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油樟dna提取的研究大学论文
本科毕业论文（设计）
毕业论文
题目：
油樟DNA提取的研究
专业：
生物科学
学生姓名：
学生学号：
030601023
系级班：
生物工程03级1班
指导教师：
职称:
教授
宜宾学院教务处制
摘要
油樟是樟科樟属植物，本课题主要研究油樟根茎叶DNA的提取方法以及对根茎叶DNA提取效果进行对比分析。
油樟的细胞内含有大量的多糖、多酚、鞣质等次生代谢物,针对这一情况本研究在常规CTAB法的基础上做了进一步改进，成功提取出了高质量DNA。
做的改进主要有：
①在CTAB提取缓冲液中加入2gPVP以除去酚类杂质；②将DNA样品溶于TE缓冲液中保存时在样品中加入3μlRNaseA，以除去RNA。
用改进CTAB法提取的DNA得率和纯度都较高。
用改进CTAB法提取的油樟根DNA得率小于油樟茎DNA的得率小于油樟叶DNA得率，由于植物各组织器官的基因组DNA是相同的，因此宜用更易研磨成细粉的油樟嫩叶来提取油樟DNA，用做科研和教学。
关键词：
油樟；DNA；CTAB（十二烷基三甲基溴化铵）；电泳；光吸收
Abstract
CinnamomumlongepaniculatumbelongstolaurelfamilyandLauraceaespecies.ThetopicsstudiedmainlythemethodofextractingDNAandcomparedtheDNAextractingmethodsfromroots,branchesofCinnamomumlongepaniculatum.CellsofCinnamomumlongepaniculatumcontainalargenumberofpolysaccharides,polyphenols,tannins,andothersecondarymetabolites.BasedonconventionalCTABmethod,aserialofimprovementswerecarriedoutandhigh-qualityDNAwassuccessfullyobtained.Themainimprovementsare:
①2gPVPwasaddedintoCTABextractionbuffertoremoveimpuritiesphenols;②3μlRNaseAintothesampleswhenDNAsamplespreservedinTEbuffertoremoveRNA.ImprovedCTABextractionofDNAyieldandpuritywashigher.TheDNAyieldusingimprovedCTABextractionwasroots>stems>leaves.BecausegenomicDNAissame,itiseasiertoextractDNAfromleavesofCinnamomumlongepaniculatumforresearch.
Keywords:
Cinnamomumlongepaniculatum;DNA;CTABmethodofDNA;electrophoresis;absorbingvalueoflight
目录
摘要I
AbstractII
第1章绪论1
第2章油樟根茎叶DNA的提取方法3
1.材料、药品、仪器3
1.1材料3
1.2主要试剂溶液3
1.3主要仪器设备4
2.实验方法和步骤4
2.1常规方法的提取4
2.2改良CTAB法5
2.3油樟根、茎、叶DNA提取的比较方法6
3.结果及分析6
3.10.8%琼脂糖凝胶电泳结果及分析6
3.2紫外光谱分析8
4.讨论10
4.1CTAB法的基本原理10
4.2几种主要试剂的作用与对比10
4.3方法的探索及改进11
4.4注意要点12
4.5实验过程中遇到的问题及对策12
5.总结13
5.113
5.213
5.313
参考文献14
致谢15
文献综述16
第1章绪论
图1-1油樟
如图1-1油樟[Cinnamomumlongepaniculatum（Gamble）]是樟科樟属植物。
高大乔木，叶互生，卵形、椭圆形或短圆形，先端长渐尖或急尖，基部楔形至近圆形，长5.5-12cm，宽3-6cm，幼时即无毛，腹面暗绿色，有光泽，背面粉绿色，通常羽状脉，中脉两面凸起，侧脉约5-6对，两面凸起，脉腋腹面泡状隆起，背面有小窝孔，孔内有短毛，横脉和细脉背面较明显，叶柄长2-3cm，无毛。
圆锥花序腋生，纤细，疏散，通常长10cm以上，无毛，花梗长1-3cm，无毛；花被长约2mm，外侧无毛，内侧密被毛，裂片卵形，长1.5mm，花后花被上部自花被管的顶端处整齐环裂脱落；雄蕊长约1mm，被柔毛，第3轮的花丝基部有1对具短柄状的腺体，退化雄蕊长约0.5mm，被毛，近心形；雌蕊无毛，子房近圆球形状，花柱较子房为长，柱头小，盘状。
果阔倒卵状，顶端平或微凹，歪斜，稍扁，长9mm，直径8mm，果托碟状，全缘，直径约3.5mm；果梗长4-5mm，向上增粗。
花期4-5月；果期8-9月[1]。
油樟在四川有大量分布，产于叙永、宜宾、屏山、娥眉、雅安、邛崃等地。
宜宾是油樟的分布中心。
在经历了许多坎坷之后，油樟终于闪现出了它那金子般的光芒。
1951年修建成渝铁路时，油樟被成批地砍伐用作枕木；1958年大办钢铁时，油樟竟老嫩不拘，被用作烧泡炭的燃料；1960年生活困难时，为了熬煮樟油，对幸存的樟树进行了掠夺性的采摘。
这些事实都导致珍贵的油樟资源招到了大规模的破坏，幸好在1978年十一届三中全会以来，各项林业政策得到了落实，油樟林也逐渐得以恢复。
1978年樟油产量增长为356t，比1959年的305t，增长16.7%。
到1985年宜宾县已有油樟林35130亩，采叶油樟树达到369万余株，全县树龄达到100年以上的油樟64株，200年以上的9株。
1986年宜宾县被列为四川油樟基地[2]，由于大力发展油樟，到1995年，宜宾全县油樟面积由1980年的0.28万hm2发展到0.77万hm2，樟油产量从1980年的400多吨，增加到1995年的1200t，占全国同类产品产量的75%，占全省产量的90%，产品畅销日本、德国、法国、美国等50多个国家和地区，为国家创汇450多万美元[3]。
宜宾县被称为全国保存和发展最好的天然香料油源基地。
樟油粗加工的主产品1.8-桉叶油素，被称为“中国桉叶油”[4]，1984年被评为四川省优质产品。
1999年，为适应西部大开发的形势，增加长江上游绿色植被，加大力度保护油樟树这一独特资源，建设全国最大的木本香料油基地，宜宾县又决定到2001年，用3年时间，再营造0.30万hm2油樟树基地。
油樟树具有生长快、材质好，萌发力强、干形通直，树形美观等特点，叶、枝、根、茎、花、果富含芳香油，是提炼天然香料的优良树种，也是目前全国保存和发展最好的天然香料油源。
它含有1．8-桉叶油素、α-萜品醇（松香醇）和香穗烯等40多种成分，经过深度加工可以提取多种重要的天然单离原料，是国防、轻工、香料、医药和高级电镀工业的稀有原料[5]。
特别是从中提取的1．8-桉叶油素物性稳定、芳香纯正，在国际贸易中被称为“中国桉叶油”，在世界各国都属免检产品。
为了充分开发利用油樟这一优势资源，国家科委于1996年将其列入了国家“星火计划”和名特优经济林商品基地建设项目[6]。
宜宾县地处金沙江和岷江下游“金三角”地带，是全国最大的油樟基地，樟油产量占全国的75%，占四川的90%，被中外客商誉为“油樟王国”。
大力发展油樟，对农民致富、出口创汇、增加税收、绿化荒山以及维持长江上游的生态环境等都起着十分重要的作用。
我们学校已经建立了以油樟为主要研究对象的“西南特色经济植物重点实验室”，为了从分子水平上对其做进一步的研究，本课题开始了初步的尝试，目的是为以后的分子生物学分析打下基础。
第2章油樟根茎叶DNA的提取方法
由于DNA分子标记实验以及其他许多分子实验，是从研究生物个体的基因组，脱氧核糖核酸开始的，因此，能否得到高质量的基因组DNA自然成为DNA标记技术关键的一步，只有高质量的DNA，才能够获得理想的DNA条带。
油樟的细胞内含有大量的多糖、多酚、鞣质等次生代谢物。
这些次生代谢产物,不仅能干扰DNA的提取过程,影响DNA的得率,还能与DNA发生不可逆的结合（尤其是多酚氧化后产物）,影响DNA的质量,使提取的DNA样品呈棕褐色,DNA溶液粘稠,这种不纯的DNA既不能被内切酶酶切,也不能作为PCR模板,不能用于常规的分子生物学分析和研究[7]。
因此,如何从油樟中取得适于分子遗传分析和鉴定的高纯度基因组DNA是对其进行分子生物学研究首先要解决的问题。
虽然目前国内外针对多种顽拗植物基因组DNA的提取进行了大量的研究,提出了许多改进方法,但这些技术方法只是针对某种或某类植物而言,不同的顽拗植物所含的次生代谢物种类和含量不同,因此改进的方法也存在差异,不能普遍适用。
要想得到高质量的DNA，在DNA提取过程中既要防止DNA的降解和变性，又要尽量保持其在生物体内的天然状态。
要提取天然的具有生物活性的DNA，必须在温和的条件下，防止过酸、过碱和DNA酶的污染，避免剧烈振动与搅拌[8]。
采用常规CTAB法提取的油樟基因组DNA质量很差,本研究就以油樟的根、茎、叶为实验材料,探讨提取高质量油樟基因组DNA的方法。
1.材料、药品、仪器
1.1材料
采于宜宾县宗场镇孜岩村陆场主承包的油樟林，采取了幼嫩的油樟根、茎、叶，装入1.5mlEppendorf管和5ml离心管，立即置液氮罐中预冷，带回实验室后，保存于-70℃的冰箱中备用。
1.2主要试剂溶液
1.2.1液氮;
1.2.2CTAB提取缓冲液（2×）：
100mmol/lTris-Hcl（PH8.0）,20mmol/lEDTA,1.4mmol/lNacl,2%（W/V）CTAB,4%（V/V）β-巯基醇,2%（W/V）PVP;
1.2.3CTAB沉淀缓冲液（1×）：
50mmol/lTris-Hcl（PH8.0）,10mmol/lEDTA,0.7mmol/lNacl,1%（W/V）CTAB,2%（V/V）β-巯基乙醇;
1.2.4CTAB/Nacl溶液（10%CTAB/0.7mol/lNacl）:
在80ml蒸馏水中溶解4.1gNacl,缓慢加入10gCTAB,同时加热搅拌，如果需要，可加热至65℃溶解[9];
1.2.5氯仿/异戊醇（24：
1）;
1.2.6电泳缓冲液（TAE）：
A）50×储存液（PH约8.5）:
24.2gTris碱,5.7ml冰醋酸，3.72gEDTA,补加水至100ml
B）1×工作液：
40mmol/lTris·Ac,1mmol/lEDTA;
1.2.7琼脂糖凝胶：
0.8g琼脂糖，0.5μg/mlEB,补加1×TAE至100ml。
1.3主要仪器设备
1.3.1通风橱
1.3.2HH-S数显恒温水浴锅
1.3.3冷冻高速离心机
1.3.4紫外分光光度计
1.3.5CHN868PH计
1.3.6立式电热压力蒸汽灭菌器
1.3.7优普超纯水机
1.3.8格兰仕微波炉
1.3.9BIO-RAD凝胶成像系统
1.3.10电热恒温鼓风干燥箱
2.实验方法和步骤
2.1常规方法的提取
本研究参考《精编分子生物学实验指南》，采用常规CTAB法来提取油樟根、茎、叶DNA，具体操作程序如下：
2.1.1在所需的CTAB抽提液中加入β-巯基乙醇，使终浓度达4%（V/V），将此溶液及CTAB/Nacl溶液加热至65℃;
2.1.2取新鲜幼嫩叶片（根或茎）约3g,迅速放入离心管中，置于液氮罐中预冷;
2.1.3将样品从液氮罐中取出，放入预冷的研钵中，在研钵中不断倒入液氮，将叶片（根或茎）研磨成细粉;
2.1.4迅速将研磨好的细粉装入试管中，加入12μl预热的β-ME/CTAB，混合使之充分湿润;
2.1.5将试管置于65℃水浴中，保温80min,不时混匀;
2.1.6待冷至室温后，用等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：
24：
1）抽提，轻缓颠倒充分混匀，于4℃，12000rpm离心10min，回收上（水）相;
2.1.7在回收的上层中加入1/10体积的65℃预热的CTAB/Nacl溶液，颠倒混匀;
2.1.8用等体积的氯仿/异戊醇抽提，混匀，于4℃，12000rpm离心10min，回收上（水）相;
2.1.9加入正好1.5体积的CTAB沉淀液，颠倒离心管混匀，如果沉淀可见，继续步骤2.1.11，否则于65℃预热30min;
2.1.11加入0.6体积的异丙醇沉淀核酸，充分混匀，于4℃，12000rpm离心10min，沉淀DNA，用80%的乙醇洗涤沉淀物，干燥;
2.1.12沉淀干燥后溶于100μlTE缓冲液中，-20℃储存备用;
2.1.13用0.8%的琼脂糖凝胶做电泳分析;
2.1.14用紫外分光光度计做紫外光谱分析。
2.2改良CTAB法
具体操作程序如下（所有步骤为严格的无菌操作）：
2.2.1在12mlCTAB抽提液中加入480μlβ-巯基乙醇,使终浓度达4%（V/V）。
将此溶液及CTAB/NaCl溶液水浴加热至65℃；
2.2.2取新鲜幼嫩根（叶片或茎）约3g，放入预冷的研钵中，不断倒入液氮将根（茎或叶）研磨成细粉；
迅速将研磨好的细粉装入试管中，加入预热的β-ME/CTAB，混合使之充分湿润；
2.2.3将试管置于65℃水浴中，保温80min,其间不时混匀；
2.2.4将样品转移至50ml离心管中，待冷至室温后，用等体积的氯仿/异戊醇抽提，轻缓颠倒充分混匀，于4℃12000rpm离心10min,回收上（水）相；
2.2.5在回收的上相中加入1/10体积的65℃预热的CTAB/Nacl溶液，颠倒混匀；
2.2.6用等体积的氯仿/异戊醇抽提，混匀，于4℃12000rpm离心，回收上（水）相；
2.2.7加入1体积的CTAB沉淀液，颠倒离心管混匀，如果沉淀可见，继续步骤2.3.8，否则于65℃温浴30min；
2.2.8加入0.6体积的异丙醇沉淀核酸，充分混匀，于4℃12000rpm离心10min，沉淀DNA；
2.2.9用80%乙醇洗涤沉淀物，干燥；
2.2.10沉淀干燥后溶于加有2µl1mg/mlRNaseA的100µlTE缓冲液中，4℃储存备用；
2.2.11取油樟根、茎、叶DNA各7µl，用0.8%（W/V）琼脂糖做凝胶电泳分析；
2.2.12取10µlDNA样品，稀释至2.5ml，测其A260和A280的吸收值。
2.3油樟根、茎、叶DNA提取的比较方法
本研究设置了单因素变量对照,从DNA的浓度和得率两方面来对比评判提取油樟根茎叶DNA的难易程度，如表2-1:
表2-1单因素变量法对比油樟根茎叶DNA
选择因子
根
茎
叶
材料
油樟根（2g）
油樟茎（2g）
油樟叶（2g）
药品
相同
相同
相同
仪器
相同
相同
相同
DNA提取方法
相同
相同
相同
凝胶电泳分析方法
相同
相同
相同
紫外光谱分析方法
相同
相同
相同
DNA浓度计算方法
相同
相同
相同
DNA得率计算方法
相同
相同
相同
3.结果及分析
3.10.8%琼脂糖凝胶电泳结果及分析
3.1.1用常规CTAB法所提根茎叶DNA的0.8%琼脂糖凝胶电泳结果及分析：
图3-1常规CTAB法提取的油樟根茎叶DNA凝胶电泳图谱
M:
DL20001:
根DNA2:
茎DNA3:
叶DNA
结果分析:
由图3-1可以看出,常规CTAB法提取的DNA质量较差，表现为DNA样品浓度较低，有严重的污染，说明该方法有待改进。
3.1.2用常规CTAB法所提DNA样品污染物研究结果及分析:
图3-2加RNaseA前后油樟根茎叶DNA凝胶电泳图谱
M:
DL20001-3:
未加RNaseA根茎叶DNA4-5:
加入RNaseA后根茎叶DNA
结果分析:
由图3-2可以看出,加入RNaseA前（如图3-2中编号1-3）,在250-1500bp处有明晰的条带，加入RNaseA后（如图3-2中编号4-5）则该条带消失，说明在250-1500bp处的清晰的条带为RNA条带，用常规CTAB法提取的DNA中有严重的RNA污染。
3.1.3用改进CTAB法所提根茎叶DNA的0.8%琼脂糖凝胶电泳结果及分析：
图3-3油樟根茎叶DNA的凝胶电泳图谱
M：
DL20001：
根DNA2：
茎DNA3：
叶DNA
结果分析:
由图3-3可以看出,DNA无降解也无蛋白质和RNA污染，改进CTAB法较常规CTAB法所提油樟根茎叶DNA质量明显提高，具体表现为DNA的浓度和纯度大幅度提高；[DNA]根<[DNA]茎<[DNA]叶，表明在其他条件相同时，所提取油樟的根DNA的浓度小于茎DNA的浓度小于叶DNA的浓度，说明提取油樟根DNA的难度大于茎DNA的难度大于叶DNA的浓度。
3.2紫外光谱分析：
3.2.1常规CTAB法所提取油樟根、茎、叶DNA紫外光谱结果及分析:
表3-1常规CTAB法所提取油樟根茎叶DNA紫外光谱分析表
A260（Abs）
A280（Abs）
A260/A280
DNA浓度（μg/ml）
DNA得率（μg/g）
根
0.007
0.003
2.333
87.5
43.8
茎
0.070
0.033
2.121
875
437.5
叶
0.102
0.046
2.217
1275
637.5
注：
①据公式[DNA]=A260×稀释倍数×50（µg/ml）[10]计算出油樟根茎叶DNA浓度为:
[DNA]根=87.5µg/ml
[DNA]茎=875µg/ml
[DNA]叶=1275µg/ml
②据公式DNA得率（提取率）（μg/g材料鲜重）=DNA浓度/取材量（g）计算出油樟根茎叶DNA得率为:
根DNA得率=43.8μg/g
茎DNA得率=437.5μg/g
叶DNA得率=637.5μg/g
结果分析:
由表3-1看出,常规CTAB法DNA质量很差，具体表现为油樟根茎叶DNA的浓度和得率都很小，A260/A280的比值>2，说明油樟根茎叶的DNA质量很低，有较严重的RNA污染。
3.2.2改进CTAB法所提取油樟根、茎、叶DNA紫外光谱结果及分析:
表3-2改进CTAB法所提油樟根茎叶DNA紫外光谱分析表
A260（Abs）
A280（Abs）
A260/A280
DNA浓度（μg/ml）
DNA得率（μg/g）
根
0.014
0.008
1.75
175
87.5
茎
0.200
0.109
1.83
2500
1250.0
叶
0.673
0.375
1.89
8413
4206.5
注:
①据公式[DNA]=A260×稀释倍数×50（µg/ml）计算出：
[DNA]根=175µg/ml
[DNA]茎=2500µg/ml
[DNA]叶=8413µg/ml
②据公式DNA得率（提取率）（μg/g材料鲜重）=DNA浓度/取材量（g）计算出：
根DNA得率=87.5μg/g
茎DNA得率=1250.0μg/g
叶DNA得率=4206.5μg/g
结果分析:
由表3-2看出,改进CTAB法较常规CTAB法所提油樟根茎叶DNA质量明显提高，具体表现为DNA的浓度和纯度大幅度提高：
改进CTAB法提取的油樟叶油樟A260/A280的比值在1.7-1.9之间，说明油樟根茎叶的DNA质量都比较高，无较大的RNA污染和蛋白质污染；[DNA]根<[DNA]茎<[DNA]叶,根DNA得率<茎DNA得率<叶DNA得率。
显示在单一变量对照下，所提取油樟的根DNA的浓度和得率依次小于茎DNA的浓度和得率小于叶DNA的浓度和得率，说明提取油樟根DNA的难度大于茎DNA的难度大于叶DNA的浓度。
4.讨论
4.1CTAB法的基本原理
由于植物染色体DNA与组蛋白等结合成为脱氧核糖核蛋白复合体（deoxy-ribonuleoprotein,DNP）,存在于细胞核中，因而，从细胞中提取DNA时，首先需要把DNP抽提出来，其次把蛋白质除去，然后除去细胞中的糖，核糖核酸（RNA）及无机离子等，从中分离出DNA。
DNP和核糖核蛋白复合物（RNP）在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响不同，DNP在高盐溶液（≥0.7mol/lNacl）中可以稳定存在，但如果降低盐浓度，DNP的溶解度也随之降低，当盐浓度≤0.3mol/l时几乎不溶，这时与CTAB结合的DNP就会沉淀出来。
而RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在低盐溶液中溶解度较大[11]。
另外大部分的蛋白质和多糖仍溶于溶液中，所以利用这个原理，我们不仅能分离DNP和RNP这两种核蛋白，还能将大部分的蛋白质和多糖除去，得到DNA粗提物。
再经过进一步的纯化,便可提取出高质量的DNA。
4.2几种主要试剂的作用与对比
4.2.1十六烷基三甲基溴化铵（cetyltriethlammoninumbromide,CTAB）是一种去污剂，它能与核酸形成复合物，并在低盐溶液中将DNP沉淀出来，CTAB在15℃以下会沉淀，因此应先将CTAB抽提液置于65℃水浴锅中预热[12];
4.2.2乙二胺四乙酸（EDTA）：
能螯合大多数核酸酶所需要的辅助因子—镁离子;
4.2.3β-巯基乙醇：
防止酚类氧化（酚类化合物能与DNA共价结合，使DNA带棕色或褐色）;
4.2.4聚乙烯吡咯烷烔（PVP）：
与酚类结合;
4.2.5氯仿/异戊醇（24/1）：
去除蛋白质。
其中氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。
异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的泡沫[13];
4.2.6异丙醇：
沉淀核酸。
沉淀DNA时用异丙醇而不用乙醇，因为用异丙醇沉淀DNA时只需加入0.6体积的容量，而且小分子量DNA都能沉淀下来，用乙醇沉淀DNA时，只能有选择地沉淀大分子量DNA[14]。
要注意的是异丙醇不易挥发，最好用80%的乙醇多洗几次。
4.3方法的探索及改进
针对常规CTAB法出现的问题所作的探索和采取的措施：
4.3.1在CTAB提取缓冲液中加入2%（W/V）PVP（聚乙烯吡咯烷烔）：
实验发现在探索实验中经80%乙醇洗涤干燥后的沉淀仍略带褐色，说明沉淀中仍然含有酚类杂质，而CTAB提取缓冲液中已经加入了体积比高达4%的β-巯基乙醇，CTAB沉淀液中也加入了2%（V/V）的的β-巯基乙醇，说明仅仅靠β-巯基乙醇防止酚类氧化是不够的，还得用聚乙烯吡咯烷烔与之结合并除去酚类杂质；
4.3.2使用氯仿/异戊醇（24：
1），而不使用酚/氯仿/异戊醇（25:
24:
1）抽提：
原因之一是在使用酚/氯仿/异戊醇（25:
24:
1）抽提时，由于所加试剂体积大于实验室5
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