化学发光免疫法检测AFP的空白限检出限和定量检测限的建立与Word文档格式.docx
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为2．20ng
/ml，FS
/ml。
结论用常规方法建立的LLD
为1．00ng
/ml，
Bayer
Centaur
240化学发光免疫系统检测AFP
的分析灵敏度得到验证确认；
实验室在验证仪仪器说明书声明的灵敏度性能，
器声明的LoB
时，应同时建立检测系统的LoD
，以便为临床提供更为可靠的检验结果。
两种评价方案均具有实用性，国内实验室可
视具体情况选择不同的评价方案。
关键词：
甲胎蛋白；
方法学评价；
分析灵敏度中图
分类号：
R446
文献标识码：
A
［1］
根据《医疗机构临床实验室管理办法》和医
时取不同浓度的低浓度样品各1支，待溶解混匀后与常规标本同等条件下进行
测定。
1．5
常规方法
4-5］参照文献［确定AFP
的LLD
、
和FS
。
空白样品作10次批内重复测定，低浓度样品作日间重复测定，共10d
，记录光强度值（RLUs
1．6
EP17-A
文件［3］确定AFP
参照EP17-LoD
和LoQ
空白样品进行60次测定，的LoB
、每日1批，每批重复检测12次，共5d
，记录浓度值。
6个浓度的低浓度样品作日间重复测定，每日2批，每批共5d
相隔时间＞2h
，1．7
统计方法
LLD
、BLD
和FS
的统计方法参照文献空白限（LoB
）
按国际标准化组织（ISO
）的
1．7．1［4-5］。
1．7．2
建议，设定Ⅰ类错误和Ⅱ类错误水平均为5%（α=β=5%），若空白值呈正态分布，按
下式计算空白限：
LoB
=μB
+1．645σB
（式中μB
和σB
分别为空白样品检测值的均值和标准差）。
若空白值呈非正态分布，则用非参数方法
估计第95百分位数（Pct
B
）的N
（ρ/100）+0．5］即：
=Pct
100-α，即：
LoB
=在［值，
0．95ˑ
N
+0．5］位置的结果。
位置的结果=在［
注：
式中N
是重复检测的次数，ρ是百分位数。
1．7．3
检出限（LoD
若低浓度样品检测结果呈
学实验室认可的要求
［2］
，临床实验室必须对检测系
统的主要分析性能进行验证确认或分析评价，证实其能够满足预期的质量要求
后才能用于常规检测。
分析灵敏度是检测系统的主要性能指标之一，本文参考美国
临床和实验室标准化协会（CLSI
）发布的《检出限和定量检测限的确定方案》，建立化学发光免疫法检测AFP
的空白限（LoB
）和定量检测限（LoQ
），并与传统方法比较，现报道如下。
11．1
材料与方法检测系统
240化学发光免疫
［4-5］
［3］
建立的检测低
限（LLD
）、生物检测限（BLD
）进行
分析仪及原装试剂、校准品（批号为CD54L
、CD54H
）和质控品（批号为9827301和9827302）。
1．21．3
空白样品低浓度样品
用Bayer
原装配套AFP
稀释液作用Bayer
稀释液
为空白样品。
对AFP
浓度为5．50ng
/ml的新鲜血清作系列稀释，配制成一系列低浓度的AFP
样品，其理论浓度（ng
/ml）分别为0（空白）、1．10、1．65、2．20、3．30、4．40、5．50，介于预期检测限浓度1
4倍。
1．4
样品保存
将配制好的系列低浓度样品分装
于带盖一次性试管内于－20ħ
冰箱保存，每次测定
*
基金项目：
广东省医学科研基金项目（2009A2009763），中山市科技计划项目（20
091A038）。
1976年生，作者简介：
温冬梅，女，副主任技师，学士，主要从事临床生物化学检
验和实验室管理工作。
E-mail
：
zxm0760@163．com
通讯作者：
张秀明，主任技师，硕士研究生导师，
470·
正态分布，计算多个低浓度样品的综合标准差（SDs
）：
SD
s
=
1SD
1+n
2SD
2+n
3SD
3+……+n
m
n
m
和第58个观察值的均数。
将60个空白检测值由小第57和第58位置均为0．8到大
排序（见表2），ng
/ml，故LoB
=0．8ng
表2
秩号
5152535455
2……n
代表不同低浓度样品的自由度。
式中n
1，
LoD
=LoB
+C
βSD
S
［C
β是标准正态分布第95百分C
β=1．645/（1－1/4f
），f
是SDs
位数值的校正因子，。
的自由度］
若低浓度样品检测结果不呈正态分布，或不能按非参数方法估计LoD
，计算公式转化为正态分布，
如下：
+D
，β（D
S
，β是低浓度样品测定中位数和第5个百分位数值的间距）。
1．7．4
定量检测限（LoQ
依据临床要求和室间
质量评价的允许误差，设定本实验室AFP
的总误差在不考虑分析偏差的条件下，总误差目标为20%，
=2CV
，如果低浓度样品的CV
≤1/2总误差，则LoQ
=LoD
22．1
检测低限（LLD
批次
12345678910
60个空白值中最高的10个值（ng
/ml）
空白值0．50．60．60．60．8
秩号5657585960
空白值0．80．80．80．81．0
2．5检出限（LoD
）低浓度样品测定结果见表3。
60个低浓度样品检测结果呈非正态分布，使用非参D
，数程序估计LoD
，即：
，β，β是低浓度样品测定值中位数和低浓度样品的第5个百分位数值的间距，低浓度
样品中位数=3．20，第5百分位数的值=（60ˑ
0．05+0．5）=第3．5秩号的值=1．40，D
，故LoD
+β=3．20－1．40=1．80，D
，β=0．80+1．80=2．60ng
表3
1．101．601．701．302．102．302．501．401．202．601．50
低浓度AFP
样品测定结果（ng
1．651．802．101．602．801．801．902．901．402．201．90
2．202．703．002．502．803．202．902．501．802．503．30
3．303．503．904．103．904．403．903．203．203．703．70
4．904．205．104．804．604．904．604．304．305．204．90
5．506．205．505．505．705．905．805．205．905．905．50
空白样品10次重复测定光
空白为1997．9，强度值（RLUs
）的均值珔标准差（s
）为
126，按99．7%的可信限，空白样品RLUs
的3s
为378，5．50ng
/ml检测限样本的RLUs
为2088，RLUs
为378时相当于：
=（378/2088）ˑ
5．50=1．00ng
/ml，所以本法的LLD
为1．00ng
2．2
生物检测限（BLD
2．20ng
/ml实验样品的
RLUs
减3s
后RLUs
为384，刚大于378，故本法的生物检测限为2．20ng
结果见表1。
表1
低浓度样品AFP
（ng
/ml）测定的RLUs
结果及生物检测限
1．10
RLUs
ʃ
X
空白s
CV
（%）x
－3s
珋
58820534．9－27
1．6569917825．5165
2．2090917519．3384
3．30133214911．2885
4．4017431347．71342
5．5020881115．31754
2．6定量检测限（LoQ
）本实验室依据临床需求
及权威机构规定的分析质量要求设定化学发光免疫法检测AFP
的总误差目标为20%，在不考虑分析偏允许总误差（TEa
）=2CV
，即CV
=1/差的情况下，
2TEa
AFP
浓度在3．30ng
/ml时检测的日间CV
为9．56%，刚好小于10%，符合质量目标要求，因此LoQ
=3．30ng
/ml，结果见表4。
表4
化学发光法测定低浓度AFP
样品（ng
/ml）的日间CV
x
/ml）珋
/ml）CV
（%）
1．820．4926．78
1．652．040．4622．48
2．202．720．4115．05
3．303．750．369．56
4．904．670．306．50
5．505．710．274．79
2．3功能灵敏度（FS
）以日间CV
为20%时对应
/ml浓度低浓度样品具有的平均浓度为FS
，
的实验样品日间CV
为19．3%，最接近20%，故FS
为2．20ng
2．4
空白限（LoB
空白样品的检测结果呈非正
态分布，故用非参数程序估计LoB
，即估计第95百LoB
=［N
B
（ρ/100）+0．5］=分位数（Pct
）的值，
［60ˑ
（95/100）+0．5］=57．5位置的结果，即第57
松柏
3讨论
Petersen
、Gregori
Casals
、国内外相关报道中，郑
［4-8］
等分别对化学发光免疫检测系统检测不同
471·
进行确定或验证，项目的LLD
、本实验以AFP
为例对LLD
、BLD
的研究结果与文献［4-5］报道的结果基本一致，证实了厂商声明的性能。
本实验结果显示，用EP17-为0．8ng
/ml，低于仪器说明书声明的灵敏度1．3ng
即该检测系统在符合质量要求下能可靠地检出AFP
的最低实际浓度为3．30ng
本实验室用该检测系统检测AFP
结果报告时，若AFP
结果低于0．8“分析物未检出，；
ng
/ml，则报告浓度小于0．8ng
/ml”若AFP
检测结果高于0．8ng
/ml小于2．60ng
/ml，“有分析物检出，则报告但不能准确定量，浓度小于2．60ng
/ml”；
若AFP
检测结果高于3．30ng
/ml，则直接报告检测结果。
临床医生可放心使用浓度高于3．30ng
/ml的AFP
结果。
两种灵敏度评价方法主要有以下区别
［9］
能符合临床的质量需求。
（5）目前所有的试剂厂商在试剂说明书中只提供了按
常规方法检测得出的检测低限，没有提供必须满足实验室质量要求的定量检测限以
及在接近定量检测限处的不确定度，厂商A
文件对检测系统所有检验项目的检若参照EP17-
实验数据的收集和测低限和定量检测限进行确定，
统计学处理科学严谨，可以方便临床实验室通过简单的程序对其建立的检测限
值及不确定度进行验证和确认。
文件建立LoD
是综上所述，用EP17-
评价化学发光免疫检测系统灵敏度性能的标准方法，可更好地为临床提供准确可靠
的AFP
低浓度结果，为临床诊断、治疗监测提供重要信息，但成本较高。
常规方法操作简便
、成本较低，若数据呈正态分布，也具有较高的应用价值。
国内实验室可视具体情况
选择不同的评价方案。
4
参考文献
（1）
常规方法确定化学发光免疫检测系统检测AFP
的空白样品检测数为10次，低浓度A
方案要求确定LoD
的样品检测数为10次。
EP17-
最小检测数为60次，样品重复检测的次数多，估计的LoD
不确定度较小，结果更可靠。
（2）参照常规方法确定化学发光免疫检测系统检测AFP
、FS
均使用光强度值（RLUs
）来计算，但目前实验室部份仪器存在局限性，即只能报告分析物的浓度，而没有原
始的分析信号。
所以常规方法不适用于实验室对所有仪器的灵敏度进行评价。
参照E
P17-A
文件进行化学发光免疫分析系统检测AFP
，的LoB
、直接使用检测出的分析物浓度进行计算，符合实验室的实际情况，统计分析输入检
测数据时简便易行。
（3）常规方法对灵敏度性能评价均假设实验数据呈正态分布，使
用参数的程序进行估计，但实际中大部份实验数据均呈非正态分布，EP17-A
方案可以弥补常规方法的不足，可根据实验LoD
数据分布选择参数或以非参数程序确定LoB
、（4）常规方法确定生物检测限只是考虑了样品单次检测的信号有95%或99%的可能
性，这样的低值结A
方案考虑果有很大误差，影响了临床应用；
了分析物在低水平处的偏倚与不精密度，以检验的充分保证了低浓度检测结果允许
误差来估计LoQ
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2008：
161-191．社，
（02-08，06-06）收稿日期：
2010-修回日期：
2010-
（本文编辑：
陈维忠）
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