PCR和RTPCR710章Word下载.docx
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除了酶，高浓度的dNTP或镁离子会降低忠实性。
将dNTP的浓度从200μM降低到25-50μM可以增加精确度。
如果四种核苷的浓度不同，忠实性会受影响。
进行较少的PCR循环也会有助于增加忠实性，因为增加循环数目和产物长度就会增加突变可能性。
第八章其他需要考虑的事情
扩增长目的片段
当扩增大于5kb的目的片段时，可以使用用于超长PCR的酶或酶混合物以获得最佳产量（参见第十三章，PCR聚合酶的比较和图24）。
TaqDNA聚合酶并不能有效扩增较长目的片段（大于5kb），可能是因为其缺少3'
-5'
外切核酸酶活性，不能纠正dNTP错误掺入。
错误配对的延伸几率大大降低，减少了较长产物的产量。
外切核酸酶活性的热稳定DNA聚合酶混合，可以扩增最高为30kb的目的片段。
PlatunumPfxDNA聚合酶（带有3'
外切核酸酶活性）也可以扩增较长产物（≤12kb）。
除了选用正确的热稳定DNA聚合酶，较长产物的扩增还需要改变标准步骤的延伸时间、变性时间、缓冲液pH。
按1分钟/kb增加延伸时间使聚合酶完成合成。
一般对于有效的超长PCR，延伸温度会低至68℃。
因为延伸时间较长，对于20kb的模板高达20分钟，所有使用较高起始pH的缓冲液。
如果pH将至低于pH7.0，DNA会脱嘌呤。
为了防止模板损伤，在每个循环将94℃变性时间减少到30秒或更短，将在扩增前温度增加到94℃变性温度的时间限制为小于等于1分钟。
引物使用标准方法所使用的同样的方法设计，使用18到24个碱基得到较好的产量。
防止残余（Carry-over）污染
PCR易受污染的影响，因为它是一种敏感的扩增技术。
小量的外源DNA污染可以与目的模板一块被扩增。
当前一次扩增产物用来进行新的扩增反应时，会发生共同来源的污染。
这称之为残余污染。
从其他样品中纯化的DNA或克隆的DNA也会是污染源。
可以在PCR过程中使用良好的实验步骤减少残余污染。
使用抗气雾剂移液管的阻止气雾剂进入eppendorf管内。
为PCR样品配制和扩增后分析设计隔离的区域，在准备新反应前更换手套。
总是使用不含有模板的阴性对照检测污染。
使用预先混合的反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。
一种防止残余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）。
这种酶（也称为尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG）移除DNA中的尿嘧啶。
在扩增过程中将脱氧尿嘧啶替换为胸腺嘧啶使得可以把前面的扩增产物同模板DNA区分开来。
因为前面的扩增产物对UDG敏感，所有可以在PCR前对新配制的反应用UDG处理以破坏残余产物。
PCR产物纯化
残余反应成分包括抑制克隆，测序和标记反应的引物，核苷和热稳定聚合酶。
因此，一般在进一步操作之前需要纯化PCR产物。
包括多次酚：
氯仿抽提及随后的PEG沉淀或异丙醇沉淀的纯化步骤虽然有效，但是耗费时间，且会丢失产物。
MaligenRapidPCRPurificationSystem在10分钟内从反应成分中纯化PCR产物。
它对80bp到10kb很大范围的PCR片段都有效，有效回收95％的原有样品（图26）。
图26.扩增后PCR片段的纯化
使用1.2μg引物（泳道1）或3.5μg引物（泳道2）。
峰值包含约1μg扩增产物的完整PCR体系。
引物36到40碱基长。
将峰值反应纯化，对纯化前（泳道A）和纯化后（泳道B）的洗脱液水相使用琼脂糖凝胶电泳分析。
部分PCR产物可能需要通过凝胶电泳，和影响克隆和测序的非特异性PCR产物分离纯化出来。
使用MaligenGelExtractionSystem将目的产物从琼脂糖中纯化出来，这是一种基于硅土的，从凝胶中快速纯化DNA片段的技术。
第九章PCR应用
多重PCR
在多重PCR中，同时使用多对引物扩增几个不同的位点。
这种复杂的PCR一般会导致低产量，而且需要高浓度的Mg2+。
如果没有正确优化，容易出现假阳性。
PlatinumTaqDNA聚合酶经改良，可以适应广谱浓度的Mg2+，从而提高多组反应成功的可能性（图27）。
图27.对于多重PCR，Platinum®
TaqDNA聚合酶提供了更好的灵敏度
使用TaqDNA聚合（A组）酶或PlatinumTaqDNA聚合酶（B组），利用5个不同的引物对，从人基因组DNA对dystrophin基因进行多重PCR。
使用所示引物和模板浓度，从人基因组DNA中得到268bp到547bp范围的扩增产物。
使用双核苷重复标记物确定基因型
确定扩增的双核苷重复区域的大小较难，因为TaqDNA聚合酶经常在PCR产物中加入非模板核苷。
在扩增反应中包含一个多余核苷的产物部分决定于序列和引物，并且差异很大。
但PlatinumGenoTYPETspDNA聚合酶表现出最小的非模板核苷掺入，有助于增加等位基因长度决定的精确度（图28），仅需要用PlatinumGenoTYPETspDNA聚合酶替换在这些反应中所使用的TaqDNA聚合酶就可以。
图28.DNA聚合酶对双核苷重复标记进行基因定型的比较
使用TaqDNA聚合酶或PlatinumGenoTYPEDNA聚合酶对拟南芥nga106位点的扩增结果
检查多态性的工具
AFLP技术是一种用来对植物和微生物基因组DNA进行指纹分析的技术（图29）。
RFLP、AP-PCR和RAPD也是同样的DNA指纹分析技术。
RFLP是一种基于杂交的技术，其费时费力并需要大量基因组DNA。
AP-PCR和RAPD是较快的，基于PCR的方法，但是都对反应条件很敏感，从而影响可重复性。
图29.AFLP分析系统图解
AFLP技术结合了RFLP的可信性和基于PCR的指纹分析技术的简便性，从而使其成为一种易于获取信箱的方法。
用AFLP技术得到的指纹分析可以作为鉴定DNA样品或分析样品间相似性的工具（图30）。
图30.典型的AFLP指纹分析
使用AFLP系统Ⅰ和EcoRⅠ+ACC及Mse+CAA选择性引物对大豆生态型多态性进行分析。
泳道1到9分别为生态型：
Holladay;
Morgan;
Hytest;
Essex;
Bass;
T135;
P88;
P188788;
P83;
P183495;
P90;
P190763。
很多参数会影响AFLP的结果，包括引物中选择性核苷的数目。
当选择性核苷增加时，扩增条带的数目就会减少。
较大的基因组需要较多的选择性核苷，以扩增恰当数量的DNA，因为酶切较大的基因组DNA会得到更多的限制性酶切片段。
模板质量也会影响AFLP结果。
模板质量差会抑制限制性内切酶，从而导致不完全酶切而在凝胶上看到很少的扩增条带。
AFLP可以适应模板浓度的变化，使用100ng到5μg的DNA之间观察不到差异。
高产量，特异和灵活的定量PCR试剂体系
Platium®
QuantitativePCRSuperMix-UDG（qPCR）同竞争对手的定量PCR体系相比提供了更优异的结果。
使用这种产品，您可以在您的PCR中得到更好特异性和更高的灵敏度，同时可以灵活地选择您所喜欢的扩增条件，检测方法和设备。
实时定量PCR是快速增长的PCR方法，它可以精确、可重复地定量起始物质。
QuantitativePCRSuperMix-UDG是一种方便使用的反应混合液，为定量分析进行了优化。
它包含了PCR所必须的成分（如缓冲液，核苷酸，聚合酶）。
只需加入您的模板，扩增引物和荧光标记探针。
您就可以得到实时qPCR所需的特异性和灵活性。
高产量和特异性的扩增
QuantitativePCRSuperMix-UDG提供了强大的PCR扩增，可以使用多个模板组。
所使用的Platium®
TaqDNA聚合酶具有抗体介导的热启动特性。
这极大地降低和消除了错误配对和非特异性扩增，使您得到较高产量，并增加特异性。
整合的UDG（尿苷酸DNA糖基化酶）防止残余污染的能力防止了非模板DNA的扩增，从而降低了假阳性，使结果更可靠
超越竞争者
在产量和灵敏度方面，Platium®
QuantitativePCRSuperMix-UDG都超越了竞争对手。
在ABIPrism®
7700上，Platium®
SuperMix-UDG比UniversalMasterMix的灵敏度高2Ct（阈循环）。
您可以更精确地定量低拷贝的基因，并在较宽的目的浓度范围内检测线性剂量反应（图31）。
图31.使用Platium®
QuantitativePCRSuperMix-UDG得到更高的产量和灵敏度
利用竞争对手的UnviersalPCRMasterMix（蓝点）或Platium®
QuantitativePCRSuperMix-UDG（红点），使用200nM的各种引物和100nMTaqMan®
探针对人类基因组DNA（1pg-1μg）扩增。
在室温下配制反应体系。
在50℃进行UDG保温2min。
PCR反应在95℃10min，50℃2min，然后95℃15s和60℃1min进行50个循环。
高度灵活性
除了灵敏度和特异性外，Platium®
QuantitativePCRSuperMix-UDG在分析设置，检测方法和设备上给你提供了较高的自由度。
使用Platium®
SuperMix-UDG，您可以：
对扩增的不同模板优化镁离子浓度，由于提供了附加的氯化镁，所以您可以方便地配置SuperMix体系。
可以在多种设备上使用，如ABIPrism®
7700,ABIGeneAmp®
5700和Bio-Rad的I-Cycler。
可以利用多种检测方法的优点，包括TaqMan®
探针和MolecularBeacon，您不必局限于特定的试剂盒。
第十章PCR产物克隆
PCR克隆主要有TA克隆法,限制性酶切与连接法，杂交法和近期开发出来的特异性重组法等。
但因为TA克隆法操作最简单，快速和高效的原因，成为Taq聚合酶PCR产物的最佳克隆方法。
TA克隆法由Invitrogen发明，并拥有全球TACloning商标的专利权。
TA克隆方法（OriginalTACloningKit）
利用Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。
Invitrogen公司TA克隆系统和TopoTA克隆系统都提供一个线性含3`-T突出端的载体用于直接高效地连接PCR产物。
系统中也包含感受态细胞和S.O.C培养基,使得实验操作更为简单方便。
所以TA克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需将PCR产物进行优化，不需把PCR产物做平端处理（Invitrogen另有平端载体供高确限度酶克隆）。
不需在PCR扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。
图32TheTACloning®
Concept
TopoTA克隆方法（TopoTACloningKit）
TopoTA克隆原理与TA克隆一样，唯一不同的是TA克隆用的是T4连接酶把PCR片断连接到T载体上，而TopoTACloning用的是DNATopoisomerase。
Topoisomerase的用途一般使用在复制DNA前把超螺旋DNA切割使之解旋后，再连接成线性DNA。
TopoTA克隆即使用Topoisomerase高效连接的特性把含3`A端的PCR扩增片断快速连接到3`T端载体上，整个反应只需五分钟！
一般T4连接酶需过夜才能高效连接。
TopoTA克隆系统提供TopoisomeraseI载体，感受态细胞，SOC培养基等。
1.Add1mlofTOPO®
Cloningvectorto1mloftheTaq-amplifiedPCRproduct
2.Incubatefor5minutesonyourbenchtop
3.TransformOneShot®
CompetentE.coli.
Topo平端克隆方法和长PCR片断克隆法（ZeroBluntTopoPCRCloningKit）（TopoXLPCRCloningKit）
因为越来越多高确限度热稳定酶如Pfx、Pfu被用于PCR扩增，使到PCR后都只是平端产物。
这种平端克隆往往效率低，并且有非特异性背景菌落产生，造成筛选困难。
Topo平端克隆主要改良载体设计，把ccdB（Controlofcelldeath）基因并入到mcs中，如果没有DNA片断插入，ccdB基因则会表达，ccdB基因的表达蛋白，会破坏细菌的DNAgyrase，造成细菌染色体的降解导致细菌死亡。
如果有插入片断，则ccdB基因表达受到阻碍，所以细胞可生长。
这样可以把高背景的缺点改善，节省筛选的时间。
Topo平端克隆与TopoTA方法一样，操作简单快速。
平端PCR克隆方法（ZeroBluntPCRCloningKit）
ZeroBluntPCR克隆乃利用传统T4连接酶方法，但载体和Topo平端的一样，含ccdB基因，所以同样可降低菌落背景，易于筛选。
表10PCR克隆试剂盒的选择
AmplificationEnzymeApplicationofClonedPCRProductLigationMethodProductAdvantagesCat.No.
TaqDNAPolymerase•Sequencing
•Safeguardingsample
•InvitrotranscriptionTOPO®
Cloning（5minutes）TopoisomeraseTOPOTACloning®
Kit•≥95%recombinantsK4500-01
K4550-01
K4560-01
•Blue/whitecolorscreening
TOPOTACloning®
KitDualPromoter•≥95%recombinantsK4600-01
K4650-01
K4660-01
•DualSp6andT7promoterprimersitesforinvitrotranscription
KitforSequencing•≥95%recombinantsK4575-01
•Streamlinedsequenceanalysis
Ligase-mediated（overnight）T4DNAligaseOriginalTACloning®
Kit•≥80%recombinantsK2000-10
K2030-10
OriginalTACloning®
KitDualPromoter•≥80%recombinantsK2050-01
K2060-01
•DualSp6andT7promoter/primerssitesforinvitrotranscription
TOPO®
Cloning（5minutes）TopoisomeraseVarious•FastcloningdirectlyintoanexpressionvectorAlltheTOPOExp.Kits
Proofreadingpolymerase高确限度酶•ExpressionofclonedPCRproductTOPO®
Cloning（5minutes）TopoisomeraseZeroBlunt®
TOPO®
PCRCloningKit•≥95%recombinantsK2800-20
•Positiveselectionresultinginlowbackground
ZeroBlunt®
PCRCloningKitforSequencing•≥95%recombinantsK2875-20
Ligase-mediated（1hour）T4DNAligaseZeroBlunt®
PCRCloningKit•≥95%recombinantsK2700-20
PolymerasemixturesforlongTemplate混合酶•Sequencing
Cloning（5minutes）TopoisomeraseTOPO®
XLPCRCloningKit•High-efficiencycloningoflong（3-10kb）PCRproductsK4700-10
TOPOPCR表达克隆法
传统限制酶切法必须把目标片段切下来再连接至表达载体上，这会导致一些非原始蛋白的其他氨基酸也混在其中，从而影响蛋白表达和蛋白的功能。
利用TOPO克隆技术把PCR产物直接克隆至表达载体，则可避免这种情况。
ComparisonofCloningStrategies
TOPOPCR表达克隆法仍利用特异引物把目标基因PCR扩增后，再利用高效的Topoisomerase酶把产物快速连接到T表达载体上，这是到载体上的目标基因不含非编码区，Invitrogen提供了原核细胞、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞的各种PCR克隆表达系统。
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