杀菌率试验规程.docx
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杀菌率试验规程
Q/KM—ZJ——2008
液体洗涤剂杀菌试验规程
（内部使用）
2008年月日内部执行
质量管理中心实验室
引用标准
1、GB15979-2002一次性使用卫生用品卫生标准
2、QB/T2738-2005日化产品抗菌抑菌效果的评价方法
3、QB/T2850-2007抗菌抑菌型洗涤剂
4、2002年版《消毒技术规范》（中华人民共和国卫生部）
5、2001年版《药品微生物学检验手册》（科技出版社）
杀菌率试验规程
1、试验菌、试验温度、作用时间、试液浓度
试验菌种：
金黄色葡萄球菌（ATCC6538），大肠杆菌（8099或ATCC25922），白色念珠菌。
试验温度：
20℃±1℃。
作用时间：
最短不得小于30s。
常规作用时间为2min、5min、10min、20min。
试液浓度：
中和剂鉴定用试液浓度应为正式杀菌试验最高浓度。
菌悬液用量：
正式杀菌试验用菌悬液的浓度、取量应与中和剂鉴定中1组、2组所用菌悬液的浓度、取量相同。
2、细菌繁殖体悬液、菌片的制备程序：
2.1菌悬液的制备
⑴取冻干菌种管，在无菌操作下，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吸吹数次，使菌种融化分散。
取含5.0ml-10.0ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18h～24h。
用接种环取第1代培养的菌悬液，划线于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养18h～24h。
挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37℃培养18h～24h，即为第3代培养物（放在4℃左右冰箱中保藏。
每隔2-3个月移种一次，继续保藏。
）。
⑵取第3代～14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（经18h～24h培养），用5.0ml吸管吸取3.0ml-5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。
随后，用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中，在手掌上振敲80次（力度适中，勿溅出），以使细菌悬液均匀。
或从新鲜菌种斜面沾取少量菌苔，接种在适合试验菌生长的培养基中，37℃培养18h～24h（或适宜时间）。
作为原菌液。
（源于《药品微生物学检验手册》211页）
⑶细菌繁殖体悬液应保存在4℃冰箱备用。
尽量减少在室温下放置时间，以减少细菌的自然死亡。
应当天使用不得过夜。
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回收菌数为1×10～9×10
cfu/ml用PBS液配置GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》
回收菌数为1×108—5×108cfu/ml用TSB营养肉汤配置—2002《消毒技术规范》
2.2、菌片的制备程序：
《消毒技术规范》
⑴取冻干菌种管，在无菌操作下，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吸吹数次，使菌种融化分散。
取含5.0ml-10.0ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18h～24h。
用接种环取第1代培养的菌悬液，划线于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养18h～24h。
挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37℃培养18h～24h，即为第3代培养物。
⑵取第3代～14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（经18h～24h培养），用5.0ml吸管吸取
3.0ml-5.0mlTSB营养肉汤加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。
随后，用5.0ml吸管将洗液移至另一
无菌试管中，在手掌上振敲80次，以使细菌悬液均匀，含菌量1×108—5×108cfu/ml。
⑶用无菌镊子夹住已灭菌10mm*10mm滤纸一角，一面朝上，注入10ul菌悬液，放到无菌平板内，37℃温箱中干燥20min-30min，（或在室温自然阴干后使用）制成菌片。
每个菌片回收菌落，按活菌培养计数所得结果，应为5×105—5×106cfu/片。
）
⑷细菌繁殖体悬液和菌片，用毕应随时保存在4℃冰箱内。
尽量减少在室温下放置时间，以减少细菌的自然死亡。
（应当天使用不得过夜。
）
3、操作程序
3.1、悬液定量法杀菌试验操作程序
⑴、样品用无菌标准硬水稀释至同中和剂鉴定用试液浓度，或低于中和剂鉴定用试液浓度，制成（稀释液）试验样液。
⑵、将试管按需要数量分别排列于试管架上，各组由左向右，排序、标记。
44
⑶、配制菌悬液，浓度为1×10～9×10
cfu/ml—GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》或1
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×10—5×10cfu/ml—2002《消毒技术规范》
⑷、取杀菌试验用无菌大试管，先加入0.5ml试验用菌悬液，再加入0.5ml有机干扰物质，混匀，置20±1℃5min，用无菌吸管吸取步骤1中的试验样液4.0ml注入其中，立即开启计时器，并迅速混匀（在手掌上振摇80次）。
-见《消毒技术规范》或吸取试验用菌悬液0.1ml，加入到含5ml样液的试管中，立即开启计时器，并迅速混匀（在手掌上振摇80次）。
-见QB/T2738-2005
⑸、作用2min、5min、10min、20min，即刻用无菌吸管吸取0.5ml移入鉴定合格的4.5ml中和剂溶液中（中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）充分混匀，中和作用10min后，取样液、10倍系列稀释液0.5ml（见GB15979-2002）或分别吸取1.0ml（-见《消毒技术规范》）（见图四），置于2个灭菌平皿，用凉至40～45℃营养琼脂培养基或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35℃±2℃培养48h（细菌）或（酵母菌）25℃±2℃培养72h，作活菌菌落计数。
⑹、同时用稀释液代替样液进行平行试验，作为阳性对照管。
⑺、阴性对照组：
分别吸取试验用相关溶液和培养基进行培养，观察有无污染。
⑻、计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。
以菌落数在15cfu～300cfu的平板为准，每个稀释度3个平板生长菌落数全部合乎上述标准，则以该3个平板的菌落平均值作为结果；若有2个符合合乎上述标准，则以该合格的2个平板菌落的平均值作为结果。
⑼、试验重复3次，求其平均值。
根据各组活菌浓度（cfu/ml），计算杀菌率，见计算公式1。
或根据各组活菌浓度换算为对数值（N），计算杀灭对数值，见计算公式2。
3.2载体法杀菌试验操作程序
⑴、试验样品用无菌标准硬水（过滤除菌）稀释至规定浓度，制成（稀释液）试验样液。
⑵、吸取样液5.0ml放入灭菌平皿，另吸取PBS5.0ml注入平皿中，作为阳性对照皿。
每皿用无菌镊子夹住菌片一角放入试样皿和阳性对照皿。
⑶、作用至设定时间后，即刻用无菌镊子夹住菌片一角，投入含5.0ml中和剂的试管中（中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）充分混匀计时。
（见图三）
⑷、中和10min后，取样液或10倍系列稀释液1.0ml（（见图四），置于两个灭菌平皿，接种凉至40～45℃营养琼脂培养基或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml，转动平皿10-20下，使其充分均匀，凝固后，于35℃±2℃培养48h（细菌）或72h（酵母菌），作活菌菌落计数。
⑸、试验重复3次，求其平均值。
⑹、阴性对照组：
分别吸取试验用相关溶液和培养基进行培养，观察有无污染。
A、PBC液（0.03mol/L磷酸盐缓冲液）、
B、无菌标准硬水1ml置于灭菌平皿内、
C、空白平皿，倾注营养琼脂培养基（细菌）或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml培养。
⑺、计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。
以菌落数在15cfu～300cfu的平板为准，每个稀释度3个平板生长菌落数全部合乎上述标准，则以该3个平板的菌落平均值作为结果；若有2个符合合乎上述标准，则以该合格的2个平板菌落的平均值作为结果。
4、计算公式
1、杀菌率X1＝（A－B）/A×100%式中：
X1—杀菌率（%）；
A--对照样品平均菌落数；
B--被试样品平均菌落数。
2、杀灭对数值（KL）＝对照组平均活菌浓度的对数值（No）－试验组活菌浓度的对数值（Nx）备注：
计算杀灭对数值时，取小数点后两位值，可以进行数字修约。
如果消毒试验组消毒处理后平
均生产菌落数，小于等于1时，即大于等于试验前对照组平均活菌浓度的对数值。
5、评价标准
杀菌率≥90%，产品有杀菌作用。
悬液定量杀灭试验中，各次的杀灭对数值≥5.00，可判定为消毒合格。
6、操作要点：
（消毒技术规范2002版）
1、对接触消毒剂（杀菌剂）的样本，在达到规定作用时间，即刻取样移入鉴定合格的中和剂溶液中（中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）；
2、即刻混匀，并按规定时间吸取样液进行随后的培养检测；
3、在将样本接种培养基以前的操作，应按规定时间内进行，以免微生物与中和剂或中和产物
接触过久。
审核：
编制：
中和剂悬液定量鉴定试验操作程序
引用标准：
QB/T2738-2005日化产品抗菌抑菌效果的评价方法（试验菌悬液在1×104—9×104cfu/ml）
4—9×104
GB15979-2002一次性使用卫生用品卫生标准（试验菌悬液在1×10
7—5×107
cfu/ml）
2002消毒技术规范（试验菌悬液在1×10
一、定义和术语
cfu/ml）
中和剂—在微生物杀灭试验中，试验微生物与杀菌剂作用达到规定时间的终点时，用以中和残留的杀
菌剂，使其不在持续抑制和杀灭微生物的试剂。
中和产物—中和剂加杀菌剂（样品）=9：
1，作用10min配置而成。
二、中和剂鉴定试验原理
中和剂鉴定试验原理
试验分组
第1组
杀菌剂＋菌液
→培养
第2组
（杀菌剂＋菌液）＋中和剂
第3组
中和剂＋菌液
→培养
第4组
（杀菌剂＋中和剂）＋菌液
第5组
阳性菌数对照
第6组
阴性对照。
→培养
→培养
观察杀菌剂对
观察残留杀菌
观察中和剂是
观察中和产
阳性对照组。
阴性对照组。
试验菌有无杀
剂被中和后，
否抑菌。
物，或未被完
灭或抑制能力
受到杀菌剂作
全中和的残留
试验目的
用后的试验菌
杀菌剂对试验
是否能恢复生
菌的生长繁殖
长。
是否有影响。
三、中和剂鉴定试验中易出现的问题及解决方法
出现的问题解决方法
1①、②组无菌生长或②组平板上少于5个菌
落，其它组正常。
降低消毒剂浓度或缩短作用时间。
2①②菌落数较多且数量基本相同，其它组正
常。
提高消毒剂浓度或延长作用时间。
3③组中和剂菌落数明显少于PBS组菌数降低中和剂浓度或改变中和剂成分。
4④组（中和产物）菌落数明显少于PBS组菌数，其它组正常。
提高中和剂浓度或改变中和剂成分。
5多次更换中和剂均不能得到满意结果。
选用载体法进行中和剂鉴定，杀菌试验同时用
载体法进行。
四、1鉴定试验操作程序
中和剂悬液定量鉴定试验操作程序-《消毒技术规范》
试验分组第1组第2组第3组第4组第5组第6组
取试验样品4.0ml加入各
对应组
取4.5ml中和
剂加入对应组
取4.9ml中
和产物b加入对应组
取4.5mlPBS—
（稀释液）加入对应组
20℃±1℃恒温
5min
菌悬液
1.0ml
菌悬液
1.0ml
0.1ml菌悬液
＋0.4ml硬水混匀
0.1ml菌悬
液
0.1ml菌悬液—
＋0.4ml硬水混匀
振敲80次，
混匀
作用至试验预定时间，
取0.5ml加入下列对应组
作用10min，—
取0.5ml加入下列各对应组
PBS
4.5ml
中和剂
4.5ml
中和剂
4.5ml
中和产物
4.5ml
PBS—
4.5ml
振敲80次、混
匀
/作用10min/—
取适宜稀释度悬
液1.0ml接种平板（2个/样本）
活菌培养计
数
活菌培养计
数
用中和剂10
倍系列稀释
用中和产物
10倍系列稀释
用稀释液10
倍系列稀释
PBS＋中和剂
各1.0ml接种平板
第1组不长
第2组菌数
第3、4、5组菌数相似，
第6组无菌
中和剂鉴定评
价规定
菌或明显少
于第2组
大于5且明
显少于第3、4、5组
误差率≤15%生长
三组间平均菌数=（第3+4+5组菌数）÷3；误差率%=（三组平均菌数-各组菌落平均数）
中和剂鉴定合
格标准中对1、2组菌数要求。
0＞5
X（1-10）＞（X＋5）Y（＞10）＞1.5Y
的绝对值之和/3×三组间平均菌数×100
符合上述评价的中和剂表明可消除试验样品对指示菌的作用，中和剂与试验样品的中
结论
和产物对指示菌无毒害，鉴定为该试验样品的中和剂。
a菌悬液浓度及制备：
消毒技术规范用PBS（试验菌悬液在1×107—5×107
备注
b中和产物的配置：
先将试验样液1.0ml与中和剂溶液9ml混合，作用10min后制成
四、2鉴定试验操作程序
中和剂鉴定试验操作程序-载体法
试验分组
用无菌镊子取菌片加入下列
第1组
吸取试验样品5.0ml
第2组
吸取试验样品
5.0ml于无菌平
第3组
吸取中和剂
5.0ml于无菌
第4组
吸取中和产物5.0ml于
第5组
吸取PBS5.0ml于无菌
第6组
—
对应组
于无菌平
皿内
平皿内
无菌平皿内
平皿内
皿内
作用至预定时间，立即用无菌
镊子取出菌片移入对应组
混匀作用10min，立即用无菌镊子取出菌片移入对应组
试管振打80次PBS
5.0ml
中和剂
5.0ml
中和剂
5.0ml
中和产物
5.0ml
稀释液—
5.0ml
作用10min作用10min/
取原液或稀释
用稀释液
用稀释液10倍
用中和剂10
用中和产物
用稀释液10
稀释液＋
液1.0ml接种
平板（2个/样
10倍系列
稀释
系列稀释
倍系列稀释
10倍系列稀
释
倍系列稀释
中和剂
各1.0ml
本）
接种平板
操作要点即刻混匀，并按规定时间接种培养基
中和剂鉴定评价
第1组不
第2组有且较第
第3、4、5组菌数相似，且其误差率≤15%
第6组无
评价规定
长菌或明
显少于第2
组
1组为多，较第
3、4、5组为少的菌数生长，并
三组间平均菌数=（第3+4+5组菌数）÷3；
菌生长
中和剂鉴定合格标准中对1、2组菌数要求。
符合下表要求。
0＞5
X（1-10）＞（X＋5）Y（＞10）＞1.5Y
误差率%=（三组平均菌数-各组菌落平均数）的绝对值之和/3×三组间平均菌数×100
符合上述评价的中和剂表明可消除试验样品对指示菌的作用，中和剂与试验样品的中
结论
和产物对指示菌无毒害，鉴定为该试验样品的中和剂。
a菌悬液浓度及制备：
用PBS将指示菌制成1×104～9×104cfu/ml悬液。
（-GB15979）
备注消毒技术规范用PBS（试验菌悬液在1×107—5×107
b中和产物的配置：
先将试验样液1.0ml与中和剂溶液9ml混合，作用10min后制成
四、3鉴定试验操作程序
中和剂悬液定量鉴定试验操作程序-《GB/T15979》
试验分组
第1组第
2组
第3组
第4组
第5组
第6组
取0.10ml菌悬
取试验样品5.0ml
加入各
取5.0ml中和
取5.0ml中
取5.0mlPBS
—
液,分别加入各
组
对应组
剂加入对应
组
和产物b加
入对应组
（稀释液）加
入对应组
振敲80次，
混匀
作用至试验预定时间，
取0.5ml加入下列对应组
作用10min，—
取0.5ml加入下列各对应组
PBS
4.5ml
中和剂
4.5ml
中和剂
4.5ml
中和产物
4.5ml
PBS—
4.5ml
振敲80次、混
匀
/作用10min/—
取适宜稀释度悬
液1.0ml接种平板（2个/样本）
活菌培养计
数
活菌培养计
数
用中和剂10
倍系列稀释
用中和产物
10倍系列稀释
用稀释液10
倍系列稀释
PBS＋中和剂
各1.0ml接种平板
第1组不长
第2组菌数
第3、4、5组菌数相似，
第6组无菌
中和剂鉴定评
价规定
菌或明显少
于第2组
大于5且明
显少于第3、4、5组
误差率≤15%生长
三组间平均菌数=（第3+4+5组菌数）÷3；误差率%=（三组平均菌数-各组菌落平均数）
中和剂鉴定合
格标准中对1、2组菌数要求。
0＞5
X（1-10）＞（X＋5）Y（＞10）＞1.5Y
的绝对值之和/3×三组间平均菌数×100
符合上述评价的中和剂表明可消除试验样品对指示菌的作用，中和剂与试验样品的中
结论
和产物对指示菌无毒害，鉴定为该试验样品的中和剂。
a菌悬液浓度及制备：
用PBS将指示菌制成1×104～9×104cfu/ml悬液。
（-GB15979）
备注
b中和产物的配置：
先将试验样液1.0ml与中和剂溶液9ml混合，作用10min后制成
七、消毒剂的常用中和剂的配置
1、用于氯型杀菌剂（有效氯0.1-0.5%）：
硫代硫酸钠
2、用于非氧化型杀菌剂：
a：
磷酸二氢钾1.36g、磷酸氢二钠2.83g、卵磷脂10.0g、甘氨酸10.0g、吐温-8030.0g、蒸馏水
1000ml
b：
磷酸二氢钾1.36g、磷酸氢二钠2.83g、卵磷脂3.0g、吐温-8020.0g、蒸馏水1000ml3、用于氧型杀菌剂：
吐温-8020.0g、硫代硫酸钠10.0g、PBS1000m、l
4、阳离子胍类消毒剂：
卵磷脂3.0%、吐温-803.0%的PBS溶液
5、季胺盐类消毒剂（0.1-0.5%）：
吐温-80+卵磷脂（1.0-2.0%）
6、酚类（DP-300）消毒剂（3.0-5.0%）：
吐温-80（0.5-3.0%）
7、复方消毒剂：
吐温-80+卵磷脂+硫代硫酸钠
8、过氧乙酸（0.1-0.5%）：
硫代硫酸钠（0.1-1.0%））
9、过氧化氢（1.0-3.0%）：
硫代硫酸钠（0.5-1.0%））八、附悬液定量杀菌试验示意图、载体法试验杀菌率示意图
审核：
编制：
质量管理中心谷爱军
图一、
细菌悬液+有机干扰物质=1：
1
置20±1℃5min后
1ml1ml
图二、阳性对照管
注入样液4ml注入稀释液4.0ml
样液稀释液
A
作用至各预定时间后
吸取0.5ml混合液加入4.5ml经灭菌的中和剂中，充分混匀作用10min，培养。
4.5ml4.5ml
图三
作用10min
0.5ml0.5ml
中和剂
0.5ml0.5ml
图四
1ml1ml
4.5ml4.5ml中和剂4.5ml4.5ml
AAAA
1ml1ml1ml1ml
101010
101010
悬液定量杀菌试验示意图
《消毒技术规范》
图一、
细菌悬液
取10ul滴在10mm×10mm无菌滤纸上，干燥、制成菌片
44
（回收菌数为1×10～9×10
（回收菌数为5×105—5×106
cfu/片-GB/T15979）
cfu/片—消毒技术规范）
吸取样品稀释液
5ml
吸取PBS5ml作为阳性对照管
放入一菌片
放入一菌片
作用至设定时间后，即刻用无菌镊子夹住菌片，投入各含5.0ml中和剂的对应管中。
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