武汉大学基因工程李立家.docx
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武汉大学基因工程李立家
基因工程学：
分离基因以及工程基因过程、方法和相应的原理的一门学科。
基因工程就是在分子水平上，用人工方法提取（或合成）不同生物的遗传物质，在体外切割，再和载体拼接重组。
然后把重组的DNA分子引入细胞或生物体内，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达。
按人们的需要生产不同的产物或定向地创造生物的新形状，并使之稳定地遗传给下代。
现代基因工程学是和基因组学，蛋白质组学和计算机相结合的产物。
基因工程主要包括克隆和表达，其基本过程如下：
（1）外源DNA制备及限制性核酸内切酶切割；
（2）载体DNA制备及相应的限制性核酸内切酶切割；
（3）用DNA连接酶连接外源DNA和载体DNA；
（4）通过转化或转染方法将上述重组DNA转入受体细
胞中；
（5）筛选和鉴定转化细胞；
（6）表达目的基因和应用。
基因工程三大要素：
载体，工具酶，受体（细胞）--细菌、植物和动物加上DNA转移手段
基因工程载体：
用于承载、克隆、转移目的基因（也叫外源基因，DNA片段），能自我复制的DNA分子。
常用基因工程载体有：
细菌质粒；λ噬菌体；柯斯质粒；穿梭质粒；细菌人工染色体；酵母人工染色体；Ti质粒及其衍生载体
载体的要求：
A、复制：
具有能在受体细胞中复制的复制起点；B、选择性标记：
一般情况下，所要扩增的基因不便于选择，所以作为载体要求具有选择标记；C、限制性酶切位点：
对于某一种限制性酶，它的切点数要求是单一的。
现在已发展了许多具有多种单一的限制性酶识别位点的载体；D、载体的大小：
原则上要求载体越小越好；E、外源基因的性状表达：
结构基因的表达需要启动子；F、载体的安全性：
要求载体不能随便转移。
质粒的改造：
A、删除不必要的DNA区域。
尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA片段的装载量。
B、减少限制性酶切点。
缺失突变，限制性酶、核酸外切酶核连接酶的共同作用，机械破碎和质粒之间的重组等方法。
C、加入易于识别的选择性标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。
通过质粒之间的重组，可以使质粒带有合适的选择性标记。
D、关于质粒安全性能的改造。
灭活质粒在细菌之间转移的mob基因。
常用的生化遗传标记基因：
1.β-半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZα：
β-半乳糖苷酶基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。
该蛋白质可分为两部分：
α链和β链。
前者负责四聚体装配，后者具β-半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。
这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。
为α链编码的基因称之为lacZα（编码145AAs）。
这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。
β-半乳糖苷酶基因的优点:
a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观；b.lacZα编码5‘-端可容许很大的变化而不影响酶活性；c.lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大。
2.葡萄糖苷酸酶基因（GUS）：
该基因编码一种可分解各种β-葡萄糖苷酸及其衍生物的水解酶。
该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因。
3.荧光素酶基因：
荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发光细菌（Photobacteriumfischeri）产生的荧光素酶，它与FMN-氧化还原酶联用，通过NAD（P）H的变化测定酶活。
4.发光蛋白质基因（GFP）：
发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠杆菌菌落发绿色荧光。
质粒载体的分类及用途：
A、克隆载体。
用于克隆和扩增外源基因，它们或者含有能为氯霉素扩增的松弛型复制子结构，如pBR系列；或者复制子经过人工诱变，解除对质粒拷贝数的负调控作用，使质粒在每个细胞中可达数千个复制拷贝。
B、测序载体。
这类载体通常高拷贝复制，并含有Polylinker,便于各种DNA片段的克隆与扩增。
在Polylinker的两端含有两个不同的引物序列（T3/T5），使得重组质粒经碱变性后即可进行DNA测序反应，如pUC18/pUC19系列。
另一种测序质粒是M13噬菌体DNA与质粒DNA的杂合分子，如M13mp系列，它们在受体细胞中复制后，可以特定的单链DNA形式分泌到细胞外，克隆在这种质粒上的外源基因无需变性即可直接用于测序反应。
C、穿梭载体。
这种载体分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构以及相应的选择性标记基因，因此能在两种不同种属的受体细胞种复制并检测，如大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒、大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒等。
D、探针载体。
这类载体被用来筛选克隆基因的表达调控元件，如启动子和终止子等。
它通常装有一个可以定量检测其表达程度的报告基因（如抗生素的抗性基因），但缺少相应的启动子或终止子，因此载体分子本身不能表达报告基因，只有当含有启动子或终止子的外源DNA片段插入到载体合适的位点上，报告基因才能表达，而且其表达量的大小直接反映了被克隆的基因表达调控元件的强弱。
E、表达载体。
这类载体在Polylinker的上游和下游分别装有转录效率较高的启动子、合适的核糖体结合位点（SD-序列）以及强有力的终止子结构，使得克隆的外源基因均能在受体细胞中高效表达，如pSPORT系列和pSP系列。
噬菌体或病毒的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：
1.高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；2.自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。
λ噬菌体的改造和构建:
（1）缩短长度；
（2）删除重复的酶切位点增加一些单一的酶切位点；（3）加装选择标记；（4）构建琥珀密码子的突变体，琥珀型突变（ambermutation）是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变,抑制基因（sup）可以抑制这种突变。
λ-DNA作为载体的优点:
1.λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌。
2.λ-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量。
3.重组λ-DNA分子的筛选较为方便。
M13噬菌体载体作为克隆载体的优越性在于能象质粒那样转化进入受体细胞，也可以使用类似于质粒分离纯化方法制备M13DNA分子，同时又可以采用类似于噬菌体分离纯化方法制备单链M13DNA，单链DNA在序列测定及定位诱变等中极为有用。
柯斯质粒（Cosmids）:
它是由λ噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。
柯斯质粒的优点：
1.具有λ噬菌体的特性（体外包装，高效感染进入受体细胞）；
2.具有质粒载体的特性（易于克隆操作、也能转化进入受体细胞、选择及高拷贝等）；
3.具有较高容量（45kb）的克隆能力；
4.排斥非重组子；
5.不能体内包装，不裂解受体细胞，不形成噬菌体颗粒，因而不形成噬菌斑。
噬菌粒载体（phagemids）:
由丝状噬菌体DNA和质粒组成的杂合分子。
它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。
优点：
A、具有质粒性质，便于外源DNA的克隆及重组子的筛选；B、提高装载量；C、较稳定。
人工染色体载体
酵母人工染色体YAC（Yeastartificialchromosome）:
包含一个染色体在酵母中繁殖所需的三个序列成分：
A、酵母染色体的复制起点；B、一个着丝粒，保证染色体分离进入后代细胞中；C、端粒，染色体末端封合。
细菌人工染色体BAC（Bacterialartificialchromosome）以F1质粒衍生而来，能克隆约100kb-350kb的外源DNA片段，可以通过转化进入受体细胞，象一般质粒制备原理分离。
基因工程工具酶
2.1限制性核酸内切酶（RestrictionEndonuclease,RE）:
在研究寄主细胞对噬菌体的限制-修饰系统中发现，它能在DNA特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。
基本特征
①识别序列为4、5或6个碱基对且具有180旋转对称的回文结构②同位酶：
识别相同的序列但切点不同。
③一般来说，识别序列的碱基对越多，则这种酶在DNA上出现的频率越低；不同生物碱基含量不同，酶识别位点的分布及频率也不同。
④切开的DNA末端有平头末端和粘性末端（双链DNA的一条链突出，如5′或3′突出末端，在适当的温度下，两个互补粘性末端能退火形成双链分子。
2.2DNA连接酶:
DNA连接酶广泛存在于各种生物体内，其催化的基本反应形式是将DNA双链上相邻的3′羟基和5′磷酸基团共价结合形成3′-5′磷酸二酯键，使原来断开的DNA缺口重新连接起来，因此它在DNA复制，修复以及体内体外重组过程中起着重要作用。
2.3DNA聚合酶和Klenow大片段酶:
DNA聚合酶以一条DNA为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到双链DNA分子的3ˊ-OH端而合成新的DNA。
2.4碱性磷酸酶:
细菌的碱性磷酸酶（BAP）和牛小肠的碱性磷酸酶（CIP）均能催化DNA，RNA，核苷酸的5‘端除磷反应，因此在DNA重组实验中，该酶用于载体DNA的5′末端除磷操作以防止载体自身连接，提高重组效率；用于末端标记。
2.5末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）:
该酶来源于小牛胸腺，它是一种不需要模板的DNA聚合酶，其合适的底物形式为带有3′游离羟基的双链DNA分子,当底物为3’端突出的双链DNA时，TdT在Mg2+的存在下，即可将脱氧核苷酸随机聚合在两条链的3′端，对于平头或3′凹端DNA底物，则需要Co激活，但聚合反应仍不按模板要求进行.TdT在人工粘性末端的构建中极为有用。
2.6S1核酸酶（S1,Nuclease）:
该酶来源于米曲霉茵，催化反应通常由Zn2+激活，并在酸性pH（4.0-4.5）条件下进行，其特征是：
（1）降解单链DNA或RNA，包括不能形成双链的区域（如发夹结构中的环状部分），但降解DNA的速度大于降解RNA的速度；
（2）降解反应的方式为内切和外切；（3）酶量过大时会伴有双链核酸的降解。
因为该酶的双链降解活性比单链低7.5万倍，因此在DNA重组及分子生物学研究中，S1核酸酶常用来切平突出的单链末端以及制作S1图谱。
用途：
（1）测定真核基因中间隔子序列位置；
（2）去除DNA片段中突出的单链尾巴；（3）打开cDNA合成时形成的发夹环结构。
2.7影响限制性核酸内切酶活性的因素
（1）DNA的纯度：
一个限制性核酸内切酶单位u：
在最佳缓冲系统中，在37℃下反应1小时完全降解1μgλDNA所需的酶量。
（2）温度：
大部分限制性核酸内切酶最适反应温度为37℃，但也有例外，如SmaⅠ的反应温度为25℃,SfiI为50℃。
降低最适反应温度，会导致只产生切口，而不是切断双链DNA。
（3）盐离子浓度：
不同的核酸限制性内切酶对盐离子强度（Na+）有不同的要求，一般按离子强度不同分为低（0-50mM）、中（100mM）、高盐（150mM）三类。
Mg2+也是限制性内切酶酶切反应所需
（4）缓冲体系：
核酸限制性内切酶要求有稳定的pH值环境，这通常由Tris-HCl缓冲体系来完成。
（5）反应体积和甘油浓度：
商品化的限制性内切酶均加50%甘油作为保护剂，一般在-20℃下贮藏。
在进行酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10%，若加酶的体积太大，甘油浓度过高，则会影响酶切反应。
（6）限制性内切酶反应的时间：
通常为1小时，但大多数酶活性可维持很长的时间，进行大量DNA酶解反应时，一般让酶解过夜。
（7）限制性内切酶星号活性：
限制性核酸内切酶有特异性识别序列和切割位点，但当酶解条件发生变化时，酶切反应的专一性可能会降低，导致同种酶识别多种识别位点，这种现象称为星号活性。
3．1凝胶电泳技术：
以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳，其中聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyzcrylamidegelelectrophoresis,PAGE）
琼脂糖凝胶电泳的条件影响：
①DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。
②随着电场的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小，即分辨率降低。
③DNA分子在TAE和TBE等缓冲液中带负电荷，在电场中向正极移动。
④琼脂糖浓度。
采用不同的凝胶能分辨不同分子量的DNA分子,琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙。
浓度高,空隙小。
空隙小，分辨率高：
小分子较易通过，而大分子难通过；空隙大，分辨率低：
大小分子几乎以同等速率通过。
⑤电场方向。
电场方向改变，DNA分子被迫改变路径，DNA分子越大，为适应新的电场方向而重新排列所需的时间就越长。
因此可以通过脉冲电场凝胶电泳来分辨极大的DNA分子。
3．2核酸的分子杂交技术
探针与探针标记：
带有能检测的标记物的DNA或RNA叫探针。
使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程叫探针标记。
切口平移（Nicktranslation）：
DNA聚合酶I把一个带有标记物的dNTP就加在这引物的3-OH末端，而它的5-3的核酸外切酶活性将切除5-单核苷酸，同时依次添加新的核苷酸到3一侧，其结果使切口沿着DNA平移，这就叫切口平移（Nicktranslation）
随机引物：
能与任何DNA配对互补的一小段DNA序列叫随机引物。
Southern杂交技术：
待分析的基因组DNA或其它DNA首先用一种或几种限制性核酸内切酶消化，消化后的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳按照分子量的大小进行分离，凝胶经碱变性处理，将DNA分子变性成单链，经毛细管作用或物理方法将凝胶中的单链DNA分子从胶上转移到固相支持物上（一般使用的是尼龙膜和纤维素膜）。
然后用标记的DNA或RNA探针对附着于膜上的DNA进行杂交来检测这些被转移的DNA片段，与探针有同源性的DNA片段在膜上的位置可以通过特定的检测方法如放射自显影或显色而显示。
Northern杂交是将RNA样品通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到硝酸纤维素滤膜上，用同位素或生物素标记的DNA或RNA特异探针针对固定于膜上的mRNA进行杂交，洗脱除去非特异性杂交信号，对杂交信号进行分析，以确定目的基因的是否转录，是检测RNA（主要是mRNA）的方法。
1、基本原理和基本过程与Southernblot基本相同
2、鉴别RNA
3、探针可用DNA或RNA片段
4、待测样品为总RNA或mRNA
Westernblot：
将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。
操作过程 ：
蛋白质样品制备→SDS-PAGE电泳→转膜（PVDF或硝酸纤维素膜）→封闭→一抗→洗涤→酶标二抗反应→洗涤→显色或化学发光显影
Northern印迹与Southern印迹的不同点：
1、变性：
RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性
2、转膜：
RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理
3、靶核酸为RNA，不需限制酶消化
基因文库（genelibrary）或DNA文库：
在细菌中增殖来自某一生物的染色体基因组DNA（或来自所有不同的mRNA种的每一种cDNA分子）所形成的的全部DNA片段之集合体。
有基因组DNA文库（克隆）和cDNA文库（克隆）。
cDNA克隆文库：
来自某一生物的某种组织的所有不同的mRNA合成的cDNA分子再将cDNA重组到载体上，导入大肠肝菌细胞增殖。
基因组DNA文库构建
①载体DNA片段的制备：
DNA分离纯化→限制酶切→脱磷酸化反应；
②供体DNA片段的制备：
总DNA分离纯化→物理切割法或机械搅拌或限制性核酸内切酶酶切法（内切酶Sau3A进行局部消化，可得到10-30kb的随机片段）→分离特定大小DNA片段；
③DNA片段大小分离和富集：
琼脂糖凝胶电泳和蔗糖梯度离心技术；
④载体与基因组DNA大片段的连接。
转化（transformation）:
感受态的大肠杆菌捕获和表达外源质粒DNA分子的过程；
转染（transfection）:
感受态的大肠杆菌捕获和表达外源噬菌体DNA分子的过程。
感受态：
细菌吸收转化因子的生理状态。
一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：
重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力。
载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆。
克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序。
克隆片段易于从载体分子上完整卸下。
重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。
cDNA文库优越性：
A、一些RNA病毒基因克隆的唯一手段。
B、比基因组DNA文库小很多，容易构建,筛选较简单。
C、假阳性几率低。
D、生产表达产物蛋白质。
E、功能研究,不含内含子序列,可以在细菌中直接表达（一般选
用的载体都是表达型的）。
聚合酶链反应（PCR）：
能在体外特异快速扩增DNA片段。
组成：
DNA单链模板、引物和DNA聚合酶（包括缓冲液）。
A、TaqDNA聚合酶；B、引物：
引物是保证PCR特异性的关键因素，一般使用两个引物来扩增专性序列。
C、反应缓冲液：
Mg2+:
可显著影响PCR的产量及产物特异性，一般用量为1.5mM。
过高则出现非特异扩增，过低则酶活性显著下降。
D、dNTP：
dATP,dGTP,CTP和dTTP贮备液浓度均为5mM，保存于-20℃，使用浓度为200M。
过低则反应速度下降，过高则特异性下降。
E、反应条件：
变性温度和时间：
保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。
复性温度和时间：
PCR反应的特异性取决于复性过程中引物与模板的结合，一般为40-60℃.越高,产物的特异性也越高。
时间一般为30-60s。
延伸温度和时间：
一般位于Taq酶最适作用温度70-75℃之间。
小于1kb的片段一般1-2min就足够了,而更大片段需延长时间。
循环数：
在25-30个循环内,扩增DNA增加明显,以指数方式
增加，后进入相对稳定状态,此时,①引物和dNTP下降；②Taq酶活性下降；③扩增产物（焦磷酸盐和DNA）的阻碍作用；④高浓度的产物可能降低Taq酶的延伸和加工能力。
所以一味增加循环次数只会增加非特异扩增。
PCR技术的应用：
A、基因组DNAPCR克隆和cDNA的RT-PCR克隆
B、基因组的RAPD（随机扩增多态DNA分析，randomamplifiedpolymorphicDNA）标记分析。
使用随机的短核苷酸引物，在低的退火温度下进行扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳所呈显的带型，反映着用作扩增模板的DNA分子的总体结构特征。
C、临床诊断和法医鉴定
如男女性别鉴定，病毒性感染病的诊断，对单根毛发或单个
精子作遗传学鉴定等。
D、基因表达定量分析
DNA测序：
Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学修饰法。
目的基因的克隆策略是是建立在基因的分子生物学的基础上综合利用各种基因工程技术手段和理论建立发展起来的。
目前主要有如下几种策略：
PCR或杂交分离、图位克隆、转座子示踪等。
A.PCR或杂交分离；B.mRNA差别显示技术（DifferentialDisplayofReverseTranscriptionalPCR,DDRT-PCR）；C.差别杂交（differentialhybridization）；D.基因图位克隆（map-basedcloning）用于分离其编码产物尚不知道的目的基因的一种有效方法。
RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism）,即DNA限制片段长度多态性，它是指应用特定的核酸限制性内切酶切割有关的DNA分子，所产生出来的DNA片段在长度上的简单变化。
分子（DNA）标记（molecularmarker）：
分子标记是在所有生物学标记中用途最为广泛的标记。
分子标记是一个用作遗传分析的DNA路标，它反映的是不同生物个体DNA序列水平的差异。
分子标记的特点：
直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；
数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；
多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；
表现为中性，不影响目标性状的表达；
许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。
染色体步移（chromosomewalking）：
根据高密度的分子标记遗传图谱，利用在目的基因的两侧最紧密连锁的一个或一对分子标记作探针，通过筛选基因组文库分离出阳性克隆，以阳性克隆的末端单拷贝序列为探针再筛选基因组文库分离出阳性克隆，并通过DNA指纹分析将分离出的基因组克隆重叠连接在一起形成重叠群。
如此重复多次直到克隆重叠群覆盖目的基因。
这种技术称为染色体步移。
大肠杆菌表达系统优缺点
优越性:
（1）结构简单，生理生化和遗传背景知识，尤其是其基因表达调控机制有了清楚的了解；
（2）易于大规模培养，成本低廉；（3）经过了遗传改造，已发展为一种安全的基因工程实验系统，拥有各种不同的菌株和载体系列。
不足之处（表达真核基因的障碍）:
（1）真核基因具有内含子，所以只能用其cDNA；
（2）许多真核生物基因仅在大肠杆菌中合成无特异性空间结构的多肽链；（3）许多真核基因的蛋白质产物，都要经受翻译后的加工修饰，而大肠杆菌缺乏蛋白质加工系统；
（4）大肠杆菌内源性蛋白酶易降解外来的真核生物基因所表达的蛋白质分子；（5）大肠杆菌细胞膜间隙中含有大量的内毒素，痕量的内毒素即可导致人体热原反应。
外源基因在大肠杆菌中的高效表达原理涉及三个方面：
（1）强化蛋白质的生物合成（重组质粒的拷贝数，转录水平和翻译速率）；
（2）抑制蛋白质产物降解；（3）恢复维持蛋白质特异性空间结构。
1.启动子影响表达效率的主要因素之一是启动子的强度，
（1）启动子本身的序列，尤其是-10区（TATAAT）和-35区（TTGACA）两个六聚体盒的碱基组成；
（2）-10区和-35区的间隔距离，接近于17个碱基对，启动子活性强度也就越强，若大于17，则启动子活性强度也就越弱；（3）与启动子和外源基因转录起始位点之间的距离有很大关系。
高水平表达的最佳启动子必须具备的条件：
（1）它必须是一种强启动子，能够使克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10％-30％；
（2）这种启动子应该是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。
2.终止子：
有效的转录终止子的必要性：
（1）转录产物越长，所需时间就多，外源基因本身的转录效率下降；
（2）转录通读进入质粒功能区，可能干扰质粒的复制和其他生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；（3）转录终止子能增强mRNA分子的稳定从而大大提高了蛋白质产物的水平；（4）转录产物过长影响翻译效率。
3.SD序列：
外源基因在大肠杆菌中的高效表达不仅取决于转录启动频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。
大肠杆菌mRNA的翻译起始效率主要由其5‵端的结构序列所决定，即核糖体结合位点（RBS），它包括4个结构要素：
（1）起始密码子上游的6-8个核苷酸序列UAAGGAGG,即Shine-Dalgarno（SD）序列；
（2）起始密码子AUG；（3）SD与起始密码子之间的距离及碱基组成；（4）基因编码区5‵端若干密码子的碱基序列，至少这一序列不能与mRNA的5‵端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位。
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