测定蛋白质含量测定方法的比较研究指导Word格式.docx
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溶胶-凝胶法
制备温度低，容易控制，纯度高，成分均匀，分散性好，副反应少，操作简单，成本低廉等；
在制备溶胶过程中，由于钛醇盐水解反应速度很快，所以一般需加抑制剂来减缓其水解速度，常用的抑制剂有盐酸、氨水和硝酸等
效率低、生产自动化程度不高、质量控制较困难①
见文献[29-31]
液相沉淀法
设备简单、工艺过程容易控制、成本较低等；
国伟林等[32]利用超声化学效应，用钛醇盐水解沉淀法得到单分散性较好的锐钛矿型纳米二氧化钛
工艺流程长、废液多、产物损失较大②
见文献[33]
水热法
粒子纯度高、分散性好、晶形好且可控制，生产成本低；
通过光催化降解品红的实验证明，微波水热条件下制备的催化剂具有较高的光催化性能
反应环境要求较高
见文献[34]
气相法
气相沉积法
沉积温度低，均匀性和重复性较好，纯度高，组分易控制，颗粒尺寸小、团聚少等；
注意控制温度要求
设备要求很高，温度控制要求高，成本比较高
合成了氮化钼的纤维棒和中空管,同时得到了一些新的相[43]
气相水解法
纯度高，自动化程度高，粒径小，分散性好，表面活性高等；
注意水蒸气浓度的影响
设备要求高，工艺参数的控制要求很精确
见文献[35]
注：
①②
5、文章的排版格式要按范文执行。
特别是要注意参考文献的标注。
详细内容，请参见附件。
有问题随时反映，我会及时告知。
最后，愿你能出色地早日完成。
谢谢合作！
刘晓庚老师
2013－4－3
附文献：
实验16蛋白质含量测定
一、Folin—酚法
（一）目的
了解用Folin—酚法测定蛋白质的含量。
（二）材料用具及仪器药品
植物721型分光光度计、吸管、试管、试管架、容量瓶、移液管
标准酪蛋白质溶液：
称取结晶酪蛋白100mg，用少量0.5mol/LNaOH溶液湿润溶解，加蒸馏水定容至100ml，则配成1mg/ml的标准酪蛋白溶液。
Folin—酚试剂的配制：
试剂A：
1gNa2CO3溶于50ml的0.1mol/LNaOH溶液，另将0.5gCuSO4·
5H2O溶于100ml的1%酒石酸钾（或酒石酸钠）溶液，实验时按前者：
后者=50：
1的比例混合，此混合液最多只能用一天。
试剂B：
将100g钨酸钠（Na2WO4·
2H2O），25g钼酸钠（Na2MoO4·
2H2O）、700ml蒸馏水、再加50ml85%磷酸及100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏10小时，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液体溴数滴，开口煮沸15分钟，驱除过量的溴（在通风橱内进行），冷却，用蒸馏水稀释至1000ml，过滤，滤液呈现微绿色，贮于棕色瓶中，临用前，用酚酞作指示剂，用标准NaOH溶液滴定，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L酸度，备用。
（三）原理
Folin—酚法所用的试剂是由两部分组成的，试剂A相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽键起显色反应，试剂B（磷钨酸和磷钼酸混合液）在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝混合物）。
在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比。
（四）方法步骤
1.绘制标准曲线
用标准酪蛋白溶液配制成浓度分别为：
0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20mg/ml的系列标准溶液各10ml,将试管编号，依次向各管中加入上述蛋白质溶液0.5ml和Folin—酚试剂A4ml，摇匀，室温放置10分钟后，再加入Folin—酚试剂B0.5ml,30分钟后在分光光度计650nm波长下比色，测定OD值，以蛋白质含量为横坐标，光刻度值为纵坐标作光刻度一蛋白质浓度曲线。
2.样品测定：
准确吸取样液0.5ml于试管内，加试剂A、B及比色等操作步骤同标准曲线操作，测出其OD值。
3.计算
用下式进行计算：
蛋白质含量（mg/ml）=D×
N/V
式中：
D为标准曲线上查出的蛋白质含量（mg/ml）；
N为稀释倍数；
V为蛋白质溶液的体积（ml）。
（五）实验报告
计算所测材料的蛋白质含量。
（六）思考题
试说明Folin—酚法测定蛋白质含量有什么优缺点。
实验19植物组织中可溶性蛋白质含量的测定
第Ⅰ法考马斯亮蓝G–250染色法
一、原理
考马斯亮蓝G–250（Coomassiebrilliantblue，G-250）法是利用蛋白质–染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。
此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质–染料复合物发生聚合并沉淀出来。
此法灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍），易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。
其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
植物材料。
（二）试剂
1.标准蛋白质溶液（100μg/mL牛血清白蛋白）：
称取牛血清蛋白25mg，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸馏水稀释至100mL即可。
2.考马斯亮蓝试剂：
称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90%乙醇中，加入100mL85%（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL，贮于棕色瓶中。
常温下可保存一个月。
（三）仪器设备
分光光度计，离心机，研钵，烧杯，量瓶，移液管，试管等。
三、实验步骤
1.标准曲线的绘制
取6支试管，按表19–1加入试剂，摇匀，向各管中加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度。
以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
2.样品测定
（1）样品提取称取鲜样0.25~0.5g，用5mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min离心10min，上清液备用。
（2）吸取样品提取液1.0mL（视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重复2次），加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。
表19-1绘制标准曲线的各试剂加入量
试剂
管号
1
2
3
4
5
标准蛋白质（mL）
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
蒸馏水量（mL）
蛋白质含量（μg）
20
40
60
80
100
四、结果计算
样品中蛋白质的含量=
（mg/g）
c—查标准曲线值，μg；
VT—提取液总体积，mL；
WF—样品鲜重，g；
VS—测定时加样量，mL。
第Ⅱ法Lowry法（劳里法）
Lowry法是双缩脲法（Biuret）和斐林（Folin）–酚法的结合与发展，其原理是：
蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜–蛋白质的络合盐。
再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。
这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的测定。
Lowry法除使肽链中络氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈，其显色效果比单独使用酚试剂强3~15倍，约是双缩脲法的100倍。
由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。
Lowry法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。
但对于不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理（如加入少量的SDS）。
1.双缩脲法的原理
双缩脲（NH2–CO–NH–CO–NH2）在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。
因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。
双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。
且使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1~10mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约0.5mg以上。
双缩脲法的缺点是灵敏度差、所需样品量大。
干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如Tris缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色沉淀。
2.斐林（Folin）–酚法的原理
该方法是双缩脲法的发展，包括两步反应：
第一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质–铜络合物；
第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关。
在650nm时比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍。
反应约在15min内有最大显色，并至少可稳定几小时。
此法也适用于测定酪氨酸、色氨酸含量。
此法的优点是操作简单，迅速，不需特殊仪器设备，灵敏度高。
其不足之处是此反应受多种因素干扰。
在测试时应排除干扰因素或做空白试验消除。
二、试剂与仪器设备
（一）试剂
Na2WO4·
2H2O，Na2MoO4·
2H2O，85%H3PO4，浓HCl，Li2SO4·
H2O，溴水，酚酞指示剂，Na2CO3，NaOH，CuSO4·
5H2O，酒石酸钾钠，牛血清白蛋白。
1.碱性铜试剂（相当于双缩脲试剂）的制备
首先配制A液：
4%碳酸钠（Na2CO3）溶液与0.2mol/L氢氧化钠（NaOH）溶液等比例混合（2%Na2CO3，0.1molNaOH）；
B液：
1%硫酸铜（CuSO4·
5H2O）溶液与2%酒石酸钾钠溶液等比例混合（0.5%CuSO4·
5H2O，0.1%酒石酸钾钠）。
在使用前将A液与B液按50︰1的比例混合即成。
此为Folin-酚试剂甲液，此试剂只能使用1天。
2.酚试剂（相当于Folin试剂）的制备
称取钨酸钠（Na2WO4·
2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4·
2H2O）25g，加蒸馏水700mL溶解于1500mL的圆底烧瓶中。
之后加入85%的H3PO450mL，浓HCl100mL，安上回流装置（使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来），使其慢慢沸腾10h。
冷却后加入硫酸锂（Li2SO4·
H2O）150g，水50mL，溴水2~3滴，不用回流装置开口煮沸15min，以逐出过量的溴。
待冷却后稀释至1000mL，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存（冷却后溶液呈黄色，倘若仍呈绿色，须再滴加数滴液体溴，继续煮沸15min）。
使用时用标准NaOH溶液滴定，以酚酞作为指示剂，滴定终点由蓝变灰。
滴定后算出酸的浓度。
使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/LH+酸，此为Folin–酚试剂乙液（Folin试剂）。
在测定时要注意，因为酚试剂仅在酸性条件下稳定，但此实验的反应只在pH10的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸–磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。
3.标准蛋白质溶液的配制
称取25mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，使终浓度为250μg/mL。
（二）仪器设备
试管，移液管，定量加样器，圆底烧瓶，冷凝管1套（带橡胶管），微量滴定管，小烧杯，微量进样器50μL1支，分光光度计，恒温水浴器，研钵，玻棒，离心机，离心管。
（1）取7支试管，编号后，分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足1mL，使每管含蛋白量分别为0、25、50、100、150、200、250μg（必要时可做重复）。
（2）在每支试管中用定量加样器加入5mL甲液，混匀，于30℃下放置10min。
（3）在每支试管中喷射加入0.5mL乙液，立即振荡混匀，在30℃下保温30min。
（4）准确到30min后，以不加标准蛋白试管中的溶液为空白，在500nm下用1cm光径的比色杯对系列标准蛋白溶液进行比色，测定光密度值。
以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2.样品的测定
（1）样品的提取与考马斯亮蓝G-250法相同。
取1.0mL（视蛋白质含量适当稀释）样液加入试管中，然后重复步骤1的
（2）~（4），以标准曲线中的0管为空白，测定吸光值。
（2）根据光密度值查标准曲线，求出比色液中的蛋白质含量。
注意：
还原物质，其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。
第Ⅲ法紫外吸收法
由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。
在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。
利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。
因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛应用。
此法的缺点是：
（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；
（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。
不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不相同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。
但可作为初步定量的依据。
0.1mol/LpH7.0磷酸缓冲液。
蛋白质标准溶液：
准确称取经微量凯氏定氮法校正的标准蛋白质，配制成浓度为1mg/mL的溶液。
紫外分光光度计，离心机，刻度移液管。
1.标准曲线法
（1）标准曲线的绘制取8支试管，按表19–2分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。
选用光程1cm的石英比色杯，在280nm波长处分别测定各管溶液的A280值。
以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标,绘制标准曲线。
表19–2绘制标准曲线各试剂加入量
6
7
8
标准蛋白质溶液（mL）
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
4.0
蒸馏水（mL）
3.5
蛋白质浓度（mg/mL）
0.125
0.250
0.375
0.500
0.625
0.750
（2）样品测定样品提取与考马斯亮蓝G-250法相同。
取待测蛋白质溶液1mL，加入蒸馏水3mL，摇匀，按上述方法在280nm波长处测定光吸收并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。
2.其他方法
（1）取适量的样品提取液，根据蛋白质浓度，用0.1mol/LpH7.0磷酸缓冲液适当稀释后，用紫外分光光度计分别在280nm和260nm波长下读取吸光度，以pH7.0磷酸缓冲液为空白调零。
3.计算：
蛋白质浓度=1.45A280–0.74A260（mg/mL）
1.45和0.74—校正值；
A280—蛋白质溶液在280nm处的吸光度；
A260—蛋白质溶液在260nm处的吸光度。
此外，也可先计算出A280/A260的比值后，从表19–3中查出校正因子“F”值，同时可查出样品中混杂的核酸的百分含量，将“F”值代入，再由下述经验公式直接计算出该溶液的蛋白质浓度。
表19–3紫外吸收法测定蛋白质含量的校正因子
A280/A260
核酸（%）
因子（F）
1.75
0.00
1.116
0.846
5.50
0.656
1.63
0.25
1.081
0.822
6.00
0.632
1.52
0.50
1.054
0.804
6.50
0.607
1.40
0.75
1.023
0.784
7.00
0.585
1.36
0.994
0.767
7.50
0.565
1.30
1.25
0.970
0.753
8.00
0.545
1.50
0.944
0.730
9.00
0.508
1.16
2.00
0.899
0.705
10.00
0.478
1.09
2.50
0.852
0.671
12.00
0.422
1.03
3.00
0.814
0.644
14.00
0.377
0.979
3.50
0.776
0.615
17.00
0.322
0.939
4.00
0.743
0.595
20.00
0.278
0.874
5.00
0.682
一般纯蛋白质的光吸收比值（A280/A260）约为1.8，而纯核酸的比值约为0.5。
蛋白质浓度（mg/mL）=F×
A280×
N
F—校正因子；
A280—该溶液在280nm下测得的光吸收值；
N—溶液的稀释倍数。
（2）对于稀蛋白质溶液，还可用215nm和225nm的吸收差来测定浓度。
从吸收差（△A）与蛋白质含量的标准曲线即可求出浓度。
△A=A215–A225
A215、A225—分别是蛋白质溶液在215nm和225nm波长下测得的光吸收值。
此法在蛋白质含量达20~100μg/mL的范围内，是服从Beer定律的。
氯化钠、硫酸铵以及0.1mol/L磷酸、硼酸和三羟甲基氨基甲烷等缓冲液都无显著干扰作用。
但是0.1mol/L乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸以及巴比妥等缓冲液在215nm波长下的吸收较大，不能应用，必须降至0.005mol/L才无显著影响。
由于蛋白质的紫外吸收高峰常因pH的改变而有高低，故应用紫外吸收法时要注意溶液的pH，最好与标准曲线制订时的pH一致。
（3）如果已知某一蛋白质在280nm波长处的吸收值，则取该蛋白质溶液于280nm处测定光吸收值后，便可直接求出蛋白质的浓度。
[思考题]
1.测定植物体内可溶性蛋白质含量有什么意义和用途？
试举二例说明。
2.三种测定方法各有何优缺点？
在实验中如何选择合适的方法并克服其缺点？
3.斐林酚试剂法测定蛋白质含量的原理是什么？
测定中应注意什么问题？
测定蛋白质含量之常规方法介绍
一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法
样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：
NH2CH2COOH+3H2SO4――2CO2+3SO2+4H2O+NH3
（1）
2NH3+H2SO4――（NH4）2SO4
（2）
（NH4）2SO4+2NaOH――2H2O+Na2SO4+2NH3（3）
反应
（1）、
（2）在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。
收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。
如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。
二、双缩脲法（Biuret法）
（一）实验原理
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1~10mg蛋白质。
干扰此测定的物质主要有：
硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材
1.试剂
（1）标准蛋白质溶液
用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/mL的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/mL的A280为0.66来校正其纯度。
如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。
牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/LNaOH配制。
（2）双缩脲试剂
称以1.50g硫酸铜（CuSO4•5H2O）和6.0g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O），用500mL水溶解，在搅拌下加入300mL10%NaOH溶液，用水稀释到1L，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。
此试剂可长期保存。
若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
2.器材
可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
（三）操作方法
1.标准曲线的测定
取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL的标准蛋白质溶液，用水补足到1mL，然后加入4m
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