可用HE染色。
4、在离心管中加入PEG前，一定要将离心管倒置于滤纸上，流尽剩余液体，否则残留液会改变PEG液的浓度。
5、PEG的处理时间:
处理时间越长，融合效果越好,但对细胞的毒害也就越大。
故一般将处理时间限制在1分钟之内。
教师：
日期：
实验仪器、设备、器具表
实验项目：
动物细胞融合
表1—1实验仪器表
名称
规格、型号
数量
说明
显微镜
1
观察
尖头镊子
1
夹取、染色等
水浴箱
1
恒温处理
离心机
1
离心
载玻片/盖玻片
4
制作装片
10ml离心试管
10
装待离心液
10ml量筒
2
量取试剂
大烧杯
1
盛装废弃液体
实验项目：
动物细胞融合
表1—2实验材料和试剂表
名称
规格
用量
说明
大鼠
1
聚乙二醇
Mv=4000
诱导剂
hanks液
缓冲液，等渗液
0.2%次甲基兰染液
染色剂
RPNI1640培养液
10%灭活小牛血清和无血清两种
营养液
Alever溶液
抗凝暂时保持细胞完整
医学细胞生物学设计型实验设计报告
姓名班级学号评分
实验项目：
细胞核的分离与鉴定
实验原理：
细胞核：
它是由核膜（nuclearmembrane）、核骨架（nuclearscaffold）、核仁（nucleolus）几部分组成。
细胞核的主要构造为核膜，是一种将细胞核完全包覆的双层膜，可使膜内物质与细胞质、以及具有细胞骨架功能的网状结构核纤层分隔开来，其上特殊物质可被染色剂染色显现出颜色。
核体的制备:
核体是指含有少量细胞质并由质膜包裹的细胞核。
分离细胞核的可用方法有吸出法、原生质体破裂法、差速离心法排和排除法。
差速离心法是根据细胞内各种细胞结构的比重和大小不同，因而在同一离心场内的沉降速率不同从而将细胞内的结构分级分离出来。
本实验就采用差速离心法。
细胞核的鉴定，甲苯胺蓝可使细胞核呈蓝紫色
实验步骤：
（1）、断头法处死小白鼠，手提尾部使腹内血液尽量流出，迅速解开其腹腔取出肝脏，去出结缔组织，剪成小块，尽快置于盛有0.9%NaCl的烧杯中。
反复洗涤尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。
（2）、将湿重为1g的肝组织放入烧杯中，用量筒取8ml预冷的0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液，先加少量溶液于烧杯中，尽量剪碎肝组织后全部加入。
（3）、将剪碎的肝组织导入匀浆管中，使匀浆器下端侵入盛有冰块的器血中，左手持，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨多次，直至看不到明显组织块。
用8层纱布过滤于匀浆管中，然后制备一张涂片①，自然干燥。
（4）、将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机以2500r/min离心15min,弃去上清液，大约剩余1ml上清液，然后取上清液制备一张涂片①，自然干燥。
将残留液体用气管吹成悬液，滴一滴于干净的载盖玻片上，制成涂片②，自然干燥。
（5）、固定，将制备好的涂片放入70%的乙醇中固定5min,晾干。
（6）、染色，分别在涂片①②上滴加1%甲苯胺蓝染色液，染色5-7min
（7）、流水冲去染液，晾干
（8）、镜检显微镜下观察并分析
注意事项：
（1）、在染色时时间一定要足够，否则染色不完全会得到不理想的结果。
（2）、去掉胞质的核体贴附能力弱，应注意在用固定、染色时尽量避免胞核的脱落。
预期结果：
在低倍镜下找到标本，再换高倍镜，可以观察到经.1%甲苯胺蓝染液染色的小白鼠肝细胞的细胞核已经游离出来，被染成蓝紫色，圆形，即细胞核。
教师：
日期：
实验仪器、设备、器具表
实验项目：
动物细胞细胞核的分离与鉴定
表2—1实验仪器表
名称
规格、型号
数量
说明
显微镜
普通离心机
离心管
滴管
玻璃漏斗
量筒
烧杯
解剖剪
镊子
玻璃匀浆器
载玻片/盖玻片
吸纸
纱布
实验项目：
动物细胞细胞核的分离与鉴定
表2—2实验材料和试剂表
名称
规格
用量
说明
小白鼠肝脏
0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液
蔗糖85.5g;CaCl20.33g
1%甲苯胺蓝染液
蒸馏水
生理盐水
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