REACH法规 第四卷译稿32.docx

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REACH法规第四卷译稿32

B.32致癌测定

1.测定方法

1.1.引言

见引言总章B部分

1.2.定义

见引言总章B部分

1.3.参考物质

无

1.4.测定方法原则

测定物通过合适的方法给许多组动物样品的主要生命部分使用，每周七天，每组一剂。

使用间和使用后，每天观察动物样品的中毒迹象，特别是癌症的发展情况。

1.5.质量标准

无

1.6.测定方法描述

实验之前，动物至少要在实验要求的条件下喂养五天以上。

测定之前，健康幼畜随意分配到各组。

1.6.1动物样品

建立在前期研究基础之上的啮齿和非啮齿动物都可使用。

应使用实验室常用的健康幼畜。

且在断奶之后立即使用测定物。

研究之初，动物样品的体重差异不要超过平均值的

20%。

如果在长期性的研究之前有预备性的小型实验，那么在研究中应用相同的品系。

1.6.2数目和性别

对啮齿动物，每一剂量水平和每个对照组都至少要有100个动物（雌性50，雄性50），雌性必须是未经产的且未孕的。

如果期间准备有动物样品的死亡，那么数目应随实验完成之前预备放弃的数目的增加而增加。

1.6.3剂量水平和测试频率

除了对照组之外，至少要有三个剂量水平。

最高剂量应能导致最小的中毒迹象，如少许的体重的减少（少于10%），切除了癌症之外没有其他影响生命周期的影响。

最低剂量不应干扰正常生长，发育和动物样品的寿命或引起任何毒性的迹象。

总之，不能低于最高剂量的10%。

中间剂量界于最高和最低剂量之间。

剂量的选择主要考虑到之前毒性的研究和测定的实验数据。

正常的剂量使用频率是每天一次。

如果药物是掺杂在水或食物中，必须是连续可取的。

1.6.4对照组

必须有一个对照组，除了在不使用测定物之外，在其他每一方面都必须和测定组一致。

在特殊情况下，如涉及喷雾剂的使用，无特征生物活性的乳化的研究，一个不使用该种处理的额外的对照组小组是必须的。

1.6.5给药途径

三种主要的给药途径是：

口饲，皮肤的，呼吸。

使用流程的选择主要取决于测定物的物理和化学特性以及可能的在人身上使用的方式。

1.6.5.1口饲研究

当测定物质能被食道吸收，并且该种途径也适用于人类，除非有禁忌症象，这种流程是优越的。

可以和食物，溶解在饮用水或胶囊的方式给动物使用。

理想上，应该每周七次用量，如果每周五次，在不使用药剂的阶段动物可能恢复并使毒性消失，从而影响结果和后面的评估。

然而，基于实际考虑，每周五次的剂量仍可接受。

1.6.5.2皮肤性研究

皮肤注射可被选用来模拟人类的使用方式且被用作引发皮肤损伤的示范体式。

1.6.5.3呼吸性研究

因为吸入性比其它流程表现出更为复杂的技术问题，这里给出这种使用方式的更多细节。

必须注意，在某些特殊场合下，气管输入可能有其它的选择。

长期服用往往基于人类的使用方式。

在测定室浓度平衡后，每周五次，每次6小时，或基于外界的使用，即每周七天，每次22-24小时，并在每天的相同时间一个小时的喂养时间。

动物被测定以一定浓度的测定物。

间歇给药和连续给药的一个主要的区别是间歇给药时动物每天都有17-18个小时的恢复期，在周末则更长。

选择何种给药方式主要取决于研究的目的和模拟的人类使用方式。

然而，必须考虑到某些技术难题。

例如，连续实验的优点可能由于测定中需不停的喂水和喂实，且需更复杂的喷雾和蒸气的产生和监听技术而取消。

测定使用室

动物样品的测定室应该设计用来取得长期的至少每小时12次换气来确保足够的氧气和均匀的大气氛围。

对照组室的设计和建造必须和测定室一致以保证除了在使用测定物之外在其它任何方面都是可比的。

测定室里必须维持少许的负压力以防测定物渗出。

测定室应尽可能的降低动物样品的密度。

总的，为了保持测定室里空气的稳定性，动物样品的总体积不应超过测定室体积的5%。

测量和监控包括：

（一）气流：

通过不停的监控保持测定室气流速度适宜。

（二）浓度：

在日常服用期间，测定物浓度不应超过平均值的15%，在该项研究周期间，每天浓度应尽可能保持一致。

温度和湿度：

（三）对啮齿类动物，温度控制在22

2。

C，室内湿度在30-70%，除非使用水将测定物悬浮在空气中。

不停控制使两者适宜。

（四）粒子尺寸测量：

测定室里大气中液体或固体喷雾剂粒子的分布必须确定。

喷雾剂粒子尺寸应为动物呼吸尺寸。

测定室大气中的样本被吸入动物呼吸区。

气体样本应能代表动物使用的粒子且应能解释所有的悬浮粒子，即使大部分是不能呼吸的。

在体系产生过程中应不间断的分析粒子的尺寸，以确保喷雾剂的稳定性且在测定期间尽可能准确测定动物测定时的粒子分布的稳定性。

1.6.7研究周期

致癌测定过程包括了动物正常生命周期的主要部分，测定期对小鼠和仓鼠来说为18个月，大鼠24个月。

然而，对某些寿命更长或自然癌症发生率很低的动物，小鼠和仓鼠的终止期为24个月，大鼠30个月。

当最低剂量组和对照组的生存率达到了25%，终止期可适当延长。

分析时，不同性别的反应不同时，应分别考虑。

如果只有最高剂量组由于明显的毒性过高而提早死亡时，考虑到毒性显示不对其它组造成影响，不必立即结束测定。

对一个可接受的负反应，任何一组不能多余10%由于自体溶解、同类相残和操作问题而死亡。

对小鼠和仓鼠来说，每组在18个月时生存率不能少于50%，大鼠则24个月不少于50%。

1.6.8测定步骤

1.6.8.1.观察

每日的笼边观察应包括：

皮毛的改变、黏膜的改变，但又不局限于这些，还应包括呼吸、循还、自制力、中枢神经系统和行为方式的改变。

经常观察动物是必要的。

为了保证动物尽可能不因同种相残、组织自溶、错位而在研究中损失经常观察动物是必要的。

一旦发现死亡的动物应立即移走并验尸。

所有动物样品的诊断迹象和死亡都应记录。

癌症的观察必须特别仔细：

开始时间、位置、大小和外型。

每一可见或可触的肿瘤都必须记录。

在最初的13周必须记录食物的消化如果测定物掺在水中水的消耗量也必须记录），然后是大约每三个月的间隔，除非动物样品的体重明显改变。

在最初的13周内所有动物样品的体重都应记录，每周一次，以后每四周一次。

1.6.8.2诊断

血液诊断

血液诊断（如：

血红蛋白含量，总体细胞体积，红细胞总体数量，白细胞总体数量，血小板或其它凝结电位的测定）应在3个月，6个月和大约每隔6个月的时间进行，直到所有测定组的10个老鼠/性别的血液收集样品都完成为止。

如有可能，每隔一段时间测的样应来自同一老鼠。

如果笼边观察显示研究过程动物样品的健康有明显的恶化，那么必须做一个区别性的血检。

分别从动物身上取12个月、18个月和死亡之前的血液样本，在最高剂量组和对照组做一个区别性的血检。

如果这些实验数据特别是死亡前取得实验数据显示或病理学研究有需要，则较低剂量组也应做一个血检。

尸体解剖

所有动物都应做尸体解剖，包括那些死亡或因处于垂死状态而放弃的动物。

所有明显可见的肿瘤或因癌症引起的损伤都应保留下来。

下列器官和组织应被保留在合适的介质中以供后期研究：

脑（包括骨髓、小脑皮层和大脑皮层），脑垂体，甲状腺，甲状旁腺，所有胸腺组织，气管，肺，心，主动脉，唾液腺，肝，脾，肾，肾上，胰，性腺，子宫，生殖器附件，直肠，淋巴结，膀胱，乳腺，皮肤，食道，胃，十二直肠，空肠，回肠，盲肠，结肠，腿肌，边缘神经，带含髓骨的屁股，股骨（包括肘），三个地方的骨髓（子宫，中肠，腰）和眼睛。

尽快用固定剂防止肺和膀胱膨胀是保护所获得的这些组织的最佳方法。

吸入性研究中肺的膨胀对合适的组织病理学检查是很重要的。

在一些特定的研究如吸入性研究中，整个呼吸道都应进行研究，包括鼻腔，咽，喉。

如果进行了其它临床观测步骤，应在显微镜观测结果之前获取信息，因为这可以极大的帮助和指引病理学家进行研究。

组织病理学

（1）在测定期间死亡或放弃的动物和最高剂量组和对照组的动物都应做全面的组织病理学检查。

（2）在所有组中任何肿瘤或被怀疑可能引起肿瘤的损伤均应做仔细的显微镜检查。

如果损伤发生率在高剂量组和对照组存在明显的差异，在其它组该器官或组织应用组织病理学检查。

（3）如果高剂量组的存活率明显少于对照组，那么相邻较低剂量组应仔细观察。

（4）如果在高剂量组有能引起肿瘤反应的毒性的诱发或其它影响，相邻较低剂量组应仔细检查。

（5）如果有显著的证据证明高剂量组能导致毒性或其它可能影响肿瘤反应的效果，则低剂量水平应当被全面检查。

1.实验数据

实验数据应总结成表格的形式，表明每个测定组在测定开始时动物样品的数目，在测定中被探知有肿瘤或毒性效应的动物数目，探测时间，死后被发现有肿瘤的动物样品的数目。

结果应用合适的统计方法评估。

可以使用任何经过证明的统计方法。

3.实验结果报告

3.1.测定结果报告

如果可能，测定结果报告应包括以下信息：

-物种，品系，来源，环境条件，食物

-测定条件

3.1.1使用仪器的描述

包括设计，类型，尺寸，空气来源，产生微粒和喷雾剂的系统，空气控制方法，耗竭空气的处理方法以及如果使用的话，动物样品的居住方法。

如果可能，应该描绘测温度，湿度的设备，喷雾剂稳定性的设备，浓度，粒子尺寸。

3.1.2实验数据

应列表并计算平均值及变化量的范围（如标准偏差）和应包括：

（A）通过吸入设备的空气流速

（B）空气温度和湿度

（C）相对浓度（注入吸入器的测定物总量/空气体积）

（D）如果使用，中介物的性质

（E）在测定呼吸区的实际浓度

（F）中间粒子尺寸

-剂量水平（如果有，包括中介物）和浓度

-不同性别，剂量的癌症发生率及肿瘤类型

-在研究中的死亡时间或是否有生存到最终的动物

-不同性别和剂量的毒性反应

-毒性或其它影响因素的描述

-每个不正常的迹象观察到的时间和接下来的过程

-食物和体重实验数据

-使用的血液测定和所有的结果

-所有发现的组织病理学检查的细节描述

-使用方法的描述和结果的统计处理方法

-结果讨论

-结果分析

3.2.实验结果评估和解释

见引言总章B部分

4.参考物质

见引言总章B部分