微生物学实验教程Word文件下载.docx
《微生物学实验教程Word文件下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微生物学实验教程Word文件下载.docx（47页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
2.增加显微镜的分辨率
显微镜的分辨率或分辨力（resolutionorresolvingpower）是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。
从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：
（公式P16）式中λ=光波波长；
NA=物镜的数值孔径值。
光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（0.4--0.7μm），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为：
NA=n×
sinα
式中α为光线最大入射角的半数。
它取决于物镜的直径和焦距，一般来说在实际应用中最大只能达到120度，而n为介质折射率。
由于香柏油的折射率（1.52）比空气及水的折射率（分别为1.0和1.33）要高，因此以香柏油作为镜头于玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径值（NA一般在1.2～1.4）要高于低倍镜、高倍镜等干镜（NA都低于1.0）。
若以可见光的平均波长0.55μm来计算，数值孔径通常在0.65左右的高倍镜只能分辨出距离不小于0.4μm的物体，而油镜的分辨率却可达到0.2μm左右。
三、器材
1.菌种：
枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）染色玻片标本。
青霉（Penicilliumsp.）的水封片。
2.溶液或试剂：
香柏油、乙醇：
乙醚混合液
3.仪器或其他用具：
显微镜、擦镜纸等。
四.操作步骤
1.观察前的准备
（1）显微镜的安置：
置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约3～4cm。
镜检时姿势要端正。
取放显微镜时应一手握住镜臂，一手托住底座，使显微镜保持直立、平稳。
切忌用单手拎提；
且不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同时睁开观察，以减少眼睛疲劳，也便于边观察边绘图或记录。
（2）光源调节：
安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或凸面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。
（3）根据使用者的个人情况，调节双筒显微镜的目镜，双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有曲光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。
（4）聚光器数值孔径值的调节：
调节聚光器虹彩光圈值与物镜的数值孔径值相符或略低。
有些显微镜的聚光器只标有最大数值孔径值，而没有具体的光圈数刻度。
使用这种显微镜时可在样品聚焦后取下一目镜，从镜筒中一边看着视野，一边缩放光圈，调整光圈的边缘与物镜边缘黑圈相切或略小于其边缘。
因为各物镜的数值孔径值不同，所以每转换一次物镜都应进行这种调节。
在聚光器的数值孔径值确定后，若需改变光照强度，可通过升降聚光器或改变光源的亮度来实现，原则上不应再通过虹彩光圈的调节。
当然，有关虹彩光圈、聚光器高度及照明光源强度的使用原则也不是固定不变的，只要能获得良好的观察效果，有时也可根据不同的具体情况灵活运用，不一定拘泥不变。
2.显微观察
在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。
一般情况下，特别是初学者，进行显微观察时应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。
（1）低倍镜观察金黄色葡萄球菌染色标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。
下降10Χ物镜，使其接近标本，用粗调节器慢慢升起镜筒，使标本在视野中初步聚焦，再使用细调节器调节图象清晰。
通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。
在任何时候使用粗调节器聚焦物像时，必需养成先从侧面注视小心调节物镜靠近标本，然后用目镜观察，慢慢调节物镜离开标本进行准焦的习惯，以免因一时的误操作而损坏镜头及玻片。
（2）高倍镜观察低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置。
对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。
在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦（parfocal）。
利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。
（3）油镜观察高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。
在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。
将聚光器升至最高位置并开足光圈，若所用聚光器的数值孔径值超过1.0，还应在聚光镜与载玻片之间也加滴香柏油，保证其达到最大的效能。
调节照明使视野亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。
有时按上述操作还找不到目的物，则可能是由于油镜头下降还未到位，或因油镜上升太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物像。
遇此情况，应重新操作。
另外应特别注意不要因在下降镜头时用力过猛，或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片。
3.显微镜用毕后的处理
（1）上升镜筒，取下载玻片。
（2）用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。
（3）用擦镜纸清洁其他物镜及目镜；
用绸布清洁显微镜的金属部件。
（4）将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，再向下旋。
同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。
五.实验报告
1.分别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌及青霉的形态，包括在三种情况下视野中的变化。
同时注明物镜放大倍数和总放大率。
2.思考题
（1）用油镜观察时应注意哪些问题？
在载玻片和镜头之间加滴什么油？
起什么作用？
（2）试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。
为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？
（3）什么是物镜的同焦现象？
它在显微镜观察中有什么意义？
（4）影响显微镜分辨率的因素有哪些？
（5）根据你的实验体会，谈谈应如何根据所观察微生物的大小，选择不同的物镜进行有效的观察。
实验二.细菌的简单染色法
1.学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色方法。
2.初步认识细菌的形态特征。
3.巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。
二、基本原理
虽然可以用相差显微镜等直接观察微生物的形态特征，但其应用有局限性
；
用电子显微镜可以观察到微生物的各种形态结构，但因其价格昂贵、设备条件要求高、操作也较复杂，应用上也受一定限制。
所以，一般实验室仍常用普通光学显微镜来进行微生物形态学特征的观察。
然而，微生物（尤其是细菌）细胞小而透明，当把菌悬液浮于水滴内，用光学显微镜观察时，由于菌体和背景没有显著的明暗差，因而难以看清它们的形态，更不易识别其结构，所以，用不同光学显微镜观察细菌时，往往要先将细菌进行染色，借助于颜色的反衬作用，可以更清楚地观察到细菌的形状及某些细胞结构。
因此，为了研究微生物的形态特征和鉴别不同类群的微生物，微生物的染色及形态结构的观察是微生物实验中十分重要的基本技术。
用于微生物染色的染料，是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。
发色基团赋予化合物的颜色特征，助色基团则给予化合物能够成盐的性质，仅含发色基团的苯化合物（称色原）即使带有颜色也不能作为染料，因为它不能电离，不能与酸或碱形成盐，对微生物（或其他材料）没有结合力，很容易被洗脱或机械方法除去。
染料通常都是盐，分酸性染料和碱性染料两大类。
在微生物染色中，碱性染料较常用，如常用的美蓝（即亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、番红（即沙黄）、孔雀绿等都属于碱性染料。
这部分实验着重于细菌的染色观察，同时也进行放线菌、酵母菌和丝状真菌的形态学观察。
其目的是使同学在掌握细菌染色观察技术的基础上，了解其他微生物形态结构的观察方法；
初步认识各类微生物的形态特征，巩固课堂知识，增强感性认识。
简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：
在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电，荷酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
常用作简单染色的染料有：
美蓝、结晶紫、碱性复红等。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。
枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养基，藤黄微球菌（Micrococcusluteus）约24h营养琼脂斜面培养物。
2.染色剂：
吕氏碱性美蓝染液（或草酸铵结晶紫染液），齐氏石炭酸复红染液。
显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水等。
四、操作步骤
1.涂片
取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环挑取1～2环）生理盐水（或蒸馏水）于玻片中央、用接种环以无菌操作分别从枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。
若用菌悬液（或液体培养物）涂片，可用接种环挑取2～3环直接涂于载玻片上。
载玻片要洁净无油迹；
滴生理盐水和取菌不宜过多；
涂片要涂均匀，不宜过厚。
2.干燥
室温自然干燥或酒精灯干燥。
3.固定
涂面朝上，通过火焰2-3次。
此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。
热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。
4.染色
将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。
吕氏碱性美蓝染色1～2min；
石炭酸复红（或草酸铵结晶紫）染色约1min。
5.水洗
倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。
水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。
水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。
6.干燥
自然干燥，或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。
7.镜检
涂片干后镜检。
涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。
最后清理显微镜。
五、实验报告
1.结果
根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。
2.思考题
（1）你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？
（2）为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?
（3）如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题?
如果加热温度过高、时间太长，又会怎么样呢？
实验三.革兰氏染色法
1.学习并初步掌握革兰氏染色法。
2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家ChrstainGram氏创立的，而后一些学者在此基础上作了某些改进。
革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
革兰氏染色法的基本步骤是：
先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如番红）复染。
经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；
如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌
。
革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。
实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。
碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。
当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫一碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。
革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫一碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，采用规范的染色方法是十分必要的。
本实验将介绍被普遍采用的Hucker氏改良的革兰氏染色法。
1.菌种：
大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物，枯草芽孢杆菌24h营养琼脂斜面培养物，
2.染色剂：
革兰氏染色液。
同实验一
1.制片
取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。
要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；
涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；
火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。
2.初染
滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1-2min，水洗。
3.媒染
用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗
4.脱色
用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95％的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。
革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。
脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。
脱色时间一般约20-30s。
5.复染
用番红液复染约2min，水洗。
6.镜检
干燥后，用油镜观察。
菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。
7.混合涂片染色
按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌或大肠杆菌和枯草芽孢作混合涂片、染色、镜检进行比较。
1.结果
列表简述3株细菌的染色观察结果（说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应）。
（1）你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性?
其中最关键的环节是什么?
（2）现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。
你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。
（3）你的染色结果是否正确?
如果不正确，清说明原因。
（4）进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题?
（5）革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?
乙醇脱色后复染之前，苹兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？
（6）你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果?
在什么情况下可以采用？
实验三酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别
1.观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法
2.掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。
酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。
大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；
有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。
本实验通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式。
美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。
用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。
因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。
酿酒酵母（Saccharomycescerevisisiae）培养约2d的麦芽汁（或YEPD）斜面培养物。
2.溶液或试剂：
0.05％和0.1％吕氏碱性美蓝染色液，革兰氏染色用碘液。
3.仪器或其他用具：
显微镜，载玻片，盖玻片等。
1.美蓝浸片的观察
（1）在载玻片中央加一滴0.1％吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接种环挑取少量酵母菌苔放在染液中，混合均匀。
染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。
（2）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。
盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。
（3）将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。
（4）染色约0.5h后再次进行观察，注意死细胞数量是否增加。
（5）用0.05％吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。
2.水一碘液浸片的观察
在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌苔放在水一碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。
绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征。
（1）吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？
试分析其原因。
（2）在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？
1．明确血细胞计数板计数的原理。
2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。
单细胞微生物个体生长时间较短，很快进入分裂繁殖阶段，因此，个体生长难以测定，除非特殊目的，否则单个微生物细胞生长测定实际意义不大。
微生物的生长与繁殖（个体数目增加）是交替进行的，它们的生长一般不是依据细胞的大小，而是以繁殖，即群体的生长作为微生物生长的指标。
群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。
测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法（directmicroscopiccount）、平板菌落计数法（platecount）、光电比浊法（turbidityestimationbyspectrophotometer）、最大或然数法（mostprobablenumberMPN）以及膜过滤法（membranefiltration）等。
测定细胞物质的方法有细胞干重的测定，细胞某种成分如氮的含量。
RNA和DNA的含量测定，代谢产物的测定等。
总之，测定微生物生长量的方法很多，各有优缺点，工作中应根据具体要求加以选择。
本实验主要介绍生产、科研工作中比较常用的显微镜直接计数法、平板菌落计数法和光电比浊计数法。
显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。
目前国内外常用的计菌器有：
血细胞计数板、Peteroff-Hauser计数器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。
后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载玻片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。
显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。
但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。
目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色，微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。
本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。
另外两种计菌器的使用方法可参看各厂商的说明书。
用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。
该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；
中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。
计数室的
升级会员 