年产110吨肝素酶发酵车间工艺设计.docx

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年产110吨肝素酶发酵车间工艺设计

年产110吨肝素酶发酵车间工艺设计

摘要

肝素酶指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶,被用于清除血液中的肝素,测定肝素的结构,以及抗肿瘤等医学方面的研究。

国外对肝素酶的研究已有40多年历史,涵盖菌种筛选、发酵产酶、分离纯化、克隆表达等领域。

我国起步很晚,目前仅见中科院（北京）微生物研究所和四川大学有关于肝素酶研究的报道。

目前世界上研究最多、最深入的肝素酶仍然由肝素黄杆菌发酵生产而来。

本文通过肝素酶发酵工艺的研究，包括灭菌工艺研究、提取工艺的研究、浓缩和干燥工艺研究及成型工艺研究，将其研制成工艺切实可行、质量稳定可控的酶制剂。

并对肝素酶制剂车间生产工艺进行研究，对工艺流程、物料衡算、热量衡算、车间布置、管道布置、三废处理、设备造型等关键工艺进行设计，为肝素酶车间工艺的设计提供依据。

关键词：

肝素酶；车间布置；工艺流程图

Abstract

InthesepiecesisinundertheguidanceofTCMtheory,combinedwithclinicaldoctorstheapplicationandselectedclinicalexperienceformanyyears,hasqingrejiedu,spleenandstomach,invigoratethecirculationofbulge,clinicallyusedforchronicgastritis,gastriculcer,accompaniedbyintestinalmetaplasiaatypicalsymptoms.Hisownbythese,spreadinghedyotisherb,rhizomacoptidis,etcoftenherbs,ofwhichoneoftheseforhisowngentlemanmedicine,therefore,intheseextractiontechnologyonthebasisoftheexperimentalresearch,theapplicationformofhisownfromthetraditionalone,developedintotakingconvenientoralsolidpreparation,changeonecarryinconvenience,shortcomingsandsoonperishable.Inthisarticle,throughthesepiecesofresearchofpreparationprocess,includingcrushingandsterilizationtechnologyresearch,theextractionprocessofstudy,concentrationanddryingprocessandmoldingprocessresearch,todevelopitintopracticaltechnology,stablequalitycontroloftraditionalChinesemedicinecompoundpreparations.Andinthesepiecestabletworkshopproductionprocess,theprocessflow,materialbalance,heatbalance,workshoplayout,pipinglayout,"threewastes"treatment,equipmentdesignonthekeytechnologysuchasmodelling,providethebasisforthesepiecesworkshopprocessdesign.

Keywords：

Heparinase.Plantlayout;Processflowdiagram

1绪论

1.1概述

1.1.1肝素酶简介

肝素酶是一类能降解肝素类物质的裂解酶。

在真核生物中，肝素酶通过水解硫酸乙酸肝素蛋白聚糖（HSPGs）的肝素类侧链破坏细胞外基质（ECM）和基底膜（BM）的基本结构，释放并激活连接在肝素类侧链上的活性物质，与血管生成、肿瘤转移、炎症等病理过程密切相关w。

原核生物肝素酶目前主要来源于肝素黄杆菌（Flavobacteriumheparinum），在制备低分子肝素（LMWHs）、消除体外循环中的肝素抗凝剂、确定肝素精确结构等方面有着重要的用途。

但是，肝素酶稳定性差、不易提纯，因而价格昂贵，限制了其在医药工业领域的广泛应用。

因此，研究和了解肝素酶的结构、性质和生物学特性，对优化肝素酶的工业生产，拓宽肝素酶的应用领域有着重要的意义。

1.1.2肝素酶的分类及结构

（1）分类

肝素酶最初是从肝素黄杆菌（Flavobacteriumheparinum）中被发现和分离的。

肝素黄杆菌为一类来自土壤的革兰阴性菌，目前已经从中分离纯化得到3种肝素酶:

肝素酶I（HeparinaseI}EC4.2.2.7）,肝素酶II（HeparinaseII，无酶编号）和肝素酶III（HeparinaseIII.EC4.2.2.8）03种肝素酶的主要区别在于相对分子质量（}>、电荷性质及底物特异性的不同。

肝素酶I，hfr43.8kD，等电点9.3，能够特异性的切割肝素类分子中6SG1cNS（1-}4）2SIdoA之间的连接键;肝素酶III}M}73kD，等电点约为10，能够特异性的切割硫酸乙酞肝素类分子中G1cNS/G1cNAc（1-4）G1cA之间连接键。

肝素酶II是3种肝素酶中分子量最大（84.5kD）和底物选择性最宽的一个，等电点约为8.9，对肝素类和硫酸乙酞肝素类连接位点均有切割作用。

（2）序列

通过DNA序列分析表明，3种肝素酶是完全不同的基因产物。

肝素酶I,II和III的基因分别含有1152bp}2316by和1977by的开放读码框架，编码具有384,772和659个氨基酸序列的蛋白前体，前体表达后在氨基肤酶的作用下发生Edman降解，从A1a21-G1n22,Ser25-G1n26和A1a24-G1n25处分别切去21,25和24个氨基端前导肤序列，形成成熟的肝素酶I、II和III。

（3）糖基化

1.2.2糖基化原核生物的自身蛋白发生糖基化的现象是比较少见的，但由肝素黄杆菌分离得到的5种多糖裂解酶（另外两种是软骨素酶AC和软骨素酶B）中只有肝素酶III不存在糖基化位点。

肝素酶I糖基化位点在Ser39，连接一个分子量约1.1kDa的糖链hl，序列为Gal-S（1-4）[Gal-a（1-3）]（2-0-Me）Fuc-}（1-4）Xyl-S（1-4）G1cUA-a（1-2）[Rha-a（1-4）]Man-a（1-0）Ser，肝素酶II糖基化发生在Thr134，连接一个序列为Man-（Rha）-G1cUA-Xyl的四糖。

（3）催化区域

酶与底物的作用机制与酶的结构尤其是高级结构密切相关，目前关于3种肝素酶的二级和高级结构还不清楚。

Sasisekharan实验室对其活性中心及底物结合位点作了大量的研究，并对其催化区域进行了考察，找到了一些维持酶催化活性所必需的氨基酸。

肝素酶I中处于高度阳电荷环境中的Cy:

;135为其活性位点，附近含有两个阳电荷簇（Phe197}Asp204和G1u207`Asp212）具备Cardin-Weintraub肝素结合共有序列，阳电荷簇中的His203对于肝素酶I的催化活性起到关键作用，而Lys199可能通过稳定底物肝素糖醛酸C-6位的阴离子而直接参与催化反应，同时能够稳定Cys135的疏基而起到协同催化作用.，因此可以推测Cys135,His203和Lys199共同组成了肝素酶I的催化区域，而阳电荷残基Lys198和Lys132对维持催化必需的微环境起到了重要作用。

另有研究表明，肝素酶I的活性中心需要一个强的还l系环境，因此加入抗氧化剂（如DTT）有利于提高肝素酶I的活性。

肝素酶II中Tyr257,His238,His451和Ilis579残基对酶的催化活性至关重要，但具体催化机制有待于进一步阐明‘}l。

在肝素酶III中，His295和His510是维持活性的必需氨基酸。

（4）钙结合位点

在肝素酶I和III中，钙离子对维持酶的活性起到了重要的作用.肝素酶I中存在两个钙结合基序CB-1和CB-2（Glu207"Val219;Val373"Ala384），定向突变显示CB-1,CB-2通过不同的作用机制在维持肝素酶I的活性方面都发挥了重要作用。

CB-1主要通过影响酶与钙的结合而影响酶的活性，相对于影响钙的结合CB-2更多地通过其它复杂机制影响酶的活性。

在肝素酶III中也同样存在两个钙结合基序（Leu390"G1y405;Arg576"Asn591），钙离子可能是通过与底物的特异性区域结合而改变其构象使其更适合与酶结合，或者钙、底物和酶结合成一个三元络合物而发挥作用.但在肝素酶II中不存在任何的钙结合共有序列，因此钙离子对肝素酶n来说不但不能激活反而抑制酶的活性。

（5）蛋白结构

根据3种肝素酶的序列，肝素酶I被列入多糖裂解酶家族PL13，肝素酶m被列入PL12,而肝素酶II由于其独特的基本序列还缺少有效的结构数据将其分类.Shaya等L47通过分析肝素酶II的晶体结构证明，肝素酶II蛋白有三个区域组成:

茫末端区（Gln26}Arg356;14个。

螺旋），中央区（Asp357}Asn676;16个p折叠）和C-末端区（Thr677}Arg772;9个p折叠），类似于PL8家族软骨素裂解酶AC和透明质酸裂解酶，不同的是肝素酶II以稳定的非对称的同二聚体形式存在，两个活性位点各自分居在两个单体上，其中央区存在一个Zn2+离子，对维持两个位点的结构稳定起重要作用.目前关于肝素酶I和III的立体结构尚未见文献报道。

1.1.3肝素酶的稳定性

肝素酶的稳定性较差，这一缺点是造成目前尚没有好的办法来获得活性和产量均较好的肝素酶的主要原因。

肝素酶I以液体形式存放在4'C环境下，在很短的时间内活性即降低为原来的50%，而经过一次冻融、一次冻干其活性只能保持为原来的45%和25%}ZJ.通常情况下，得到纯化的肝素酶需要4~5步的操作，而在这个过程中用目前的制备方法酶的活性损失巨大，产率很难超过10%oMa等通过在发酵中添加氯化钙的方法将活性酶的产率提高到17.8%，并且发现氛化钙可以作为肝素酶I的稳定剂，在4'C环境下向酶液中添加1mmol·L-'氯化钙2天后活性保持了80%，5天后仍能保持到55%;随着氛化钙加入量的增大酶稳定性进一步提高，加入100mmo1"L'氯化钙2天内未见酶活性降低.但在冻融条件下，需要较高的浓度才能达到稳定的效果.钞亚鹏等尝试了用固定化的方法来增加肝素酶的稳定性，实验表明将肝素酶固定于聚酷载体上，基本上保持了游离酶的理化性质和催化特性，酶的使用半衰期延长了4.4倍.有报道指出向肝素酶中添加牛血清蛋白（BSA）和乳糖也可以增加酶的稳定性。

1.1.4肝素酶的应用

（1）生产低分子肝素

低分子肝素是从普通肝素中分离得到低分子量组分，或裂解肝素产生的片段，是新一代肝素类抗血栓药物，较肝素来说其具有生物利用度高、体内半衰期长、出血倾向小、口服易吸收等特点。

目前工业生.产低分子肝素的方法主要是化学降解和酶降解法，虽然化学降解法工艺流程较简单，但裂解过程中加入.的强氧化剂等会与肝素中的硫酸基团作用而引起肝素抗凝活性的降低，也破坏肝素的结构，而肝素酶降解法由于其温和的反应条件、不引起肝素结构的破坏、无毒性、易实现生产连续化而越来越得到人们的关注。

（2）体外循环中消除肝素

体外循环是治疗许多心脏疾病的外科技术手段，为了防止插入心脏或血管的人工管道引起血凝和形成血栓导致器官栓塞，常常在手术中用肝素调整血液的凝固功能。

体外循环结束后，需要用鱼精蛋白来中和加入的肝素，但鱼精蛋白引起的毒性反应包括低血压、过敏反应、肺水肿、血小板凝集等日益引起医学工作者的重视，而肝素酶I可以在10min内中和肝素，因此可以考虑用肝素酶I代替鱼精蛋白作为肝素的中和剂。

但Stafford-Smith等研究表明，肝素酶I逆转冠脉搭桥术后肝素的抗凝作用并不优于鱼精蛋白，有关应用需要进一步的深入研究。

（3）研究肝素的精确结构和低聚寡糖活性筛选

肝素的结构非常复杂，目前对其详细结构研究仍不透彻。

通过控制不同的肝素酶解条件，将肝素降解成大小不等的寡糖片断，通过分析寡糖片段，进一步揭示肝素的精确结构。

同时可以研究不同大小塞糖的构效关系，进一步筛选具有生物活性的化合物。

（4）药用研究

由于肝素酶的多糖裂解特性，其在医药研发领域也有着重要意义。

Daud等的研究指出，肝素酶I能够有效地将戊多糖分解成双糖和三糖片断，因此可以作为戊多糖过剂量时的中和剂来使用。

肝素酶III可以从细胞表面及细胞外基质中选择性的切割硫酸乙酞蛋白聚糖HSPGs}HSPGs作为P-和L-选择素以及促炎症介质如IL-8的结合位点，从而肝素酶III可以可逆性地消除这些结合位点和炎症介质，通过减少白细胞波动、猫附、外渗来减轻局部缺血再灌注中对组织的损伤。

1.2课题研究的目的意义

酶制剂是一种生态型高效催化剂，具有高效、安全、节能、生态和环保等特点，能够有效带动相关领域技术水平的提高，对应用产业开发新产品，提高质量、节能降耗、保护环境具有重要意义，产生了巨大的社会效益和经济效益。

酶制剂产业已经成为生物技术领域的前卫产业和21世纪最有希望的新兴产业之一。

国家十一五期间已将酶制剂列为重点发展的领域，将投资几十亿到该产业，建立生产、研发、出口、检测、菌种保藏基地，使中国成为世界酶制剂生产基地和研发基地，引领世界酶制剂市场。

而酶制剂中的肝素酶主要应用领域为酒精、白酒、淀粉糖、味精等行业，目前我国酒精年生产能力为897万吨，年需万单位肝素酶242000吨，白酒企业年需肝素酶20000吨，淀粉糖和味精企业需求25000吨左右，而国内现有企业肝素酶产量才207000吨，远远不能满足市场需求。

但是酒精企业的扩建，造成粮食短期供应紧张，酒精企业有297万吨产量未能达产，少消耗肝素酶80000吨，因此缓解了市场供求矛盾。

随着世界能源的日趋紧张，世界各国都在大力发展可再生能源，因此，以后肝素酶的生产将会有很大的空间。

本设计利用肝素黄杆菌，采用机械搅拌通风罐进行发酵生产，完成年产110吨肝素酶发酵车间工艺设计，通过工艺流程设计、工艺衡算、设备选型和车间布置设计，设计出年产5000吨肝素酶发酵车间，并依据生物工程工厂车间布置原则，对发酵罐车间进行合理布置，绘制了工艺流程图和车间布置图，工艺设计的结果为肝素酶的生产提供一定参考。

1.3课题研究内容、设计方法

本设计任务为年产110吨肝素酶发酵车间工艺设计，根据在药企的生产实习经验，查阅中国药典和相关文献资料，同时参考《医药工业洁净厂房设计规范》、《药品注册管理办法》、《GMP》、《化工工艺设计手册》等多种设计规范，结合所学相关课程知识，以肝素酶的发酵生产工艺流程为主线，分析每个工艺步骤的原理及目的，选择工艺路线，并进行物料衡算、能量衡算、设备选型计算，根据计算结果进行车间设计，绘制带控制点工艺流程图、发酵车间平面布置图和典型设备图，独立完成一定年生产能力肝素酶的发酵车间工艺设计。

1.4设计依据及原则

（1）设计依据

肝素酶是粘多糖硫酸酯类抗凝血药。

肝素酶是由猪或牛的肠粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属粘多糖类物质。

肝素酶的药物性状为白色或类白色的粉末，有引湿性。

具有预防和治疗动、静脉血栓和肺栓塞，人工心肺、腹膜透析或血液透析时作为抗凝血药物，作为溶血栓疗法的维持治疗等作用。

具有非常大的医学和生物学研究价值。

该制药公司地处郑州高新技术产业开发区，位于全国铁路枢纽，交通便捷，适合原料、设备及产品的大物流运输。

（2）设计原则

（a）全面、充分响应招标文件，严格执行技术规范； 

（b）实事求是，施工方案力求经济、适用、可行，有基本的生产及技术力量保证； 

（c）采用项目法组织施工，推行标准化管理工程，做到安全、优质、文明、高效； 

（d）坚持技术创新，推广和应用“四新”成果； 

（e）根据当地相关法律法规编制。

2工艺流程概述

2.1文献报道的合成工艺简述

肝素黄杆菌发酵法目前仍然是肝素酶生产研究的主要方法。

国外对发酵法生产肝素酶的工艺研究较早，近年来关于工艺优化的报道较少。

国内报道主要集中在华东理工大学的一个实验室，该室的马小来等对肝素黄杆菌发酵产肝素酶的条件进行了系列研究.研究表明向培养基中添加碳酸钙和核普均能够促进产酶。

碳酸钙一方面通过调节pH值发挥作用，另一方面分解产生的Ca2+'对产酶有促进作用，而CO2-3能促进菌体生长;添加单种核普会抑制产酶，而复合核普的添加则促进产酶，当4种核昔的添加比例与肝素酶mRNA中4种相应核普酸的比例一致时促进作用最强.他们还利用两步发酵法，将肝素黄杆菌的发酵和对酶的诱导分步进行，提高了肝素的诱导效率，进一步优化了生产工艺。

除肝素黄杆菌外，国外先后发现粪便拟杆菌（Bacteroidesstercoris）、环状芽胞杆菌（Bacilluscirculans）、多形拟杆菌（Bacteroidesthetaiotaomicron）}，等其它一些菌株同样能够产生肝素酶。

高宁国等从土壤中得到两个产酶菌株，分别鉴定为棒杆菌属（Corynebacteriumsp）和鞘胺醇杆菌属（SphinBobacteriumsp）;罗瑶等从土壤中分得一产酶菌株，初步鉴定为枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilis）。

肝素酶I因为其可以特异地裂解肝素而在医药工业方面有较高的应用价值，但由肝素黄杆菌中提取的肝素酶I，由于其产量非常低，且难于从肝素酶n、m的总提取物中分离纯化，导致肝素酶I价格昂贵，限制了其广泛应用。

而依靠基因工程手段直接在细菌中表达出的肝素酶，水溶性差，阻碍了蛋白复性，因此构建能高效表达且易于分离的肝素酶的工程菌株也就成了研究的热点。

早期，Sasisekharan等从肝素黄杆菌中克隆了肝素酶I的基因，并用pET系质粒在大肠杆菌中进行了表达，发现带有肝素酶自身前导肤序列的重组体不能成功表达，切除前导肤序列能表达出水溶性的活性肝素酶，但表达量很低。

后来他们又接入其它经过处理的前导肤序列，表达出的重组肝素酶以不溶于水的包涵体形式存在，经过复性能够得到有活性的酶，但比活力均低于肝素黄杆菌来源肝素酶。

后来有人尝试以融合蛋白形式表达肝素酶，收到了较好的效果，肝素酶融合蛋白逐渐成为近年来研究的焦点。

Shpigel等将肝素酶I（HepA）与纤维素结合蛋白（CBD）在大肠杆菌内一起融合表达，肝素酶仍然以包涵体形式存在，但肝素酶复性后具备了降解肝素和结合纤维素的双重活性，用CBD-HepA一纤维素生物反应器将酶固定化后，通过控制流速可以得到不同分子量大小的肝素低聚糖，且连续操作40h内未见酶活性显著降低。

2.2各步生产流程

（1）酶解

取100根猪小肠为例，绞碎，泵入酶解罐，加水总重量700斤，加入3.5%的盐即700×3.5=24.5斤盐，调PH到9—9.5，使盐溶解，PH稳定在9。

升温到50—52度，停止升温，调PH8.8—9，加酶300克，搅拌1小时补温50—52度，继续保温2小时，开汽升温到85度，静止保温10—15分钟，用100目尼龙布带过滤至清。

（2）吸附

过滤后立即调整盐浓度，每100根过滤液加200斤自来水，降低温度60—65度时盐浓度2点最好，加水后测温度65度，下已处理好的肝素酶提取专用树脂，每100根用1.0—1.3kg，保温搅拌6—8小时，搅拌时间长一些无防。

冬天吸附注意保温，有条件用恒温吸附最好，吸附完毕后，100目尼龙布收集树脂，树脂用热水漂洗至清，沥干。

（3）洗涤

用与树脂2倍量60度热水，加盐度5度，调PH到8.5，将树脂倒入，搅拌洗涤，1个小时沥干。

（4）一次洗脱

用树脂体积等量饱和盐水温度60度，搅拌4—6小时，过滤，收集洗脱盐水。

（5）二次洗脱

树脂用等量24度盐水60度温，搅拌3—4小时过滤，收集洗脱盐水，与第一次合并。

（6）沉淀

  合并两次洗脱液加入85度以上乙醇，边加边搅拌，沉淀12小时以上。

《冬天要加热40度》

（7）提纯

肝素提纯去盐，因酶解肝素，洗脱盐度高，沉淀时有大量盐析出，提纯时要先去盐。

方法是；将肝素酶沥干酒精，按一斤毛肝素酶加6斤水，加温60度，将肝素酶搅拌溶解，在升温到80度，静止10—15分钟用100目尼龙布将杂质去掉，《冬天温度降到50度，夏天温度降到30度》并加酒精到30—40度，沉淀30分钟，将酒精抽出得粗品肝素。

（8）精制

将粗品肝素酶加入重量3倍的水，升温60度，按加水的重量加入2%的盐，将肝素捻溶，立即加入回收酒精，酒精度为30度，沉淀30分钟，最多不超1小时，抽出酒精，肝素酶进行三次脱水，捻成颗粒状，越硬越好.甩离心烘干即可，效价为80—100之间。

2.4工艺流程框图

肝素酶生产工艺流程图如图2-1所示，

图2-1肝素酶生产工艺注流程图

2.5工艺条件及生产安排

（1）生产规模：

110吨。

（2）包装形式：

酶制剂塑料瓶和铝塑

（3）年工作日：

220天；1天2班：

每班8h。

3物料衡算

3.1衡算基准和设计基础数据

（1）计算是根据物质平衡原理。

（2）包括产品的原辅料、中间产品、副产品、产品和包装材料等的计算。

一般按生产品种、规格、包装形式及班产量进行计算。

（3）通过物料衡算可确定各品种主要原辅料的采购量、运输量和仓库储存量；包装材料的需要量、存储量，并为确定生产过程中所需设备的配置、劳动定员、仓库面积，确定生产过程中的供排水、蒸汽、各类能耗的需要量以及设备计算、管路设计提供计算依据。

（4）首先按规定的工艺绘制物料衡算示意图，用箭头标出各物料的进出方向、数量、组成及温度、压力等条件，绘出物料流向示意图。

然后收集有关生产规模、生产班次及班产量等数据。

（5）根据生产剂型和生产量对每天生产的药物进行物料衡算。

选定计算基准。

3.2年产110吨肝素酶发酵车间物料衡算

根据质量守恒定律：

∑GI=∑G0+GA

在本生产设计中，每1111根猪小肠可以生产1kg肝素酶，每根小肠需4—6g肝素酶专用酶，每100根小肠加1.0—1.3kg树脂，丙酮和乙醇的回收率按95%，全年按220个工作日，然后进行计算：

一年所需猪小肠：

1111*5000=5555000根

每天所需猪小肠：

5555000根/220天=126250根/天

每天所需专用酶：

126250*5g=631250g=631.25kg

每天所需要树脂：

（222200/100）*1.2kg=2666.4kg

4热量衡算

4.1热量衡算的意义

在车间设计中进行热量衡算的目的：

为保证顺利进行成型加工，确定加热所需的热量，并核算加算电功率。

一方面作为选择设备的依据，另一方面作为计算耗电量的依据。

确定冷却需排出热量，一方面可计算出冷却介质的消耗量，另一方面作为选择换热设备的依据。

4.2对于每一个单元操作进行能量衡算

肝素酶制剂生产过程更多采用对单元设备的热