呼吸道病毒多重核酸检测试剂医疗器械技术审评中心Word文档格式.docx

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如主要原材料为企业自制，应提供其详细制备过程；

如主要原材料源于外购，应提供的资料包括：

选择该原材料的依据及对比试验资料、供货方提供的质量标准、出厂检定报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。

1.引物和探针：

应详述引物和探针的设计原则，提供引物、探针核酸序列、模板核酸序列及两者的对应情况。

建议每种病毒设计两套或多套引物、探针以供筛选，针对所有预期适用的病毒种类及基因型别进行检出能力和特异性（如交叉反应）的评价，选择最佳组合，并提交筛选的研究数据。

引物、探针的质量标准应至少包括序列准确性、纯度、浓度及功能性实验等。

如为外购，引物应提供合成机构出具的包括如上性能的质检证明，如聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）结果或高效液相色谱法（HPLC）分析图谱。

探针应提供合成机构出具的合成产物的质检证明（HPLC分析图谱）；

应对探针的核酸序列及标记的荧光素或化学发光物进行核实，并作HPLC分析。

2.脱氧三磷酸核苷（dNTP）：

包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP、dTTP，应提供对其纯度、浓度、功能性等的详细验证资料。

3.酶：

需要的酶主要包括DNA聚合酶、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶等，应分别对其酶活性等进行评价和验证。

DNA聚合酶，应具有DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性，具热稳定性；

逆转录酶，具逆转录酶活性，无核酸内切酶活性，应提供有关保存稳定性、活性及功能实验等的验证资料；

尿嘧啶糖基化酶（UNG），具有尿嘧啶糖基化活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性，应对酶活性有合理验证。

4.试剂盒内质控品

试剂盒的质控体系通过设置各种试剂盒对照品（质控品）来实现，其参与样本核酸的平行提取，以对整个PCR反应过程、试剂/设备、交叉污染等环节进行合理质量控制。

质控品浓度及成分的设置应与待测样本相近。

申报资料应对试剂盒对照品有关原料选择、制备、定值过程、浓度范围等试验资料详细说明。

4.1阴性质控品应不含试剂盒所检测的靶序列，参与样本处理和检测的全过程。

以对可能存在的交叉污染产生的假阳性结果或扩增反应中背景值进行质量控制。

阴性质控品可来自非呼吸道病毒感染的患者样本、假病毒、含非靶向序列的生物样本（如非呼吸道病毒感染的细胞系）。

建议采用与实际检测样本具有相同或相似性状的基质溶液作为阴性对照（质控）品，不推荐采用水作为阴性对照（质控）品。

4.2阳性质控品

4.2.1全过程阳性质控品应参与样本处理和检测的全过程，如核酸的平行提取等步骤。

全过程阳性质控品可用1～2个病毒株为代表，应含有天然的或人工合成的包含试剂盒可检测靶序列，可来自灭活病毒、假病毒、疫苗或原型疫苗株、低致病性病毒、病毒株感染的细胞系等。

企业应对质控品的检测结果（如Ct值）做出明确的范围要求。

4.2.2扩增/检测用阳性对照品可为浓度在最低检出限附近的纯化靶核酸，以对检测过程进行质量控制。

4.3内对照（内标）可以对管内抑制导致的假阴性结果进行质量控制，应与靶核酸一同提取及扩增，申请人应对内对照（内标）的引物、探针设计和模板浓度做精确验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线又要尽量降低对靶基因检测造成的抑制。

对内对照的检测结果（如Ct值）亦应做出明确的范围要求。

内标可设置为与待测病毒共提取的人核酸或人管家基因（如RNaseP、β-肌动蛋白）。

5.企业参考品：

应详细说明有关企业参考品的原料选择、制备、阴阳性确认等试验资料。

企业参考品的核酸性质应与产品预期检测的靶物质一致。

建议企业参考品优先采用病毒培养物，如病毒难以培养，RNA病毒可采用假病毒、人工克隆或合成的呼吸道病毒基因组RNA，DNA病毒可采用克隆细菌等。

5.1阳性参考品和阴性参考品

阳性参考品应覆盖申报产品声称可检出的所有呼吸道病毒亚型（详见表1）。

阴性参考品应考虑检测特异性的评价，应纳入不在试剂盒检测范围内的其他呼吸道病原体样品。

5.2检测限参考品

申请人应明确检测限参考品中病毒核酸浓度的确定方法，明确检测限参考品中病毒核酸浓度的确定依据，检测限参考品中呼吸道病毒核酸浓度应为申报产品检测限浓度或略高于检测限浓度，检测限参考品应包含申报产品应检出的呼吸道病毒所有亚型。

5.3精密度参考品

可不包含所有涉及的呼吸道病毒血清型，但应选择多个临床较常见的型别，针对所选型别应至少包含3个水平：

阴性水平、临界阳性水平、（中或强）阳性水平。

（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料

1.介绍产品主要生产工艺，可以图表方式表示，并说明主要生产工艺的确定依据。

2.反应原理介绍。

3.详述样本采集、样本处理方式的选择和设置，提供相关的研究资料。

4.确定最佳反应体系的研究资料，包括样本用量、各种酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度及反应各阶段温度、时间、循环数等。

5.不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述，并提交验证资料。

6.如申报产品包含核酸分离/纯化试剂，应提交对核酸分离/纯化过程进行工艺优化的研究资料。

（四）分析性能评估资料

申请人应提交生产者在产品研制阶段对试剂盒进行的所有性能评价的研究资料，对于每项分析性能的评价都应包括具体研究目的、试验方法、可接受标准、试验数据、统计方法等详细资料。

有关分析性能验证的背景信息也应在申报资料中有所体现，包括实验地点、适用仪器、试剂规格、批号、临床样本来源等。

针对不同的样本类型，申请人应分别完成性能评估，包括阴阳性符合率、最低检测限、精密度、分析特异性等。

分析性能评价的试验方法可以参考国际或国内有关体外诊断试剂性能评估的指导原则进行。

对于此类产品，性能评估中所用样品（除非特别说明）可参考上述企业参考品的制备要求。

各项性能评价应符合以下要求。

1.核酸分离/纯化性能

在进行靶核酸检测前，应有适当的核酸分离/纯化步骤。

该步骤的目的除最大量分离出目的核酸外，还应有相应的纯化作用，尽可能去除PCR抑制物。

无论检测试剂是否含有核酸分离/纯化的组分，企业都应结合检测试剂的特性，对配合使用的核酸分离/纯化试剂的提取效率、提取核酸纯度等做充分的验证，提供详细的验证资料。

2.阳性/阴性参考品符合率

阳性参考品的检测旨在验证试剂盒检测范围内的各呼吸道病毒血清型、亚型均可以在适当的浓度被检测到，阳性参考品检测结果应为阳性。

阴性参考品旨在评价试剂特异性，阴性参考品检测结果应为阴性。

3.最低检出限

申报产品最低检测限的性能评估资料应包含最低检测限的确定及验证过程。

3.1应针对申报产品所能检出的常见呼吸道病毒血清型、基因型分别进行确定，建议采用培养后病毒原液、以混合阴性样本基质作为稀释液进行梯度稀释，难以培养的病毒也可采用假病毒或其他适宜方法进行最低检出限的确定。

配制系列稀释的样品进行最低检测限的评价，每个稀释度上重复制备3～5份样本，系列稀释度应能够覆盖大部分检出概率区间（0～100%），可通过概率计算或其他适当方法进行测算选取适当检出率水平的浓度作为最低检测限确定的标准，如90-95%（n≥20）的阳性检出率水平。

病毒原液浓度测定建议采用空斑试验，浓度水平采用空斑形成单位（PFU）为计量单位（最低检出限建议病毒见表1）。

3.2申报试剂应在最低检出限或接近最低检出限的病毒浓度进行验证，总测试数不少于20次。

企业应能够提供用于最低检出限/定量限验证的病毒株的来源、型别确认及滴度确认试验等信息。

4.准确性验证

建议申请人在病毒LoD水平上或附近对声称样本进行分析，证明试验能够检测代表时间和地理多样性的其他临床相关病毒株（推荐病毒亚型见表1）。

其中，申报试剂应在最低检测限或接近最低检测限的病毒浓度对每种常见待测流感病毒亚型具有时间和区域多样性的至少3个病毒株进行验证。

表1推荐用于最低检出限和准确度实验的病毒亚型

病毒名称

亚型

甲型流感病毒

H1N1（新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季节性H1N1流感病毒）、H3N2、H7N9、H5N1

乙型流感病毒

Yamataga、Victoria

副流感病毒

PIV1、PIV2、PIV3、PIV4

呼吸道合胞病毒

A、B

偏肺病毒

A1、A2、B1、B2

腺病毒

1-7、11、14、55

呼吸道感染肠道病毒（肠道病毒/鼻病毒）

肠道病毒：

A、B、C、D

鼻病毒：

A、B、C

冠状病毒

229E、OC43、NL63、HKU1

博卡病毒

HBoV1-4

5.干扰试验（分析特异性）

在本项试验中，申请人应充分评估整个系统即从核酸提取到扩增的全过程的分析特异性。

用于分析特异性的样本应使用声称的样本类型基质，并包括每种样本类型。

5.1内源/外源物质干扰

应根据所采集样本类型，针对可能存在的干扰情况进行验证。

建议申请人在每种干扰物质的潜在最大浓度（“最差条件”）条件下进行评价，并针对有代表性的呼吸道病毒基因型，至少在病毒临界阳性水平进行干扰试验验证。

检测的潜在干扰物包括样本中的原有物质（如血液、鼻腔分泌物或粘膜，及用于缓解淤血、鼻噪、刺激或哮喘和过敏症状的鼻腔和咽喉药物）及在样本采集和制备期间引入的物质（推荐用于干扰性试验的物质见表2）。

由于体外试验不一定能完全反映药物影响，在适用情况下可考虑替代性试验如评估临床实验中所纳入患者的用药影响，因此申请人也应评估其他常规或非处方药物及其代谢物。

表2推荐用于干扰试验的物质

物质

活性成分

粘蛋白

纯化粘蛋白

血液（人类）

鼻腔喷雾剂或滴鼻剂

苯福林、羟甲唑啉、氯化钠（含防腐剂）

鼻用皮肤类固醇

倍氯美松、地塞米松、氟尼缩松、曲安奈德、布地奈德、莫米松、氟替卡松

鼻用凝胶

硫磺

过敏性症状缓解药物

金英、盐酸组胺

流感疫苗

鼻内活流感病毒疫苗

润喉片、口服麻醉剂和镇痛剂

苯佐卡因、薄荷脑

抗病毒药物

扎那米韦、利巴韦林、奥司他韦、帕拉米韦

抗生素、鼻用软膏

莫匹罗星

全身性抗菌药

妥布霉素

5.2竞争性干扰

申请人应充分考虑临床上常见的呼吸道病毒混合感染情况下（如甲型流感病毒与呼吸道合胞病毒），高浓度分析对低浓度分析物检测的影响。

建议申请人使用一种最低检测限浓度的分析物和一种高浓度分析物评估竞争性干扰，竞争性感染的病毒组合建议为同一反应体系内病毒、常见重症感染病毒及常见混合感染病毒（如IFVA和HRV、IFVB和HRV、IFVA和PIV、EV和HRV、PIV和HRV等）。

竞争性干扰试验可与最低检测限、重复性或其他干扰试验同时进行。

6.交叉反应

6.1与试剂盒中其他病毒的交叉反应性

建议申请人充分验证试剂盒中可检测病毒及亚型之间的交叉反应性，应使用病毒最高临床水平浓度进行。

6.2与不在试剂盒检测范围中的病原体的交叉反应性

申请人应针对可能出现在检测样本中的病原体（如采样部位常见微生物、其他呼吸道感染病原体等）进行交叉反应验证。

用于交叉反应验证的样品，应尽量采用灭活病原体培养物或临床样本。

建议在病毒和细菌感染的医学相关水平进行交叉反应的验证，申请人应详细说明交叉反应样本来源、病原体鉴定和滴度确定的方法和结果。

病原体种类主要考虑以下几方面：

试剂盒检测范围以外的其他呼吸道病原体、感染人群呼吸道样本中的其他微生物（如EBV和MV）、样本中可能出现的其他病原体。

表3推荐用于交叉反应的病原体

病原体

H1N1（新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季节性H1N1流感病毒）、H3N2、H7N9

229E、OC43、NL63、HKU1

巨细胞病毒

单纯疱疹病毒1型

水痘带状疱疹病毒

EB病毒

百日咳杆菌＊

肺炎衣原体

棒状杆菌属＊

大肠杆菌＊

流感嗜血杆菌

乳酸杆菌属＊

嗜肺军团菌

卡他莫拉菌＊

结核分枝杆菌减毒株

肺炎支原体

脑膜炎奈瑟菌

奈瑟氏菌属

铜绿假单胞菌＊

金黄色葡萄球菌

表皮葡萄球菌＊

肺炎链球菌

化脓性链球菌

唾液链球菌

鲍曼不动杆菌

嗜麦芽窄食单胞菌

洋葱伯克霍尔德菌

纹带棒杆菌

诺卡菌

粘质沙雷菌

柠檬酸杆菌

隐球菌

烟曲霉

黄曲霉

肺孢子菌

白念珠菌

肺炎克雷伯菌

根据《卫计委下呼吸道感染细菌培养操作指南》，社区获得性肺炎常见病原菌

鹦鹉热衣原体

中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南

Q热立克次体

文献《儿童呼吸道病原体急性感染流行病学分析》

注：

＊项为选择性验证

7.精密度

企业应对精密度指标，如标准差或变异系数等的评价标准做出合理要求。

模拟样本并不能体现临床样本可能带来的所有变异因素，因此精密度评价中应同时包含若干临床样本，且精密度评价试验应包含核酸分离/纯化步骤。

针对本类产品的精密度评价主要包括以下要求。

（1）对可能影响检测精密度的主要变量进行验证，除检测试剂（包括核酸分离/纯化组分）本身的影响外，还应对分析仪、操作者、地点、检测轮次等要素进行相关的验证。

（2）设定合理的精密度评价周期，例如：

为期至少20天的检测，每天至少由2人完成不少于2次的完整检测，从而对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。

设定合理的精密度评价周期：

包括3个以上地点，每个地点使用多名操作员；

每天至少检测2次、每次重复2次；

检测至少3－5个非连续日，以涵盖待检病毒日间变异，从而对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。

（3）用于精密度评价的人工模拟样品和临床样本均应至少包含3个水平：

阴性样品、临界阳性样品、（中或强）阳性样品，并根据产品特性设定适当的精密度要求，临床样本精密度评价中的每一次检测均应从核酸提取开始。

①阴性样本：

待测物浓度低于最低检测限或为零浓度，阴性检出率应为95%（n≥20）。

②临界阳性样本：

待测物浓度略高于试剂盒的最低检测限，阳性检出率应高于95%（n≥20）。

③中/强阳性样本：

待测物浓度呈中度到强阳性，阳性检出率为100%且CV≤10%（n≥20）。

（五）阳性判断值确定资料

阳性判断值确定资料主要指对所有声称可检出的病毒亚型核酸检测的Ct值进行确认，建议申请人对申报产品用于结果判断的临界值予以确认。

参考值范围研究资料样本来源应考虑不同年龄、性别、地域等因素，尽可能考虑样本来源的多样性、代表性。

如存在判定值灰区，应提供灰区的确认资料。

如采用其他方法对阳性判断值进行确认研究，应说明这种方法的合理性。

（六）稳定性研究资料

稳定性研究资料主要涉及两部分内容，申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。

前者主要包括实时稳定性（有效期）、开瓶稳定性及冻融次数限制等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。

稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。

对于实时稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。

考虑到病毒RNA极易被降解的特性，企业也应对样本稳定性进行研究，主要包括冷藏和冷冻两种条件下的有效期验证，可以在合理的温度范围内，每间隔一定的时间段即对储存样本进行全性能的分析验证，从而确认不同类型样本的效期稳定性。

适于冷冻保存的样本还应对冻融次数进行评价。

对于样本提取后不能立即进行检测的，应明确核酸储存条件、储存时间等，同时应提供相应的核酸稳定性研究资料。

试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。

（七）临床试验

临床试验的开展、方案的制定以及报告的撰写等均应符合相关法规及《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第16号）的要求。

临床试验应能检出所有声称可检出的呼吸道病毒及亚型，且每种病毒及常见亚型阳性样本量应具有统计学意义。

1.病例选择及样本类型

申请人应选择体征/症状符合呼吸道感染的目标人群，执行前瞻性临床试验。

申请人在建立病例纳入标准时，应考虑到各年龄段人群的差异，尽量覆盖各个年龄段人群。

在进行结果统计分析时，除总体病例数的要求外，建议对各年龄段人群分层进行数据统计分析（如<

5、6－21、22－59和>

60岁），总体病例数应符合统计学要求。

临床试验入组病例应与产品预期用途中适用人群一致。

临床试验应首选新鲜样本，且每种病毒亚型至少应有前瞻性阳性样本检出。

某些呼吸道病毒亚型在人群中具有低流行率，可用已知含特定病毒型或亚型的样本（即留存样本）和模拟样本进行补充。

如果选择留存样本，则应证明冻存或其他保存方法的样本稳定性，且应对样本设盲，以免检测偏差。

模拟样本应明确病毒及亚型的鉴定方法、鉴定结果。

2.参比方法

申请人应选择境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为参比试剂，采用拟申报产品（以下称考核试剂）与之进行对比试验研究，证明本品与已上市产品等效或优于已上市产品。

如无已上市产品可选用病毒分离培养鉴定或测序方法进行比对，病毒培养应选择新鲜样本。

对于难以培养的呼吸道病毒（如人偏肺病毒）也可直接采用测序方法作为参比方法。

2.1测序试验中的核酸扩增方法所测靶序列应与申报产品所测测靶序列不同，且申请人应对该靶序列/引物提供文献或实验室数据支持。

申请人应在临床研究报告中对选用的测序方法做详细介绍，并提供以下关于测序试验的详细信息及资料：

（1）测序方法原理、测序仪型号、测序试剂及消耗品的相关信息。

（2）测序方法所用引物相关信息，如基因区段选择、分子量、纯度、功能性试验等资料。

（3）对所选测序方法的分析性能进行合理验证，尤其是最低检测限的确认，建议将所选测序方法与拟申报产品的相关性能进行适当比对分析。

（4）测序方法应建立合理的阳性质控品和阴性质控品对临床样本的检测结果进行质量控制。

（5）提交有代表性的样本测序图谱及结果分析资料。

2.2病毒培养时，除细胞病变效应（CPE）外，申请人还应进行病毒鉴定如病毒特异性抗体染色或PCR扩增后测序。

单纯的CPE无法提供准确的病毒鉴别。

申请人应提供病毒分离培养的详细实验室流程，以及特定细胞系可作为分离某种病毒的文献或数据支持。

冻融样本可能导致病毒丧失感染力，因此不推荐使用冻存样本进行病毒培养。

3.另外，申请人还应根据病毒流行情况选择每种病毒亚型核酸检测阳性的新鲜采集样本，使用考核试剂与呼吸道病毒感染检测的“金标准”方法—病毒分离培养鉴定方法或其他证明呼吸道病毒感染的方法进行比较研究。

如医院无病毒培养条件，可由该医院委托其他具有相应条件的机构进行。

4.统计学分析

对临床试验结果的统计应选择合适的统计方法，如检测结果一致性分析、阴性/阳性符合率等。

对于本类产品对比实验的等效性研究，常选择交叉四格表的形式总结两种试剂的定性检测结果，对定性结果进行四格表卡方或kappa检验以验证两种试剂定性结果的一致性，统计分析应可以证明两种方法的检测结果无明显统计学差异。

在临床研究方案中应明确统计检验假设，即评价考核试剂与参比试剂是否等效的标准。

申请人应分别统计各病毒及其亚型的灵敏度和特异性，同时应分别统计混合感染样本使用考核试剂和参比试剂的检测结果。

如考核试剂存在灰区，申请人还应统计灰区样本使用参比试剂的检测结果。

在数据收集过程中，对于两种试剂检测结果不一致的样本，应采用“金标准”方法或临床上普遍认为质量较好的第三种同类试剂进行复核，同时结合患者的临床病情对差异原因及可能结果进行分析。

5.临床试验总结报告撰写

根据《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》的要求，临床试验报告应该对试验的整体设计及各个关键点给予清晰、完整的阐述，应该对整个临床试验实施过程、结果分析、结论等进行条理分明的描述，并应包括必要的基础数据和统计分析方法。

建议在临床总结报告中对以下内容进行详述。

5.1临床试验总体设计及方案描述

5.1.1临床试验的整体管理情况、临床研究单位选择、临床主要研究人员简介等基本情况介绍。

5.1.2病例纳入/排除标准、不同年龄段人群的预期选择例数及标准、样本编盲和揭盲的操作流程等。

5.1.3样本类型，样本的收集、处理及保存等。

5.1.4统计学方法、统计软