PCR技术相关知识word资料13页Word文件下载.docx

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建议每20μl反应体系使用0.5μgoligo（dT）。

oligo（dT）12-18适用于多数RT-PCR。

ThermoScriptRT-PCRSystem提供了oligo（dT）20，因为其热稳定性较好，适用于较高的保温温度。

基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。

GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或oligo（dT）那样同所有RNA退火。

用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。

GSP可以同与mRNA3'

最末端退火的扩增引物序列相同，或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。

对于部分扩增对象，为了成功进行RT-PCR，需要设计多于一个反义引物，因为目的RNA的二级结构可能会阻止引物结合。

建议在20μl的第一链合成反应体系中使用1pmol反义GSP。

RT-PCR实验步骤：

一、组织抽提：

1.取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末

2.移入玻璃匀浆器加入1mlTrizol抽打匀浆

3.移入1.5ml新离心管用5ml针头抽打

4.冰上孵育5分钟

5.离心12,000g4℃5分钟取上清液移入1.5ml新离心管

6.加0.2ml氯仿，震荡，冰上孵育5分钟

7.离心<

12,000g4℃10分钟取上层液相移入1.5ml新离心管

8.加0.5ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟

9.离心<

12,000g4℃5分钟弃去上清液

10.加入1ml75%乙醇，震荡

11.离心<

7,500g4℃5分钟弃去上清液

12.室温下使之变透明

13.加入DEPC处理水10μl--35μl溶解RNA（可保存在液氮或低温冰箱）

14.走RNA变性电泳观察18s，28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度

二、RT反应体系（第一步）：

约20分钟

RNA抽提物

5μl

Radome引物

2μl

RNAsin

0.5μl

1.65℃15分钟

2.立即放入冰浴

RT反应体系（第二步）：

约2小时

10mMdNTP

1μl

5×

RT缓冲液

4μl

25mMMgCl2

AMV逆转录酶

3μl

1.37℃1.5小时

2.94℃5-10分钟

3.反应物保存于-20℃或进行PCR

三1、PCR反应体系：

约4.5小时

10×

PCR缓冲液

上下游引物10pmol/μl

2.5μl×

2

CDNA模板

2.5μl

ddH2O

34μl

Taq酶

轻质石蜡油

50μl

100μl

1.94℃2分钟，55℃1分钟，72℃2分钟为第一个步1个循环

2.94℃45秒，55℃40秒，72℃1分钟为第二步30个循环

3.72℃10分钟

4.取出后4℃5分钟后-20℃保存或走电泳

三2、PCR反应体系：

约5小时

30μl

2.94℃45秒，50℃40秒，72℃1分钟为第二步40个循环

四、电泳：

约1.25小时

1.配0.5×

TBE电泳缓冲液300ml

2.胶浓度1.7%（40ml0.5×

TBE加0.68g胶）

3.微波炉中火2分钟溶解胶

4.冷却至60℃加入溴乙锭2μl（10mg/ml的终浓度0.5μg/ml）

5.放入梳子，浇板，待凝固

6.加8μlPCR反应产物+2μl溴酚兰

7.电泳50-80V（每㎝5V）

RACE技术

∙•RACE技术-主要分类

∙•RACE技术-发展历史

∙•RACE技术-引物设计

∙•RACE技术-比较与优化

∙•RACE技术-实验步骤

∙•RACE技术-PCR扩增

∙•RACE技术-产物验证

∙•RACE技术-克隆和测序

∙•RACE技术-cDNA的获得

RACE（rapid-amplificationofcDNAends）是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。

RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'

端和5'

端的方法。

RACE技术-主要分类

一般分5-和3-RACE两种。

3-RACE较简单，首先将mRNA或总RNA用PolyT引物反转录，根据一般基因具有polyA尾巴的特点，选用特异引物（根据已知序列设计）和PolyT引物PCR即可。

大多实验者反映一次PCR可以搞定。

5-RACE相对较难，目前流行几种5-RACE。

其一为加接头（传统），根据接头引物和自己设计特异引物PCR，可以设计巢式PCR二次扩增。

另外，有利用反向PCR技术，连接成环在PCR。

还有，GENE公司一种smartRACEPCR，利用反转酶末断加C特点,直接加上多G接头，转换模板而无需用连接酶加接头。

RACE技术-发展历史

经典的RACE技术是由Frohman等（1988）发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5’和3’端，包括单边PCR和锚定PCR。

该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点（Frohman等，1995：

Schaefer，l995：

Chen，2019：

Bespalova等，2019：

Matz等2019）。

对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进：

改进之一是利用锁定引物（（lockdockingprimer）合成第一链cDNA,即在oligo（dT）引物的3′端引入两个简并的核苷酸【5′-Oligo（dT）16_30MN-3′,M=A/G/C;

N=A/G/C/T】，使引物定位在poly（A）尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo（dT）与poly（A）尾的任何部位的结合所带来的影响；

改进之二是在5‘端加尾时，采用poly（C），而不是poly（A）；

改进之三是采用RNaseH一莫洛尼氏鼠白血病毒（MMLV）反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温h（60度-70度）有效地逆转录mRNA，从而消除了5‘端由于高CC含量导致的mRNA二级结构对逆转录的影响；

改进之四是采用热启动PCR（hotstartPCR）技术和降落PCR（touchdownPCR）提高PCR反应的特异性。

随着RACE技术日益完善，目前己有商业化RACE技术产品推出，如CLONTECH的MarathoTM技术和SMARTTMRACE技术术。

邢桂春等（2019）先后使用上述两种试剂盒进行RACE反应，结果发现使用MarathonTM所得到的片断总是比采用SMARTsup]TMRACE试剂盒到所得到的片断短。

其原因在于MarathonTM技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5’末端。

所以认为，进行RACE反应应当优选SMARTTMRACE试剂盒。

RACE技术-引物设计

基因特异性引物（GSPs）应该是：

1、23－28nt

2、50－70％GC

3、Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2）.由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。

4、cDNA的合成起始于polyA+RNA。

如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。

5、RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。

6、在进行5‘和3’RACEPCR的时候应该使用热启动。

7、重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。

另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。

并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。

8、引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。

这样可以使用降落PCR。

避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。

另外，避免使用与AP1互补的引物，尤其是在3‘末端。

9、如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1和GSp2之间至少是100－200碱基。

只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。

10、降落PCR可以明显的增加RACEPCR产物的特异性。

在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。

随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。

11、验证基因特异性引物的对照：

单个引物的阴性对照：

只用一个引物GSP来进行阴性对照。

这样不应该产生任何的条带。

如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物。

利用两个GSPS进行阳性对照：

（只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。

）为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。

可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。

如果没有这个片段，应该重复cDNA的合成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。

12、制备和抽提polyA+RNA不要使用DEPC处理过的水。

纯化完mRNA之后，利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。

哺乳动物的mRNA样品是0.5－12kb的拖带，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。

非哺乳动物的mRNA应略小。

RACE技术-比较与优化

目的：

研究环化法、末端脱氧核糖核酸转移酶法和SMART反转录酶法3种常用5'

RACE的技术的特点，并对它们进行了优化。

方法：

以播娘蒿RNA为模板，先按文献标准方法进行5'

RACE，然后通过增加反应时间，提高部分反应物浓度等方法进行优化。

结果：

未优化前环化法和TdT酶法条带几乎不可见，SMART反转录酶法隐约可见条带，但不清晰。

优化条件后，环化法出现弥散条带，TdT酶法胜之，但条带依旧弥散，而SMART反转录酶法最佳，获得清晰特异性条带。

结论SMART5'

RACE效果最好，其次为TdT酶法，环化法效果有待改进，同时通过优化条件可以明显增加产物的特异性，为实验研究中5'

RACE方法的选择提供了依据。

RACE技术-实验步骤

cDNA第一条链的合成：

我们建议进行cDNA合成的对照反应，这样可以对样品的cDNA的合成进行鉴定。

加入各种试剂之后，在气浴中42度保温一个小时。

注意：

在水浴或酒精浴中保温回减少反应体积，从而降低第一链的合成效率。

将管放于冰上，以终止第一链的合成反应。

直接进行第二链的合成。

cDNA第二链的合成：

第二链合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和连接酶。

T4DNA聚合酶的功能是补平dscDNA的末端。

我们建议做阳性对照，试剂盒中提供人类骨骼肌的mRNA。

1、建议进行阳性对照,cDNA的质量取决于制备的polyA+RNA的质量。

非哺乳动物样品的mRNA大约在0.5－3kb之间。

2、通过电泳检测cDNA的产量，与对照进行对比，这样可以有利于在以后的步骤中对cDNA进行稀释。

3、按照程序进行连接反应。

4、如果没有对比样品和对照的产量，利用Tricine－EDTAbuffer制备接头连接的dscDNA的1/50和1/250的稀释物，用两种稀释物进行RACEPCR反应，直到鉴定出哪一种稀释可以得到好的效果。

RACE技术-PCR扩增

进行5’和3’的RACE－PCR扩增。

利用以下的程序进行降落PCR反应：

94度30秒

5个循环：

（1）94度5秒

（2）72度4分

（2）70度4分钟

20－25个循环：

（2）68度4分钟

我们建议使用降落PCR反应，这就要求GSP的Tm值≥70度。

1、当循环结束时，利用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析每一个管中的产物5μl，使用适当的分子量marker。

2、可以根据你的基因的特异性来设计最理想的循环参数。

如果看不到带或者只有微弱的带，在68度多加5个循环。

最佳的延伸时间取决于扩增条带的长度。

如果片断的长度在2－5kb的时候，经常使用4min，0.2-2kb的时候将延伸时间减到2－3min，对于5－10kb的条带，延伸时间增加到10min。

RACE技术-产物验证

1、应该对RACE的片段进行验证,以此来确定是否已经扩增了理想的产物。

如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员，验证是非常有用的。

2、有3种验证RACE产物的方法：

（1）比较由GSP和NGSP获得RACE产物。

（2）Southernblot

（3）克隆并测序

3、建议最好测得RACE产物的部分序列。

有的时候需要嵌套引物的存在。

比较由GSP和NGSP获得RACE产物。

4、对于5‘末端的RACE产物，比较由AP1和GSP1扩增出来的产物和由AP1和NGSP1扩增出来的产物。

5、对于3‘末端的RACE产物，比较由AP1和GSP2扩增出来的产物和由AP1和NGSP2扩增出来的产物。

这对于鉴定多条带是否是上一个PCR的特异性产物是非常有用的。

6、如果条带是正确的，在嵌套PCR反应中的条带应该是略微小一些。

基本PCR和嵌套PCR产物的迁移率的不同取决于cDNA结构中GSP1和嵌套引物的位置。

RACE技术-克隆和测序

1、可以利用胶回收试剂盒来回收RACE产物，此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；

对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。

如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine－EDTAbuffer30μl重新悬浮DNA样品。

2、电泳5μl回收的样品来鉴定回收的质量。

3、将回收的PCR产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中。

另外还可以利用接头和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位点，将产物克隆到常规载体中。

4、对于5‘端的RACE产物，我们建议挑取至少8－10个不同的克隆以获得5‘端的最大可能性的序列。

（反转录并不总是进行到mRNA模板的5’末端，尤其是长模板。

另外，T4DNA聚合酶会移走5‘末端的0－20个碱基。

）

5、一旦鉴定了含有插入片断的克隆，应该获得多的序列信息。

理想的是，可以对整个开放读码框进行测序。

包括5‘和3‘的非翻译区。

RACE技术-cDNA的获得

通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后，可以通过两种选择获得全长的cDNA。

通过PCR和克隆的方法。

通过PCR的方法获得全长cDNA：

1、扩增长的cDNA需要较长的延伸时间，但是如果延伸的时间过长，可以产生拖带，所以要慎重的设计引物。

2、根据从5‘和3‘RACE产物获得序列信息设计5’和3‘GSP引物。

这些引物应该来自cDNA的3’或者5‘的末端，应该是23－28nt长。

不应该在引物的末端加上限制性位点，这样会导致高背景。

在某些时候可以设计3’和5‘的嵌套引物。

但是还是应该先利用一对引物进行PCR反应。

3、进行如下的热循环：

25个循环：

（2）72度2－15分钟

4、延伸的时间应该等于预期的cDNA长度加上2分钟。

例如：

预期得到6kb的条带，用6＋2＝8分钟的延伸时间。

如果没有条带或者条带弱，增加5个循环；

或者优化PCR的条件。

5、在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。

通常情况下，可以见到一条单一带，如果这样，利用胶来纯化全长的cDNA。

6、制备1.2%的TAEbuffer制备琼脂糖凝胶。

不使用TBEbuffer，TBE的胶很难制备全长的cDNA。

7、将剩下的45μl反应物点样，选用适当的marker。

8、利用长波紫外观察cDNA（≧300nm）切下全长的cDNA。

应该尽量减少紫外对cDNA的照射。

9、利用胶回收试剂盒回收cDNA。

此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；

10、将全长的cDNA克隆到T/A型的PCR克隆载体中。

通过克隆产生全长的cDNA：

1、如果你已经获得了含有重叠部分的5‘和3’RACE产物，同时在cDNA的重叠部分含有一个酶切位点的话，通过克隆技术可以获得全长的cDNA。

2、利用酶切获得的3‘和5’扩增产物，并且利用T4DNA连接酶将它们连接起来。

利用接头和cDNA合成引物中的内切酶将最终的全长cDNA克隆到载体中。

3、在哺乳动物基因组中，NOT1和Srf1酶切非常稀少，大约106bp才出现一次，因此在绝大多数的cDNA中是不出现的。

RACE技术原理及应用

（2）

2019-02-0614:

24

　　目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。

尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。

近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增（RACE）技术为从低丰度转录快速获得全长cDNA提供了一个便捷的途径。

　　cDNA末端快速扩增（rapidamplificationofcDNAends,RACE）技术是一种基于mRNA反转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA（cDNA）完整序列的方法。

简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。

因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。

第二RACE的原理

　　RACE是采用PCR技术由已知的部分cDNA顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法,又被称为锚定PCR（anchoredPCR）和单边PCR（one2sidePCR）。

3’RACE的原理

　　一）加入oligo（dT）17和反转录酶对mRNA进行反转录得到（-）cDNA；

　　二）以oligo（dT）l7和一个35bp的接头（dT17-adaptor）为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。

这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。

再用一个基因特异性引物（3amp）与少量第一链（-）cDNA退火并延伸，产生互补的第二链（+）cDNA。

　　三）利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。

扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长（dT）碱基引起的错配。

5’RACE的原理

　　5’RACE与3’RACE略有不同。

首先，引物多设计了一个用于逆转录的基因特异引物GSP-RT；

其次，在酶促反应中增加了逆转录和加尾步骤，即先用GSP-RT逆转录mRNA获得第一链（-）cDNA后，用脱氧核糖核酸末端转移酶和dATP在cDNA5’端加poly（A）尾，再用锚定引物合成第二链（+）cDNA,接下来与3’RACE过程相同。

用接头引物和位于延伸引物上游的基因特异性引物（5amp）进行PCR扩增。

全长cDNA的获得

　　通过RACE方法获得的双链cDNA可用限制性内切酶酶切和southem印迹分析并克隆。

通常的克隆方法是同时使用一个切点位于接头序列上的限制性内切酶和一个切点位于扩增区域内的内切酶。

由于大多数非特异性扩增的cDNA产物不能被后一个限制性内切酶酶切，因而也就不会被克隆．从而增加了克隆的选择效率。

还可以用在基因特异性引物的5’端掺人一个限制性内切酶的酶切位点的方法来克隆。

最后，从两个有相互重叠序列的3’和5’RACE产物中获得全长cDNA。

或者通过分析RACE产物的3’和5’端序列，合成相应引物来扩增mRNA的反转录产物，从而获得全长cDNA。

第三RACE的应用

　　RACE技术主要是应用于对全长cDNA序列的获得，但对该技术进行一定的修改后，也可在其它方面显示出极高的应用价值。

　　首先，RACE技术可用于cDNA文库的构建及筛选。

Belyavaasky等（19