病理制片技术手册Word文件下载.docx
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一般情况下要求固定液的量应为组织体积的6～10倍。
4．适度固定：
现代固定的要求是，在良好保存组织细胞形态结构的同时尽可能较好地保存组织细胞的抗原性。
长时间的固定会导致某些组织抗原性的逐渐丧失，因此，适时固定可以在保存细胞结构和抗原性之间取得必要的平衡。
对于较大的送检标本而言，在及时切开固定的基础上，应尽可能在24h以内取材进入组织脱水程序。
5．适宜温度：
低温可以降低固定的速度，反之可以加快固定进程。
在自动组织脱水机上可以施加恒定的温度使得在有限的时间内可以完成固定过程。
一般情况下应将固定温度控制在36~38℃。
6．适当搅拌：
在自动组织脱水机上可以通过使用搅拌和试剂循环功能使固定过程在标本与试剂充分接触的条件下完成。
三、固定液的选择
影响标本固定的因素很多，如组织与固定液的比例、固定时间、固定温度等；
除此之外，固定液本身也很重要，若所选固定液不当，细胞内蛋白质、脂类、核酸等成分将会有不同程度地损失。
固定剂最好随配随用，并注意其浓度和酸碱度。
因此根据实际工作的目的，选用合适的固定液非常重要。
下面是一些常用固定液的配制方法及适用范围。
1．单纯固定液
（1）4％中性甲醛固定液：
最常用的固定液，能满足常规HE及免疫组化、PCR等工作。
一般无特殊要求的病理标本均适用。
尤其值得注意的是，中性甲醛是以pH7．2～7．4的磷酸缓冲液为溶剂配制的，其固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般的4％甲醛固定液。
此固定液配制后应密封并保存在阴凉处，保存时间不超过一个月。
甲醛（40%）100ml
无水磷酸氢二钠6.5g
磷酸二氢钠4.0g
蒸馏水900ml
（2）乙醇固定液：
使用时以80％～95％的浓度为宜，具有硬化、固定、脱水等作用，对组织渗透力较弱，因此很少单独使用，但其保存组织中的核酸强于中性甲醛，故常用于有核酸操作的实验或检查，如果用于证明尿酸结晶和保存糖原，可用100%乙醇固定组织。
（3）4％的多聚甲醛：
主要用于培养细胞的固定。
2．混合固定液
（1）乙醇一甲醛（乙醇－福尔马林，AF）固定液：
适用于皮下组织中肥大细胞的固定。
该固定液有固定兼脱水作用，固定后的标本可直接入95％乙醇脱水。
甲醛（40％）100ml
95％乙醇900ml
（2）B5（醋酸钠一升汞一甲醛）固定液：
多用于固定淋巴组织。
染色前应进行脱汞沉淀处理。
无水醋酸钠1.25g
升汞6.0g
蒸馏水90ml
使用前加入甲醛10ml
（3）Bouin固定液：
特别适用于睾丸活检组织的固定。
Bouin液对组织固定较均匀，收缩很少，不会使组织变硬变脆。
需现配现用。
饱和苦味酸水溶液（约1.22%）75ml
甲醛25ml
冰醋酸5ml
（4）Carnoy固定液：
穿透能力强，可很好的固定细胞质和细胞核，特别适合于固定外膜致密的组织，亦适用于糖原及尼氏小体的固定。
无水乙醇60ml
氯仿30ml
冰醋酸10ml
（5）Zenker固定液：
经此液固定的标本，细胞核和细胞质染色颇为清晰，但成本较昂贵且需特殊处理汞。
该固定液要避免接触阳光，以免引起化学变化而失效。
升汞5.0g
重铬酸钾2.5g
硫酸钠1.0g
蒸馏水（加至）100ml
四、操作方法
临床医师切取标本后，应尽快将标本置于盛有足够量固定液的容器内，尽量避免可能出现固定不及时或不充分导致标本干涸或腐败，无法进行切片制作。
病理科工作人员验收标本后，必须对临床初步固定的标本及时进行规范的处理：
对于穿刺及胃肠镜所取的小标本，直接添加中性甲醛，添加的量应6～10倍于标本体积；
对于较大的手术切除标本应呈书页状切开、有包膜的标本切开固定，切开的厚度1cm左右，为了保存标本的原有大体形态，切开时最好不要完全断开，两切面之间用脱脂棉或纱布隔开，然后放人6～10倍体积的固定液中完全淹没。
特殊标本特殊处理：
如脾脏或淋巴结等包膜较厚，固定剂渗透力有限，应切薄薄的一小片单独固定，对于宫颈锥切标本及胃肠等空腔器官应及时钉板展开固定。
固定到取材的时间应视标本的大小及切面的厚度而定，小标本应不少于4h,大标本不少于18h。
第三章取材
一、概念
取材是将送检标本进行客观描述并将病变部位组织切成厚薄适度的小片后装入小盒（进入组织脱水程序），取材至关重要。
二、取材环境
取材室由取材台、记录桌、标本陈列架、电脑查询等组成；
取材台应有良好的排风、进出水系统，配备齐全的刀、剪、镊、尺等基本工具和备用固定剂，记录桌应备有打号机（无时应用铅笔）、记录纸张、标本小盒及盒盖等，标本陈列架应存放、拿取方便、排风良好，电脑查询应与登记台和医师诊断记录结果的计算机相连。
三、操作
1．首先进行核对：
记录者拿出一份申请并唱出病理号，取材医师按病理号拿出一份标本，核对无误后唱出申请单编号，记录者核对无误后念出申请单上填写的取材部位和送检标本份数及具体块数，取材医师核对无误后对标本进行具体描述。
2．对送检标本的观察和描述：
可分为活检小标本（包括经内窥镜获取的黏膜组织、浅表或深在部位的穿刺物、子宫腔刮取物、经微创手术由器官或肿瘤中切取的不完整组织等）和手术大标本。
（1）小标本检查：
描述送检标本的数量（量少时精确计数）、大小（量少时精确测量，量多时聚堆测量体积）、色泽、形状以及质地等。
（2）大标本检查：
①检查切除标本的手术类型。
②测量标本的大小；
描述标本的形状、色泽、有无包膜或被膜及质地，必要时（如内分泌肿瘤）要在切开标本前称重；
带有脏器的标本还应注意检查病变与有关脏器的比邻关系。
③按操作规范切开检查标本切面，如实性区
域观察色泽、质地、纹理、有无出血坏死以及肿瘤肉眼浸润深度和范围；
囊性区域观察囊肿壁的厚度、内外表面、内容物及其性状等。
④注意各系统脏器大体检查的特殊要求。
⑤必要时绘制简图说明标本大体特点和解剖关系，也可进行表面及剖面摄影，以保存大体资料。
3．组织取材：
按病理诊断和研究的目的和要求，从标本上切取适当大小和数目的组织块，供后续制片和显微镜下观察用于诊断以及相关研究。
取材的一般原则如下。
（1）认真地进行大体检查，准确选取病变部位。
（2）显示病变全貌，切取有代表性的病变区域组织，包括病变周边相对正常的组织和坏死组织等；
对有肿瘤的标本应包括切缘、肿瘤包膜及转移部位等。
（3）组织块的面积通常为2.0cmX1.5cm，厚度不超过3.0mm。
太大太厚的组织块常会固定不充分，而影响脱水和制片。
组织块的数量依具体情况而定，一般以满足诊断和相关研究需要为准。
（4）骨或钙化组织需要先经脱钙处理；
腔道器官及囊壁组织应立埋。
4．记录：
大体检查和取材要由具备一定经验的病理医师进行，应配备人员进行记录。
记录人员负责如下事宜。
（1）每例标本在病理医师进行大体检查和取材前，与其共同核对该例标本份数、内容、病变特征及其标志是否与申请单相关内容一致。
（2）病理医师在进行大体检查和取材时，记录人员根据申请单向医师报告病人基本情况、术中所见、送检医师特殊要求等，并如实清楚地将病理医师口头描述记录于记录单上，必要时绘制简图显示大体所见及标示取材部位。
（3）病理医师取材完毕后，与其共同核实取材内容，确保组织块及其编号标签准确置人脱水盒内，并在记录单和取材工作单上签名并签署日期。
5．注意事项
（1）核对要认真，描述要客观，取材要准确。
（2）每例标本取材前后，均应用流水彻底清洗取材台面和所有相关器物，避免交叉污染。
（3）细小标本取材时可用伊红点染并用滤纸包裹，严防标本丢失。
（4）大标本取材大小要适当（组织块的面积通常为2.0cm×
1.5cm，厚度不超过3.0mm）
（5）取材刀刃要锋利，避免使用钝刀或齿镊过度挤压组织，取材动作要轻柔，不可来回切割或过度牵拉组织，以免组织结构变形或内部细胞脱落。
（6）组织块切面应平整，如有线结和钢丝应拔除。
（7）所取组织应包括各脏器的重要结构或全层。
（8）特殊标本要在取材前照相留资料。
第四章组织脱水
组织经固定后会有大量水分，组织脱水是用某些溶剂逐渐将组织内的水分置换出来，以利于透明剂和石蜡的渗入。
一、手工脱水
1．器械准备：
大标本缸6个，浸蜡用金属缸3个，脱水篮，恒温烤箱。
2．日常工作程序见表5．1。
表5．1手工脱水日常工作程序
试剂
浓度／温度
时间设定
中性缓冲甲醛
4%
3.00h
乙醇
80%
1.00h
90%
95%
过夜
无水乙醇I
2.00h
无水乙醇Ⅱ
二甲苯一无水乙醇
体积比为1:
1
30min
二甲苯I
二甲苯Ⅱ
石蜡
60℃
3．注意事项
（1）所用标本缸要大一些，达到组织块与液体比6～10倍。
（2）固定液、脱水剂要勤更换，可以采用前移更换。
（3）二甲苯时间不宜过长，不要超过2h。
（4）石蜡温度不得高于60℃。
（5）所有程序应每间隔0．5h摇动2～3次以利于固定脱水浸蜡彻底。
二、半自动脱水机
半自动脱水机日常工作程序可参考全手工脱水日常工作程序进行。
梯度乙醇的脱水时间加长。
注意事项同手工脱水。
三、全自动密闭式脱水机
全自动密闭式脱水机有控制面板、处理槽、石蜡箱和试剂柜四个部分。
为保证组织处理无刺激味道，全自动密闭式脱水机还设有活性炭过滤器。
（1）控制面板有显示屏和小键盘，可由此输入20个不同的处理程序，可设置处理时间和温度，可启动P／V循环（压力和真空交替）和混合循环，出现故障时有报警提示。
（2）处理槽是组织块进行处理的容器。
（3）石蜡箱可将熔化的石蜡保持在设定的温度待用。
（4）试剂柜装有处理试剂。
1．日常工作程序见表5．2。
表5．2全自动密闭式脱水机脱水日常工作程序
溶液
百分浓度
（％）
温度
（℃）
P/V循环（压力和真空交替）
混合循环
中性缓冲甲醛液
4
35
＋
80
－
95
100
二甲苯
0.50h
60
—
注：
截止时间为1／8：
00am
2．双休日工作程序：
脱水程序及各试剂的所用时间及功能相同，只将截止时间调至3/8:
00am即可。
3．外检小标本工作程序见表5．3。
表5．3全自动密闭式脱水机外检小标本工作程序
中性甲醛
20min
00am
4．小动物组织工作程序见表5．4。
表5．4全自动密闭式脱水机小动物组织工作程序
5．大动物组织（如狗、兔、猴）：
可以同外检组织使用一个程序。
6．脱水程序运行完毕后处理。
（1）先按泵出按钮将石蜡抽回缸内，再打开处理槽将组织块取出。
（2）将处理槽内及槽盖上的余蜡擦净。
（3）将底部中央过滤器螺丝拧开，将管道口的蜡擦净，拧紧螺丝。
（4）盖上盖后，按清洗按钮清洗。
7．全自动密闭式脱水机的注意事项。
（1）固定液每三天更换一次，组织块为600～800块。
组织固定的好坏直接影响切片质量。
为达到组织固定彻底的目的，可使用脱水机的P／V循环和混合循环功能，也可将温度定在38～40℃。
（2）梯度乙醇脱水剂每星期更换一次，组织块约为1000～1200块。
方法是将第二缸的80％乙醇倒弃，以后的95％乙醇和无水乙醇依次前移。
只将最后一缸的无水乙醇更换为新液。
这样更换不但节约了乙醇，更重要的是如果脱水剂全部更换为新液就会产生过脱水，组织发脆。
经过几次脱水后的乙醇，浓度虽然只降低了5％～10％，但脱水过程中置换出的细胞外液、组织液等可减弱乙醇的脱水能力。
因此实际工作过程中须根据组织块的多少、脱水剂的使用时间合理设定脱水剂的脱水时间、P／V循环和混合循环功能。
（3）透明剂二甲苯10～15天更换一次。
第一缸二甲苯倒弃，第二缸前移至第一缸，第二缸更换为新液。
二甲苯起媒介作用，将无水乙醇置换出又使石蜡很好地浸入组织内。
如果透明时间过长、强度过大（如P／V循环和混合循环全程使用）就会产生透明，以致组织发脆发干不利于切片。
所以透明剂设定的时间、P／V循环和混合循环的使用要有机配合。
（4）所用石蜡要干净无杂质，熔点58～60℃。
使用一定时间后，倒弃二甲苯含量过高的第一缸石蜡，将后三缸石蜡依次前移，最后一缸换新鲜石蜡。
石蜡温度设定为60℃，这样的温度可避免小标本浸蜡因温度过高而发脆。
（5）脱水机要放置干燥通风房间，防止阳光直射显示屏。
最好配置一台不间断电源（UPS），防止瞬间断电影响机器使用。
（6）使用全自动密闭式脱水机要防止过脱水，过透明。
一、意义
组织块经过固定、脱水、透明、浸蜡等处理后，用包埋剂（如石蜡、树脂、塑料等）将其包制成含组织块的蜡块或塑料块等的过程称为包埋。
不同的包埋方法有不同的要求，经包埋后，组织可达到一定的硬度和韧度，有利于切成理想的薄片。
二、包埋步骤
先将熔化的石蜡注入包埋托内（模具），而后用镊子将经过浸蜡的组织块从脱水盒中取出，放入包埋托中央，放在小冷台上，用镊子轻按组织块，以达到组织块平整，盖上脱水盒底，再加好石蜡，移至冷冻台上，待冷冻好后，卸下组织蜡块待切。
包埋时应根据组织的不同，选择大小型号适合的包埋托；
有要求直立包埋的组织要用镊子将组织固定在蜡块中央稍停片刻，以使组织在蜡凝时立住，达到立埋的要求。
三、注意事项
1．每次夹取组织块时，镊子用乙醇灯加热至温度适中。
2．包埋托内不要有水、碎蜡等异物，以免影响包埋质量。
3．包埋蜡的温度要控制好，包埋蜡的熔点应为58~60℃。
4．包埋蜡加入少量蜂蜡（蜜蜡），可以增加韧度，利于切片。
5．夹取组织块放人包埋托内时，一定要注意包埋面。
6．包埋好的蜡块，用刀修整时，一定要适当保留蜡块中组织周边的白蜡边，以利于连续切片。
7．每包埋完一块组织，镊子必须擦干净或用乙醇灯烧。
四、自动包埋机简介
自动包埋机是对组织经脱水、浸蜡后进行包埋处理的设备。
有多种类型，其设计具有人性化，一般整机由包埋部分和冷冻部分组合而成（一体化简洁紧凑），全自动程序控制，具有延时自动开机功能，加热快速，温控准确，安全可靠，包埋效果好等特点，冷台最低温度可达一5℃，可进行快速冷冻处理包埋块，具有大冷台，冷冻面积大，可放置超大包埋盒或多个包埋盒。
包埋部分温度可以从55～70℃，可储存3～5L石蜡，自动熔解石蜡，可容纳70～100个样品包埋盒。
金属板表面容易清洗，有2个加热的抽屉，可收集多余的石蜡，进行重新利用，避免石蜡浪费。
具有冷却镊子架，方便使用。
可配放大镜利于小活检标本的包埋；
可配脚踏：
石蜡注入由脚踏开关控制或上手工控制。
所有温度和工作时间参数全部由程序控制，记忆功能配有备用电池，这使病理组织学实验室的工作更为灵活。
这种独特的结合使当前组织学和病理组织学实验包埋技术达到了新的水平。
是创新发展的石蜡包埋技术和智能化高水准工艺的完美结合。
组织经石蜡包埋后制成的蜡块，用切片机制成切片的过程为石蜡切片法。
石蜡切片法现使用的切片机有平推式切片机、轮转式切片机两种。
一、平推式切片机石蜡切片法
1．切片前的准备：
清洗过的载物片（或免清洗的），毛笔，铅笔，小竹片，水槽，雾化器，摊片器，切片刀，刀架。
2．切片制作步骤：
刀架的粗削部放在头端，在切片机刀架部夹紧。
组织蜡块装在切片机蜡块固定器上夹紧。
右手握切片机刀头运动手柄，左手转动切片机蜡块运动旋钮。
先转动此钮，后平拉刀架运动手柄，进行粗削，直至组织切全。
停止，将刀架移到细削部，轻轻转动蜡块运动旋钮，后拉刀架手柄进行细削。
削至组织光滑发亮，右手拿毛笔扫净刀架及蜡块上的蜡屑，组织屑，放下毛笔，再用右手握住刀架运动手柄。
左手拿小竹片，用竹片头蘸一下水槽中的水。
左手中指搬动薄切钮，雾化器的喷头对准蜡块。
右手拉刀架运动手柄。
左手中的小竹片在蜡块空白处等待切片刀切起蜡片一端挑起粘住，随切片刀移动，完整的蜡片切出后，粘在竹片上，移入水槽中，捞片，放在摊片器上摊片5min后，装在染色篮上，放入75℃烤箱烤片。
（1）无冷台的病理科可以将包埋好的组织蜡块放到冰箱内，但如放置时间过久温度太低切片时蜡块会产生热涨，切片会厚，要多切几张，后面的片子就会薄一些。
（2）雾化器是去除静电的，但也有增加切片厚度的缺陷。
尤其雾气大时，使蜡块热涨，厚度增加更明显。
为了保证切片厚度，一定要控制好风力、雾力。
雾化器使用自来水，水位控制在30刻度。
（3）切片机使用前一定要检查各部位情况。
先检查固定器是否固定在你所要的厚度上。
切片机刀架角度与蜡块呈90。
。
从蜡块右上角进刀。
二、轮转式切片机石蜡切片法
清洗过的载玻片、毛笔、铅笔、盛有30％乙醇的小烧杯、牙科镊、展片槽、切片机、一次性刀片及刀架。
检查轮转式切片机切片厚度的钮是否固定于你所要切的厚度刻度上。
将放在－5℃冷台上的组织蜡块装在切片机固定器上夹紧，空白蜡多的一端在上。
将切片刀固定一端为粗削部，左手旋动蜡块推动器，右手旋动切片机把手。
先摇动蜡块推动器，后摇动切片机机头半轮上下运动，进行粗削，一进一削，直至组织切全。
而后将切片刀移至另一端进行细削，削至蜡块光滑平整。
用毛笔将其刀架、蜡块面清扫干净。
左手持毛笔，右手整轮转动切片机手柄进行切片。
将毛笔贴于刀架背不时转动，轻轻托起连片的蜡片。
右手停止转动机头，换持牙科镊，夹住连片蜡片头端，放入盛30％乙醇的烧杯内。
用牙科镊去除不好的蜡片。
放入水温45～50℃水槽内展片后捞片。
（1）无冷台的病理科可以将包埋好的组织蜡块放到冰箱内，但如放置时间久温度太低注意切片时蜡块会产生热涨，切片会厚，要多切几张，后面的片子就会薄一些。
（2）为了能够连片，蜡块两端要有空白蜡。
多的一端放在上面。
（3）展片槽温度不要过高，有时会有小组织块散漂在水面上造成污染。
可用手纸折成与水槽宽度相同水面行走，将组织屑捞走。
苏木精（hematoxylin）和伊（eosin）染色方法，简称HE染色方法，是生物学、细胞学与组织学最广泛应用的染色方法。
在病理科称为常规染色方法。
病理学的诊断都是以HE方法为基础的。
染色的目的是把组织切片或细胞涂片等浸入染料及其他染色剂配成的染色液中，经过适当的时间和处理，使组织或细胞及其他成分染上不同深浅的颜色，产生不同的折射率，从而便于光学显微镜下进行观察和研究。
进行染色前进行染色液的配制，应根据工作量的多少配制相应量的染液，同时应注意溶液种类的选择、溶液浓度、pH值等，另外也应注意配方的合理选
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