凝结芽孢杆菌的检测Word格式.docx

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在本发明的第四方面，本发明提出了一种检测凝结芽孢杆菌的方法。

根据本发明的实施例，所述方法包括：

利用上述培养基对待测样品进行扩增培养；

以及将经过扩增培养的待测样品进行计数。

根据本发明实施例的检测方法，可操作性强，计数结果准确可信。

根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述待测样品预先依次进行稀释处理和加热处理，所述稀释处理的稀释倍数为10倍，所述加热处理是在温度为78～82℃的水浴条件下进行29～31min。

温度过高或时间过长，尤其温度超过82℃时凝结芽孢杆菌被损伤或杀灭，菌落数均为0，计数结果有显著性差异；

温度过低（小于78℃）或时间过短（小于29min），无法使多为革兰氏阴性杆菌或阳性球菌等非目标菌灭活，从而使所述检测方法的计数结果的准确度降低。

发明人发现，在该条件下进行加热处理，可以激活凝结芽孢杆菌，灭活非目标菌，从而便于凝结芽孢杆菌的分离和计数，使所述检测方法的计数结果更加准确可信。

根据本发明的实施例，所述扩增培养是在温度为45～55℃的条件下进行22～26h。

温度过高（大于55℃），则凝结芽孢杆菌停止生长，菌落数为0；

温度过低，凝结芽孢杆菌生长缓慢、菌落太小、不易观察计数。

培养时间过长，菌落计数结果偏低，原因有两方面，其一为培养时间过长，则凝结芽孢杆菌过度生长，本为单个独立菌落而相互连接、根据通用的计数原则两菌落无明显界限成链状可计为一个菌落，导致计数结果偏低，其二为培养时间过长，则培养基过度失水，出现干裂等情况，影响凝结芽孢杆菌的生长繁殖，导致计数结果偏低；

培养时间过短，菌落太小、不易观察计数，从而使所述检测方法的计数结果的准确度降低。

发明人发现，在该条件下进行扩增培养，菌落大，从而便于凝结芽孢杆菌的分离和计数，使所述检测方法的计数结果更加准确可信。

根据本发明的实施例，所述加热处理后，扩增培养前，进一步包括：

梯度稀释处理，所述梯度稀释处理的稀释倍数为10倍。

根据本发明的实施例，所述稀释处理或梯度稀释处理是通过加入磷酸盐缓冲液或生理盐水进行的。

根据本发明的实施例，所述扩增培养是通过如下方式进行的：

从梯度稀释液中每次吸取1mL置于培养皿中，平行吸取m次，其中，m为不小于2的整数；

向培养皿中加入所述培养基，以便进行扩增培养。

根据本发明的实施例，所述计数是通过如下方式进行的：

若只有一个稀释度的平板菌落数在10CFU～150CFU范围内，计算所述稀释液的m个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以所述稀释液的稀释倍数，计算获得每g或每mL所述待测样品中凝结芽孢杆菌的数目；

若两个连续稀释度的平板菌落数在10CFU～150CFU范围内时，按公式

（1）计算获得每g或每mL所述待测样品中凝结芽孢杆菌的数目，

N＝ΣC/（n1+n2）d公式

（1）

其中，N表示待测样品中凝结芽孢杆菌的数目；

∑C表示平板菌落数在10CFU～150CFU范围内的平板菌落数之和，n1表示第一稀释度的平板个数，n1为不大于m的整数；

n2表示第二稀释度的平板个数，n2为不大于m的整数；

d表示第一稀释度；

若所有稀释度的平板菌落数均大于150CFU，计算稀释度最高的稀释液的m个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以最高稀释倍数，计算获得每g或每mL所述待测样品中凝结芽孢杆菌的数目；

若所有稀释度的平板菌落数均小于10CFU，计算稀释度最低的稀释液的m个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以最低稀释倍数，计算获得每g或每mL所述待检样品中凝结芽孢杆菌的数目；

若所有稀释度的平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；

若所有稀释度的平板菌落数均不在10CFU～150CFU范围内，其中一部分稀释度的平板菌落数小于10CFU或大于150CFU时，计算平板菌落数最接近10CFU或150CFU的稀释液的m个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以所述稀释液的稀释倍数，计算获得每g或每mL所述待测样品中凝结芽孢杆菌的数目。

需要说明的是，所述“以小于1乘以最低稀释倍数计算”是指最低稀释倍数为0即原液，结果报告＜1；

最低稀释倍数为10倍稀释、结果报告＜1×

10；

以此类推。

根据本发明实施例的计数方法，不局限于只有一个梯度在计数范围时的计数，而是考虑了所有可能出现的情况，并作了详细的描述和说明，所述检测方法全面、具体，检测结果准确可信。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种检测凝结芽孢杆菌的方法。

以及

将经过扩增培养的待测样品进行计数；

所述待测样品预先依次进行稀释处理和加热处理，所述稀释处理的稀释倍数为10倍，所述加热处理是在温度为78～82℃的水浴条件下进行29～31min，

所述扩增培养是在温度为45～55℃的条件下进行22～26h，

所述加热处理后，扩增培养前，进一步包括：

梯度稀释处理，所述梯度稀释处理的稀释倍数为10倍，

所述扩增培养是通过如下方式进行的：

从梯度稀释液中每次吸取1mL置于培养皿中，平行吸取m次，其中，m为不小于2的整数；

向培养皿中加入所述培养基，以便进行扩增培养，

所述稀释处理或梯度稀释处理是通过加入磷酸盐缓冲液或生理盐水稀释液进行的，

所述计数是通过如下方式进行的：

若只有一个稀释度的平板菌落数在10CFU～150CFU范围内，计算所述稀释液的m个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以所述稀释液的稀释倍数，计算获得每g或每mL所述待测样品中凝结芽孢杆菌的数目；

若所有稀释度的平板菌落数均小于10CFU，计算稀释度最低的稀释液的m个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以最低稀释倍数，计算获得每g或每mL所述待检样品中凝结芽孢杆菌的数目；

若所有稀释度的平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；

若所有稀释度的平板菌落数均不在10CFU～150CFU范围内，其中一部分稀释度的平板菌落数小于10CFU或大于150CFU时，计算平板菌落数最接近10CFU或150CFU的稀释液的m个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以所述稀释液的稀释倍数，计算获得每g或每mL所述待测样品中凝结芽孢杆菌的数目。

根据本发明实施例的方法，不局限于只有一个梯度在计数范围时的计数，而是考虑了所有可能出现的情况，并作了详细的描述和说明，所述检测方法更加全面、具体，可操作性强，检测结果更加准确可信。

附图说明

图1是根据本发明实施例的不同温度和时间前处理进行凝结芽孢杆菌检测结果的对比柱形示意图；

图2是根据本发明实施例的不同温度和时间前处理进行凝结芽孢杆菌检测结果的对比折线示意图；

图3是根据本发明实施例的不同温度和时间培养凝结芽孢杆菌检测结果的对比柱形示意图；

图4是根据本发明实施例的不同温度和时间培养凝结芽孢杆菌检测结果的对比折线示意图；

图5是根据本发明实施例的凝结芽孢杆菌计数琼脂培养基中成分含量对应检测结果的对比示意图；

图6是根据本发明实施例的两种方法的检测结果对比示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下面描述凝结芽孢杆菌的一般检测方法：

培养基：

凝结芽孢杆菌计数培养基组成成分和配制

1.成分：

2.制法：

将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。

分装后121℃高压灭菌15～20min。

检测方法：

1.基本方案：

培养基的制备，样品的制备与稀释、接种、培养、菌落计数、结果报告。

2.优选方案：

设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他常规设备和材料如下：

2.1超净工作台或生物安全柜；

2.2高压灭菌器；

2.3均质器；

2.4电子天平（感量为0.1g）；

2.5恒温培养箱：

30℃±

1℃；

2.6冰箱：

2℃～5℃；

2.7刻度吸管：

1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL）刻度或微量移液器及吸头；

2.8三角瓶：

500mmL、1000mL；

2.9试管：

18×

180；

2.10水浴锅：

80℃士I℃；

2.11无菌均质袋。

3培养基试剂

3.1凝结芽孢杆菌计数培养基

培养基的配制方法:

成分：

酵母提取物2.5g，蛋白胨5.0g，葡萄糖1.0g，聚山梨醇酯801.0g，L-半光氨酸0.1g，溴甲酚紫0.06g，琼脂15.0g，PH＝7.0。

分装：

将上述成分加入到1000mL蒸馏水中，加热溶解，分装后121℃高压灭菌15～20min。

3.2磷酸盐缓冲液；

3.3无菌生理盐水；

4操作步骤

4.1样品的制备与稀释

操作过程：

（1）固体和半固体样品：

称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:

10的样品匀液。

（2）液体样品：

以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:

（3）用无菌吸管吸取液体检样、固体或半固体检样的初级稀释液5mL-10mL于无菌试管中，立即将上述试管放人80℃士2℃的水浴中，（试管内液面至少低于水面4cm）加热处理30min士1min。

在对照管中放一支温度计测定温度。

试管内样液的升温时间不应超过5min，将加热处理后的试管取出立即放到20℃以下的流水中冷却。

其中，凝结芽孢杆菌的转化处理：

80℃士2℃的水浴中，（试管内液面至少低于水面4cm）加热处理30min士1min，激活凝结芽孢杆菌、灭活非目标菌，便于凝结芽孢杆菌的分离和计数，且计数平板上的所有菌落数，计数结果准确可信。

（4）用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:

10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:

100的样品匀液，另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。

4.2样品的接种

根据待检样品凝结芽孢杆菌的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液分别置于2个培养皿中，倾注培养基。

4.3培养

待琼脂凝固后，倒置于45℃-55℃培养箱厌氧培养24h±

2h，计数平板上的所有菌落数。

若倒置于36℃±

2℃培养箱培养48h±

2h，则菌落较小不易计数，但根据本发明实施例的45℃-55℃培养箱厌氧培养24h±

2h，菌落大易计数，计数结果准确可信。

4.4菌落计数

（1）选取菌落数在10CFU～150CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。

（2）其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；

若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

（3）当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

5结果与报告

5.1结果

凝结芽孢杆菌菌落总数的计算方法：

（1）若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中凝结芽孢杆菌数结果。

（2）若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式

（1）计算：

N＝ΣC/（n1+n2）d………

（1）

式中：

N——样品中凝结芽孢杆菌数；

∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

（3）若所有稀释度的平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

（4）若所有稀释度的平板菌落数均小于10CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

（5）若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

（6）若所有稀释度的平板菌落数均不在10CFU～150CFU之间，其中一部分小于10CFU或大于150CFU时，则以最接近10CFU或150CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

5.2报告

凝结芽孢杆菌菌落数报告：

（1）菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告；

（2）菌落数大于或等于100时，前3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；

也可用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字；

（3）空白对照平板上有菌落出现，此次检测结果无效；

（4）称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。

下面详细描述本发明的具体实施例，所述具体实施例的是示例性的，旨在用于解释本发明的具体实施方式，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1

添加凝结芽孢杆菌样品的计数检测

1.设备和材料

超净工作台或生物安全柜；

高压灭菌器；

均质器；

电子天平（感量为0.1g）；

恒温培养箱：

冰箱：

刻度吸管：

1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL）刻度或微量移液器及吸头；

三角瓶：

试管：

水浴锅：

80℃士I℃；

无菌均质袋。

2.培养基试剂

2.1凝结芽孢杆菌计数培养基

酵母提取物2.5g，蛋白胨5.0g，葡萄糖1.0g，聚山梨醇酯801.0g，L-半光氨酸0.1g，溴甲酚紫0.06g，琼脂15.0g。

PH＝7.0

2.2磷酸盐缓冲液；

2.3无菌生理盐水；

2.4凝结芽孢杆菌菌株。

3.操作步骤

3.1样品的制备与稀释

（3）用无菌吸管吸取液体检样、固体或半固体检样的初级稀释液5mL-10mL于无菌试管中，立即将上述试管放人80℃士2℃的水浴中，（试管内液面至少低于水面4cm）加热处理30min士1min。

试管内样液的升温时间不应超过5min，将加热处理后的试管取出立即放到20℃以下的流水中冷却。

3.2样品的接种

根据待检样品凝结芽孢杆菌的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液分别置于2个培养皿中，倾注培养基。

3.3培养

待琼脂凝固后，倒置于50℃士2℃培养箱厌氧培养24h±

3.4菌落计数

4.结果与报告

4.1结果

N＝ΣC/（n1+n2）d…………

（1）

4.2报告

添加凝结芽孢杆菌样品的检测结果见下表1；

添加凝结芽孢杆菌样品的计数检测结果与添加量的对比分析见下表2；

对表2数据进行F检验分析，

结果见下表3；

在F检验符合的情况下对表2数据进行T检验分析，结果见下表4。

表1：

添加凝结芽孢杆菌样品的检测结果

表2：

添加凝结芽孢杆菌样品的检测结果对比分析

表3：

F检验结果分析

由上表2和表3数据可看出：

95％置信水平下：

F计&

lt;

F临界值，两组数据的精密度无显著性差异。

表4：

T检验数据分析

由上表4可看出：

T计&

T临界值，两组数据无显著性差异。

通过以上表1～表4的对比分析可以看出，本发明方法的检测结果与添加的量相同或相近，经F检验和T检验，结果无显著性差异，同时符合微生物重复性r≤0.25的规定，检测结果准确、可信、可控，本方法可用于凝结芽孢杆菌的检测，填补了凝结芽孢杆菌菌落计数检测方法的空白，满足产品中凝结芽孢杆菌的量化计数的要求，为卫生学评价提供科学、可靠的依据。

对比例1

按照实施例1的方法测定凝结芽孢杆菌含量，区别在于前处理的温度和时间。

不同温度和时间的前处理进行凝结芽孢杆菌检测结果对比参见下表5、图1、图2所示。

表5：

不同温度和时间前处理进行凝结芽孢杆菌检测结果对比

由表5以及图1、图2可以看出，根据本发明实施例1的方法的检测结果与添加的量相同或相近，结果无显著性差异（见实施例1）。

但高温或时间过长（超过32min），计数结果都远低于根据本发明实施例1的方法的检测结果，存在显著性差异。

温度过高即超过82℃时凝结芽孢杆菌被损伤或杀灭，菌落数均为0，对比例1所计数的结果与根据本发明实施例1的方法计数结果存在显著性差异。

非目标菌多为革兰氏阴性杆菌或阳性球菌，这些菌均不耐热，但若温度过低（小于78℃）或时间过短（小于29min），无法使非目标菌灭活，导致计数结果准确度降低。

因此，对比例1的方法检测结果不准确、不可信。

根据本发明实施例的方法的检测结果准确、可信、可控，可用于凝结芽孢杆菌的检测，为卫生学评价提供科学、可靠的依据。

对比例2

按照实施例1的方法测定凝结芽孢杆菌含量，区别在于培养温度和时间。

不同温度和时间培养凝结芽孢杆菌检测结果对比参见表6、图3、图4所示。

其中，限于空间限制，如果方格内的数据呈分行排列的情况，仅表示一个数据，由上而下连接读取。

表6：

不同温度和时间培养凝结芽孢杆菌检测结果对比

由上表6和图3、图4可以看出，温度低于45℃培养的计数结果均低于本发明方法的检测结果，原因是温度过低，凝结芽孢杆菌生长缓慢，菌落太小，不易观察计数，从而使检测方法的计数结果准确度降低。

温度过高即超过55℃培养时凝结芽孢杆菌停止生长，菌落数均为0，计数结果与添加的量有显著性差异。

故对比例2的方法的检测结果不可取，