杀菌率试验规程Word文档格式.docx

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挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37℃培养18h～24h，即为第3代培养物（放在4℃左右冰箱中保藏。

每隔2-3个月移种一次，继续保藏。

）。

⑵取第3代～14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（经18h～24h培养），用5.0ml吸管吸取3.0ml-5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。

随后，用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中，在手掌上振敲80次（力度适中，勿溅出），以使细菌悬液均匀。

或从新鲜菌种斜面沾取少量菌苔，接种在适合试验菌生长的培养基中，37℃培养18h～24h（或适宜时间）。

作为原菌液。

（源于《药品微生物学检验手册》211页）

⑶细菌繁殖体悬液应保存在4℃冰箱备用。

尽量减少在室温下放置时间，以减少细菌的自然死亡。

应当天使用不得过夜。

回收菌数为1×

104～9×

104cfu/ml用PBS液配置GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》

108—5×

108cfu/ml用TSB营养肉汤配置—2002《消毒技术规范》

2.2、菌片的制备程序：

《消毒技术规范》

挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37℃培养18h～24h，即为第3代培养物。

⑵取第3代～14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（经18h～24h培养），用5.0ml吸管吸取3.0ml-5.0mlTSB营养肉汤加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。

随后，用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中，在手掌上振敲80次，以使细菌悬液均匀，含菌量1×

108cfu/ml。

⑶用无菌镊子夹住已灭菌10mm*10mm滤纸一角，一面朝上，注入10ul菌悬液，放到无菌平板内，37℃温箱中干燥20min-30min，（或在室温自然阴干后使用）制成菌片。

每个菌片回收菌落，按活菌培养计数所得结果，应为5×

105—5×

106cfu/片。

）

⑷细菌繁殖体悬液和菌片，用毕应随时保存在4℃冰箱内。

（应当天使用不得过夜。

3、操作程序

3.1、悬液定量法杀菌试验操作程序

1、样品用无菌标准硬水稀释至同中和剂鉴定用试液浓度，或低于中和剂鉴定用试液浓度，制成（稀释液）试验样液。

2、将试管按需要数量分别排列于试管架上，各组由左向右，排序、标记。

3、配制菌悬液，浓度为1×

104cfu/ml—GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》或1×

108cfu/ml—2002《消毒技术规范》

4、取杀菌试验用无菌大试管，先加入0.5ml试验用菌悬液，再加入0.5ml有机干扰物质，混匀，置20±

1℃5min，用无菌吸管吸取步骤1中的试验样液4.0ml注入其中，立即开启计时器，并迅速混匀（在手掌上振摇80次）。

-见《消毒技术规范》或吸取试验用菌悬液0.1ml，加入到含5ml样液的试管中，立即开启计时器，并迅速混匀（在手掌上振摇80次）。

-见QB/T2738-2005

5、作用2min、5min、10min、20min，即刻用无菌吸管吸取0.5ml移入鉴定合格的4.5ml中和剂溶液中（中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）充分混匀，中和作用10min后，取样液、10倍系列稀释液0.5ml（见GB15979-2002）或分别吸取1.0ml（-见《消毒技术规范》）（见图四），置于2个灭菌平皿，用凉至40～45℃营养琼脂培养基或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35℃±

2℃培养48h（细菌）或（酵母菌）25℃±

2℃培养72h，作活菌菌落计数。

6、同时用稀释液代替样液进行平行试验，作为阳性对照管。

7、阴性对照组：

分别吸取试验用相关溶液和培养基进行培养，观察有无污染。

8、计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。

以菌落数在15cfu～300cfu的平板为准，每个稀释度3个平板生长菌落数全部合乎上述标准，则以该3个平板的菌落平均值作为结果；

若有2个符合合乎上述标准，则以该合格的2个平板菌落的平均值作为结果。

9、试验重复3次，求其平均值。

根据各组活菌浓度（cfu/ml），计算杀菌率，见计算公式1。

或根据各组活菌浓度换算为对数值（N），计算杀灭对数值，见计算公式2。

3.2载体法杀菌试验操作程序

1、试验样品用无菌标准硬水（过滤除菌）稀释至规定浓度，制成（稀释液）试验样液。

2、吸取样液5.0ml放入灭菌平皿，另吸取PBS5.0ml注入平皿中，作为阳性对照皿。

每皿用无菌镊子夹住菌片一角放入试样皿和阳性对照皿。

3、作用至设定时间后，即刻用无菌镊子夹住菌片一角，投入含5.0ml中和剂的试管中（中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）充分混匀计时。

（见图三）

4、中和10min后，取样液或10倍系列稀释液1.0ml（（见图四），置于两个灭菌平皿，接种凉至40～45℃营养琼脂培养基或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml，转动平皿10-20下，使其充分均匀，凝固后，于35℃±

2℃培养48h（细菌）或72h（酵母菌），作活菌菌落计数。

5、试验重复3次，求其平均值。

6、阴性对照组：

A、PBC液（0.03mol/L磷酸盐缓冲液）、

B、无菌标准硬水1ml置于灭菌平皿内、

C、空白平皿，倾注营养琼脂培养基（细菌）或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml培养。

⑺、计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。

4、计算公式

1、杀菌率X1＝（A－B）/A×

100%

式中：

X1—杀菌率（%）；

A--对照样品平均菌落数；

B--被试样品平均菌落数。

2、杀灭对数值（KL）＝对照组平均活菌浓度的对数值（No）－试验组活菌浓度的对数值（Nx）

备注：

计算杀灭对数值时，取小数点后两位值，可以进行数字修约。

如果消毒试验组消毒处理后平均生产菌落数，小于等于1时，即大于等于试验前对照组平均活菌浓度的对数值。

5、评价标准

杀菌率≥90%，产品有杀菌作用。

悬液定量杀灭试验中，各次的杀灭对数值≥5.00，可判定为消毒合格。

6、操作要点：

（消毒技术规范2002版）

1、对接触消毒剂（杀菌剂）的样本，在达到规定作用时间，即刻取样移入鉴定合格的中和剂溶液中（中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）；

2、即刻混匀，并按规定时间吸取样液进行随后的培养检测；

3、在将样本接种培养基以前的操作，应按规定时间内进行，以免微生物与中和剂或中和产物接触过久。

审核：

编制：

中和剂悬液定量鉴定试验操作程序

引用标准：

QB/T2738-2005日化产品抗菌抑菌效果的评价方法（试验菌悬液在1×

104—9×

104cfu/ml）

GB15979-2002一次性使用卫生用品卫生标准（试验菌悬液在1×

2002消毒技术规范（试验菌悬液在1×

107—5×

107cfu/ml）

一、定义和术语

中和剂—在微生物杀灭试验中，试验微生物与杀菌剂作用达到规定时间的终点时，用以中和残留的杀菌剂，使其不在持续抑制和杀灭微生物的试剂。

中和产物—中和剂加杀菌剂（样品）=9：

1，作用10min配置而成。

二、中和剂鉴定试验原理

中和剂鉴定试验原理

试验分组

第1组

第2组

第3组

第4组

第5组

第6组

杀菌剂＋菌液→培养

（杀菌剂＋菌液）＋中和剂→培养

中和剂＋菌液→培养

（杀菌剂＋中和剂）＋菌液→培养

阳性菌数对照

阴性对照。

试验目的

观察杀菌剂对试验菌有无杀灭或抑制能力

观察残留杀菌剂被中和后，受到杀菌剂作用后的试验菌是否能恢复生长。

观察中和剂是否抑菌。

观察中和产物，或未被完全中和的残留杀菌剂对试验菌的生长繁殖是否有影响。

阳性对照组。

阴性对照组。

三、中和剂鉴定试验中易出现的问题及解决方法

出现的问题

解决方法

1

①、②组无菌生长或②组平板上少于5个菌落，其它组正常。

降低消毒剂浓度或缩短作用时间。

2

①②菌落数较多且数量基本相同，其它组正常。

提高消毒剂浓度或延长作用时间。

3

③组中和剂菌落数明显少于PBS组菌数

降低中和剂浓度或改变中和剂成分。

4

④组（中和产物）菌落数明显少于PBS组菌数，其它组正常。

提高中和剂浓度或改变中和剂成分。

5

多次更换中和剂均不能得到满意结果。

选用载体法进行中和剂鉴定，杀菌试验同时用载体法进行。

四、1鉴定试验操作程序

中和剂悬液定量鉴定试验操作程序-《消毒技术规范》

取试验样品4.0ml加入各对应组

取4.5ml中和剂加入对应组

取4.9ml中和产物b加入对应组

取4.5mlPBS（稀释液）加入对应组

—

1℃恒温5min

菌悬液1.0ml

0.1ml菌悬液＋0.4ml硬水混匀

0.1ml菌悬液

振敲80次，

混匀

作用至试验预定时间，

取0.5ml加入下列对应组

作用10min，

取0.5ml加入下列各对应组

PBS

4.5ml

中和剂

中和产物

振敲80次、混匀

/

作用10min

取适宜稀释度悬液1.0ml接种平板（2个/样本）

活菌培养计数

用中和剂10倍系列稀释

用中和产物10倍系列稀释

用稀释液10倍系列稀释

PBS＋中和剂

各1.0ml接种平板

中和剂鉴定评价规定

第1组不长菌或明显少于第2组

第2组菌数大于5且明显少于第3、4、5组

第3、4、5组菌数相似，

误差率≤15%

三组间平均菌数=（第3+4+5组菌数）÷

3；

误差率%=（三组平均菌数-各组菌落平均数）的绝对值之和/3×

三组间平均菌数×

100

第6组无菌生长

中和剂鉴定合格标准中对1、2组菌数要求。

＞5

X（1-10）

＞（X＋5）

Y（＞10）

＞1.5Y

结论

符合上述评价的中和剂表明可消除试验样品对指示菌的作用，中和剂与试验样品的中和产物对指示菌无毒害，鉴定为该试验样品的中和剂。

备注

a菌悬液浓度及制备：

消毒技术规范用PBS（试验菌悬液在1×

b中和产物的配置：

先将试验样液1.0ml与中和剂溶液9ml混合，作用10min后制成

四、2鉴定试验操作程序

中和剂鉴定试验操作程序-载体法

用无菌镊子取菌片加入下列对应组

吸取试验样品5.0ml于无菌平皿内

吸取中和剂

5.0ml于无菌平皿内

吸取中和产物5.0ml于无菌平皿内

吸取PBS

作用至预定时间，立即用无菌镊子取出菌片移入对应组

混匀作用10min，立即用无菌镊子取出菌片移入对应组

试管振打80次

5.0ml

稀释液

取原液或稀释液1.0ml接种平板（2个/样本）

用稀释液10倍系列稀释

稀释液＋中和剂

操作要点

即刻混匀，并按规定时间接种培养基

中和剂鉴定评价

评价规定

第2组有且较第1组为多，较第3、4、5组为少的菌数生长，并符合下表要求。

第3、4、5组菌数相似，且其误差率≤15%

用PBS将指示菌制成1×

104cfu/ml悬液。

（-GB15979）

消毒技术规范用PBS（试验菌悬液在1×

四、3鉴定试验操作程序

中和剂悬液定量鉴定试验操作程序-《GB/T15979》

取0.10ml菌悬液,分别加入各组

取试验样品5.0ml加入各对应组

取5.0ml中和剂加入对应组

取5.0ml中和产物b加入对应组

取5.0mlPBS（稀释液）加入对应组

七、消毒剂的常用中和剂的配置

1、用于氯型杀菌剂（有效氯0.1-0.5%）：

硫代硫酸钠

2、用于非氧化型杀菌剂：

a：

磷酸二氢钾1.36g、磷酸氢二钠2.83g、卵磷脂10.0g、甘氨酸10.0g、吐温-8030.0g、蒸馏水1000ml

b：

磷酸二氢钾1.36g、磷酸氢二钠2.83g、卵磷脂3.0g、吐温-8020.0g、蒸馏水1000ml

3、用于氧型杀菌剂：

吐温-8020.0g、硫代硫酸钠10.0g、PBS1000ml、

4、阳离子胍类消毒剂：

卵磷脂3.0%、吐温-803.0%的PBS溶液

5、季胺盐类消毒剂（0.1-0.5%）：

吐温-80+卵磷脂（1.0-2.0%）

6、酚类（DP-300）消毒剂（3.0-5.0%）：

吐温-80（0.5-3.0%）

7、复方消毒剂：

吐温-80+卵磷脂+硫代硫酸钠

8、过氧乙酸（0.1-0.5%）：

硫代硫酸钠（0.1-1.0%））

9、过氧化氢（1.0-3.0%）：

硫代硫酸钠（0.5-1.0%））

八、附悬液定量杀菌试验示意图、载体法试验杀菌率示意图

质量管理中心谷爱军

细菌悬液+有机干扰物质=1：

图一、

置20±

1℃5min后

1ml1ml

图二、阳性对照管

注入样液4ml注入稀释液4.0ml

样液稀释液

A

作用至各预定时间后

吸取0.5ml混合液加入4.5ml经灭菌的中和剂中，充分混匀作用10min，培养。

4.5ml4.5ml

图三

中和剂

作用10min

0.5ml0.5ml

图四

1ml1ml

4.5ml4.5ml中和剂4.5ml4.5ml

AAAA

1ml1ml1ml1ml

10-010-110-210-210-110-0

悬液定量杀菌试验示意图

细菌悬液

取10ul滴在10mm×

10mm无菌滤纸上，干燥、制成菌片

（回收菌数为1×

104cfu/片-GB/T15979）

（回收菌数为5×

106cfu/片—消毒技术规范）

吸取样品稀释液5ml吸取PBS5ml作为阳性对照管

放入一菌片放入一菌片

作用至设定时间后，即刻用无菌镊子夹住菌片，投入各含5.0ml中和剂的对应管中。

5.0ml5.0ml

充分混匀

4.5ml4.5ml4.5ml4.5ml

PBSPBSPBSPBS

10-010-110-210-210-110-0

杀菌率试验示意图-载体法