生物技术遗传学实验指导Word文档格式.docx

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二、实验操作过程中的注意事项

1、认真操作，仔细观察和综合分析实验所出现的现象与结果并及时记录。

2、如果实验结果与理论结果不一致，须及时进行科学分析，判断结果的可靠性，寻找出现误差的原因。

3、各种实验试剂用后放回原处，瓶盖封严，轻拿轻放。

4、使用微量加样器时，一定调整好取用量，按使用要求操作。

5、实验室应保持肃静，注意清洁卫生，实验中用过的废弃物品要及时清理，避免堵塞下水管道。

三、实验后的注意事项

1、实验后，整理清洁所用仪器、设备，注意放回原位，以备下次使用。

2、如有仪器损坏，要及时填写破损报告，并报告老师。

3、离开实验室前，检查并关闭门、窗、水、电。

四、实验室的意外处理

实验室如遇着火、烫伤等意外事件发生，必须镇静做紧急处理，并立即报告老师。

1、着火：

如遇酒精灯推倒或其它原因着火，首先将一切易燃品移至远处，然后用水扑灭或者切断电源。

2、火伤：

皮肤被火灼伤，用烫伤软膏涂抹，如伤势较重，立即送医院治疗。

3、如有毒药品泼溅到皮肤上，如EB，同位素等，应用大量清水进行清洗，必要时，去医院处理。

4、割伤出血：

遇玻璃割伤出血，可用碘酒或红药水消毒后，用纱布包扎。

如有玻璃留在伤口，处理前应先取出。

实验一人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备

【目的要求】

1、初步掌握人体外周血淋巴细胞短期培养的基本方法。

2、初步掌握人体外周血淋巴细胞染色体标本制备的技术方法

【实验原理】

人体外周血淋巴细胞培养（人体末梢血、微量全血短期培养）及其染色体标本制备是国内外研究显示染色体最常用和效果最好的方法。

此方法取材方便，用血量少，操作简便，现已广泛应用于基础医学、临床医学的研究和染色体病的诊断等。

人体外周血中的小淋巴细胞，是已分化、处于G0期的细胞，几乎不具有分裂增殖能力。

在离体血培养细胞中很难找到正在分裂的淋巴细胞，因此，需采用刺激细胞增殖的措施。

人们发现从云豆（菜豆）中提取的植物血球凝集素（植物血凝素，PHA）可以刺激小淋巴细胞进行有丝分裂，即在PHA作用下，处在G0期的小淋巴细胞可转化为淋巴母细胞。

淋巴母细胞具有分裂能力，重新进入增殖周期进行有丝分裂。

在PHA作用下体外培养72小时左右，多数淋巴细胞已处于细胞周期的第二周期。

此时，细胞分裂相较多，但都处于分裂的不同时期。

一般来说，制作染色体标本主要是显示细胞分裂中期染色体，因中期染色体形态最为典型、最为清晰，最易辨认，是研究染色体的最好阶段。

为了获得大量可供分析的中期染色体，需在终止细胞培养前数小时加入适当浓度的有丝分裂阻断剂——秋水仙素（或其衍生物秋水仙胺）。

它可特异地抑制纺锤丝的形成、阻抑分裂中期活动而使细胞分裂停滞于中期。

借此可获得大量中期分裂相细胞。

在进行染色体标本制备的过程中，首先要进行低渗处理，使细胞体积胀大、染色体松散开而便于观察分析。

最常用的低渗液为0.075mol／L的KCl，也可用水或1％枸橼酸钠等。

低渗后的细胞需用固定液固定。

醋酸固定液具有膨胀、固定作用。

它和醇类混合固定，有利于染色体松散，可获得分散好、易于分析的分裂中期染色体标本。

现在常用的固定液为甲醇-冰醋酸（3:

1）固定液。

【实验准备】

1、试剂

RPMI-1640营养液、小牛血清、0.25％胰蛋白酶、Hanks液、双抗（青霉素、链霉素）、

2％碘酒、75％酒精、3.8％NaHC03、520U／mL肝素、40μg／mL秋水仙碱、PHA、0.075mol／LKCl低渗液、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液、二甲苯和香柏油等。

2、器材

超净工作台、光学显微镜（附照相设备）、隔水式恒温培养箱、离心机、冰箱、高压蒸汽消毒锅、鼓风干燥箱、无菌正压滤器、分析天平（感量1／10毫克）、架盘天平、链霉素培养瓶及瓶塞、肝素小瓶及瓶塞（取血用）、10mL吸管、直头小吸管、5mL刻度离心管、2mL或5mL一次性注射器、量筒、烧杯、搪瓷盆、搪瓷盘、试管架、片盘、片盒、止血带、棉签、大吸球、小吸头、pH试纸、废液缸、解剖剪刀、镊子、记号笔、40C预冷的载玻片、酒精灯、火柴、染色缸或染色玻璃板和擦镜纸等。

【实验材料】

人静脉血

【实验内容、方法】

一、采血

在采血前，对各种用品进行清洗、无菌处理，配制、分装并冻存培养液（5mL／瓶），用5mL注射器抽取肝素0.1mL，备用。

常规消毒肘部皮肤，用抽取肝素的注射器静脉采2mL，轻轻摇匀，待接种培养。

二、接种培养

将事先配制冻存的装有5mL培养液的链霉素培养瓶或其它培养瓶从冰箱中取出，置室温融化，每瓶滴入约0.3mL肝素抗凝血，轻轻摇匀，置370C培养箱培养72小时。

三、积累分裂中期细胞

在终止培养前2小时，于培养瓶内加入浓度为20μg／mL秋水仙素1滴，终浓度为0.1-0.15μg/mL，摇匀，置370C温箱继续培养2小时后收集细胞、制片。

四、制片

1、收集细胞：

从培养箱中取出培养瓶，用小吸管将培养物吹打均匀，移人5ml刻度离心管内，以2000r／min离心10分钟，吸去上清液，保留底物。

2、低渗：

每管加入370C预温的0.075mol／LKCL溶液4ml，用吸管轻轻吹打均匀，置370C水浴锅中低渗30分钟，以达到红细胞破坏、淋巴细胞膨胀和染色体分散之目的。

3、预固定：

低渗处理后，每管加入1mL甲醇：

冰醋酸（3:

1）固定液，将细胞轻轻吹打均匀，置离心机2000r／min离心10分钟。

4、固定

（一）：

去上清液，加固定液5mL，吹打均匀，固定30min,2000r／min离心10分钟。

5、固定

（二）：

去上清液，再加入5mL固定液，吹打均匀，再次固定30min，2000r／min离心10分钟。

6、滴片：

去上清液，留底物，每管加入少许（约0.2mL）固定液，将底物吹打均匀，制成细胞悬液。

然后用吸管吸取混匀的细胞悬液，约以20cm或更高的距离滴至预冷的载玻片上，每片约2～3滴，随即将玻片在酒精灯火焰上微烤（一过性微烤数次），以助细胞、染色体分散，使之均匀平铺于玻片上。

将制片放人片盘，空气干燥后，收集于片盒中。

7、染色和观察：

待制片晾干后，放入约1:

10Giemsa染液的染色缸中染色15分钟左右，或架在染色用玻璃板上扣染15分钟左右（扣染是指染色时，将染色体制片的细胞面朝下，架在玻璃板上，将染液滴入玻璃板和细胞面之间），自来水轻轻冲洗，晾干后光镜下观察。

先用低倍镜观察后，选择分散好的染色体换为高倍及油镜观察，注意人类核型中近端、亚中和中着丝粒染色体的形态特点。

【注意事项】

1、有关淋巴细胞培养的注意事项同实验十二。

2、PHA的质量是人体外周血淋巴细胞培养成败的关键，不同来源或同一厂家的不同批号、不同的保存时间，PHA的效价可能会有较大的差异，直接影响培养细胞中分裂细胞的数量。

故每批PHA正式使用前，须进行一次预实验，摸索PHA的质量和使用量。

其使用量不宜过大，否则会导致红细胞凝集。

一般，自己直接从菜豆中提取的PHA效果较好。

3、接种的血样标本愈新鲜愈好。

肝素用以抗凝，用量不宜过多。

4、秋水仙素用量和作用时间要适当。

该药有强烈的毒性作用，用量过大、作用时间过长，可使染色体缩短和发生异常分裂现象，甚至染色体破碎。

5、低渗是制片好坏的重要环节。

低渗液用量的多少与作用时间的长短都会影响染色体的制片质量，如染色体分散不好、有胞浆背景，或细胞破损、染色体丢失等。

要注意低渗液使用前需370C温箱预温。

6、低渗后的预固定也很重要，预固定时，固定液量不要多，加入固定液后要立即用吸管吹打均匀，用力不要过猛。

另外两次固定时，固定液也不要过多，吹打时用力也不要过猛，以免细胞破碎，染色体丢失。

固定液要在使用时配制。

7、最后的滴片也是染色体制片好坏的很关键的一步。

载玻片上有油污或预冷不够，或滴片时所滴悬液重叠、操作不好，或底物悬液过浓等都直接影响细胞、染色体的分散。

底物悬液过稀或酒精灯上烤片时间太长，都可能造成制片中可供分析用的染色体很少，甚至找不到染色体。

【实验报告】

1、血培养中PHA所起的作用是什么?

秋水仙素的作用是什么?

2、简述血培养和外周血淋巴细胞染色体标本制备的过程。

1、初步掌握实验动物骨髓细胞染色体标本的一般制备方法（直接法）。

2、了解小白鼠染色体的形态特征及其数目。

骨髓细胞具有旺盛的分裂增殖能力。

在骨髓细胞中，有丝分裂细胞所占的比例比一般细胞大。

为了积累更多的有丝分裂中期细胞，可在收集细胞前进行秋水仙素处理。

通过制备的骨髓染色体标本，可以观察毒性物质在体内对细胞染色体的影响。

同时，在检测环境致突剂方面，也有其独特的优点。

方法简捷、直接，易于掌握，一般实验室均可进行。

因此，此法也是用动物实验检测有害物质对机体遗传物质损伤的实验方法之一。

0.04％秋水仙素、0.075mol／LKCl、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液、香柏油、二甲苯等。

光学显微镜、恒温培养箱、离心机、架盘天平、酒精纱布及其它一般用品。

健康小白鼠（体重约20克）

1、取材和低渗

取材前3～4小时，于小鼠腹腔内注入0.04％秋水仙素0.1mL／10g体重，以积累中期分裂相。

断颈髓法处死小鼠，取其股骨，用酒精纱布清除其上粘附的肌肉及结缔组织，并用剪刀剪去股骨两端少许骨骺及骨皮质，暴露骨髓质，用注射器抽取0.075mol／LKCl5mL冲洗骨髓腔，将冲洗后的液体收集到5mL离心管中，反复冲洗两次以上，至骨髓腔变白为止，将冲洗液吹打均匀后置370C恒温箱低渗处理20分钟。

2、预固定

取出低渗后的离心管，加入2～3滴预固定液（甲醇:

冰醋酸=3:

1），立即吹打均匀，平衡后用离心机2500r／min离心5分钟，去上清液，留底物。

3、固定一

加固定液5mL于离心管中，吹打均匀，室温固定10分钟后，2500r／min离心5分钟。

去上清液，留底物。

4、固定二

再加固定液5mL于离心管中，吹打均匀，室温固定10分钟后，2500r／min离心5分钟。

倾去上清液，加入少许（约0.5mL）固定液。

5、滴片

将沉淀物吹打均匀后，吸于滴管内，滴在预冷的载玻片上，每片2～3滴，酒精灯上烘烤一下，放在片盘上，晾干后装入片盒中。

6、染色和观察

1:

10的Giemsa染液染色15分钟后，自来水冲洗。

待制片干燥后置显微镜下观察。

小鼠染色体形态数目与人类染色体不同，小鼠全部为端着丝粒染色体，2n=40。

1、在用酒精纱布处理股骨上的软组织时，不要使组织块掉入离心管中。

2、可参照实验十四染色体标本制备过程中的注意事项。

1、小白鼠腹腔内提前注射秋水仙素的意义是什么?

2、叙述小鼠骨髓细胞染色体标本的制备过程（直接法）。

初步掌握染色体G显带制备的基本方法。

自20世纪60年代末以来，染色体显带技术得到了很大的发展。

人们用物理、化学的方法处理染色体标本，再用染料对染色体进行分化染色，使其呈现出明暗相间或深浅不同的带纹。

这一技术的应用，可以准确识别23对不同类型的染色体，并能识别同一号染色体上的不同区带。

从而提高了染色体核型分析的精确度，为临床上某些疾病的诊断提供了有效的手段。

关于G带的形成机理，迄今尚不十分清楚。

有人认为，在胰酶的作用下，蛋白质不均匀丢失是G带产生的原因。

在染色体上的蛋白质经处理而丢失后，这些区域呈现出浅染（浅带）。

染色体上蛋白质和DNA结合牢固的区域，由于蛋白质丢失少而呈现深染（深带）。

还有人认为，染色体经蛋白酶消化后，染色体的核蛋白破坏，这些区域裸露的DNA分子的磷酸基团能与吉姆萨染料中的天青和甲基蓝等噻嗪分子结合而使染色体着色。

也有人认为，染色体上T—A和C—G碱基的含量和分布不同，也与染色体上深浅带的形成有关。

A—T碱基对较多的区域，易与吉姆萨染料结合而染成深色区带；

而G—C碱基对较多的区域则相反，染成浅染区带。

总之，目前说法较多，但主要概括了三种观点，即显带是由于:

①DNA的作用；

②蛋白质的作用；

③DNA、染料和蛋白质三者之间相互作用的结果。

这些都有待于进一步研究探讨。

可以肯定，G显带具有很多优点，如制备方法简便易行，标本可长期保存，带纹清晰，成本低廉，制备周期短，普通光学显微镜即可观察。

故已成为当今细胞遗传学与分子细胞遗传学领域中应用广泛的一种技术，并成为研究分析染色体的主要常规方法之一。

1、试剂：

0.85％生理盐水、0.025％胰蛋白酶溶液、吉姆萨染液、3.8％NaHC03、二甲苯、松柏油等。

2、器材：

普通光学显微镜、370C水浴箱、普通冰箱、立式染缸、直头小吸管、橡皮吸头、pH试纸、吸水纸（滤纸）、扣染玻璃板、擦镜纸、镊子等。

人类中期染色体标本制备用试剂和器材同实验十四。

常规方法制备的人类中期染色体标本制片（片龄3～5天最宜）。

1、首先将配制好的0.025％胰酶溶液装入立式染色缸中,调pH值至7.0～7.2,放人370C恒温箱中预温。

2、取染色体制片一张置胰酶缸中处理15秒左右，迅速投入0.85％生理盐水缸中漂洗数秒（可准备两缸盐水，做两次漂洗）。

3、用自来水稀释的吉姆萨染液（自来水:

吉姆萨原液=8:

1）扣染20分钟。

4、将标本用流水冲洗、晾干，必要时封片、镜检。

镜检时，先在低倍镜下选择分散好、长度适中的分裂相，然后转换油镜观察其显带情况，选择显带好的标本进行G显带核型分析。

1、染色体制片胰酶处理前，需370C温箱烤片一天左右。

如滴片后当天进行G显带，可在滴片后置800C烤箱烤片两小时。

2、胰酶预温时要注意预温温度，温度过高时胰酶变性失效。

3、胰酶溶液需在使用前配制。

染色体在胰酶中的处理时间可因制片质量、片龄而不同。

在不同个体的染色体制片中也可有差异。

此外，不同厂家生产的胰酶或不同批号的胰酶，在处理时间上都可有差别，故每次进行染色体G显带时，最好先试做一张制片，分段并用不同时间处理，摸索胰酶处理时间，以保证获得最好的染色体G显带标本。

1、G显带过程中应注意哪些问题?

2、简述染色体G显带标本制备的基本方法。

1、初步掌握染色体C显带的制备方法。

2、熟悉1号、9号、16号和Y染色体C带的带型特征。

C显带技术是一种染色体局部显带技术。

染色体经碱、酸、盐处理后，再经Giemsa染色，呈现出特有的着丝粒、次缢痕区及Y染色体长臂远侧段等的结构异染色质区深染，称为C带。

此区域的DNA多为高度重复序列，并仅与组蛋白紧密结合，因而保护了C带区的异染色质免受酸、碱、盐破坏，并易被Giemsa深染。

如该区域的DNA一旦发生变性，在改变变性条件后，即可快速复性，这是高度重复序列DNA所具有的特性。

其它部位的DNA一旦被碱破坏变性后，不易发生复性，或复性较慢，因此，不易被Giemsa着色。

所以，染色体两臂的常染色质部分仅显示出浅淡的染色体轮廓。

优良的C带标本，可使结构异染色质区着色很深。

在人类染色体中，染色体的着丝粒区、第1、9、16号染色体的次缢痕区和Y染色体长臂的远侧段明显深染。

因此，利用C带，可以准确地识别这些染色体，并可确定着丝粒的位置和数目，还可配合其它显带技术对染色体某些结构异常、Y染色体异常及性别，做出准确的诊断。

不同个体、种族，C带的大小和染色的强度不同，呈现出多态性，故C显带技术在多态性研究和鉴别染色体来源等方面具有一定的意义。

5％～10％饱和Ba（OH）2、0.1mol／LHCl、蒸馏水、70％、80％、95％酒精和纯酒精、2×

SSC溶液、Giemsa染液、香柏油或石蜡油、二甲苯等。

光学显微镜、恒温水浴箱、温度计、立式染缸、镊子、扣染用玻璃板、小吸管、50mL量筒、擦镜纸等。

常规方法制备的人类中期染色体标本制片。

1、将染色体制片投入580C饱和Ba（OH）2中5分钟。

2、取出标本置0.1mol／LHCl中漂洗。

3、蒸馏水漂洗数次。

4、酒精脱水：

70％酒精→80％酒精→95％酒精→纯酒精（每个浓度5分钟），空气干燥。

5、置650C2×

SSC溶液中温育1.5～2小时。

6、Giemsa染色20分钟，自来水冲洗，空气干燥，显微镜下观察。

将干燥后的标本置显微镜低倍镜下观察，找到分散好的、染色体长度适宜的分裂相，换油镜观察。

注意观察各染色体的着丝粒区深染，尤其是第1号、9号、16号染色体着丝粒区及次缢痕区深染，两者合在一起形成明显大的C带，Y染色体长臂远侧段约1/2～2/3区段深染，C带明显。

第1、9、16号染色体和Y染色体长臂的C带具有多态性。

1、片龄不宜过长，否则影响C带质量。

2、制片从饱和Ba（OH）2中取出时要迅速投入0.1mol／LHCl中，以免Ba（OH）2的沉淀物粘贴在玻片上影响C带的观察。

3、染色浓度及时间不宜过高过长，以免影响C带的质量。

1、简述染色体C显带标本制备的基本方法。

2、在C显带标本中，你能辨认第1、9、16号及Y染色体吗?

它们的C带特点与其它各号染色体有什么不同?

1、初步掌握人类染色体核仁形成区银染标本的制备方法。

2、熟悉核仁形成区的所在部位。

人类D组和G组染色体的随机柄部次缢痕区，称为核仁形成区（NOR），与核仁形成有关。

硝酸银染色技术，使具有活性的核仁形成区特异地染成黑色。

这种银染色阳性的NOR称为Ag—NOR，是具有转录活性的rDNA部位。

现已证明，这里是具有转录活性的18SrRNA和28SrRNA基因的所在部位。

此处常伴有丰富的酸性蛋白质，而这种蛋白含有较多的—SH基团和二硫键，易使硝酸银中Ag+还原为Ag颗粒，从而使有转录活性的核仁形成区镀上银颗粒而呈现出黑色区域，故被银染的不是rDNA本身而是酸性蛋白质。

没有转录活性的NOR则不着色。

对Ag—NOR出现频率进行计数，可以了解有活性的rRNA基因（rDNA）的动态变化，估计rDNA的转录活性。

人类细胞中的Ag—NOR数目及其在染色体上的位置都是比较稳定的，如发生改变，说明细胞内rRNA基因活性发生变化。

现认为，该技术是研究18SrRNA和28SrRNA基因分布和转录活性的一种简易有效的方法，并已广泛地用于肿瘤细胞遗传学、体细胞遗传学、进化遗传学和临床细胞遗传学等领域。

50％硝酸银、明胶—甲酸液、Giemsa染液、蒸馏水。

光学显微镜、恒温水浴箱、小吸管、小吸头、盖玻片、擦镜纸。

人外周血淋巴细胞染色体标本制片（片龄在一周以内）。

1、先吸取50％AgN03两滴滴在染色体标本制片上，然后加入明胶—甲酸液3滴，轻轻来回摇晃混匀，盖上盖玻片。

2、将玻片平置于沸水水浴箱的铁板上1～2分钟，待玻片变金黄色，立即用自来水冲洗，以冲掉盖玻片。

3、以5％Giemsa染液复染10分钟，自来水冲洗，空气干燥，显微镜下观察。

Ag—NOR计数：

选择分散好、数目全的中期分裂相染色体，计数D组6个和G组4个近端着丝粒染色体Ag-NOR的数目。

凡有银染点的近端着丝粒染色体，不论单侧或双侧的，都计数为一个银染的染色体。

1、硝酸银溶液应在临用前配制。

配制及使用时，注意不要溅到四周，以免形成很难除掉的黑色污点。

2、掌握好银染温度，温度越高，反应速度越快。

1、仔细观察Ag—NOR形态、数目及其在染色体上的位置。

2、了解NOR银染的原理。

1、通过G显带核型分析，掌握G显带核型分析方法并初步掌握各号染色体的带型特征。

2、与非显带核型分析进行比较，认识G显带核型分析，能准确的识别每一条染色体。

染色体标本用适当浓度的胰蛋白酶溶液处理，再用Giemsa染液染色，在染色体上显出深浅交替的横纹，为G带。

通过显示G带，不仅可以准确区分每一条染色体，还可检测出染色体的微小结构异常。

人类G显带染色体核型分析是染色体研究中最重要和最常用的方法。

它可根据染色体的数目、结构进行核型分析，而对染色体病患者做出准确的诊断。

可在显微镜下直接进行分析，也可进行显微照相，经冲洗、放大后，根据照片进行分析。

根据丹佛（Denver）及伦敦（London）会议提出的标准，按照每条染色体的特异带型，将照片上的染色体按其轮廓剪下，进行配对、分组、排列，并贴在报告纸上。

人体细胞含有46条染色体，即23对，其中22对为常染色体，男、女相同，编为1～22号。

另一对为性染色体，男、女有别，男性为XY，女性为XX。

X染色体编入C组，Y染色体编入G组。

在剪接粘贴时，性染色体可单独排列。

核型分析后，将其分析结果按国际标准进行描述。

剪刀、镊子、核型分析纸、直尺、胶水、铅笔和橡皮。

正常人外周血淋巴细胞G显带中期分裂相照片。

一、正常人类染色体G带带型识别的主要特征

A组染色体

包括第1～3号染色体，其长度最长。

1号和3号染色体的着丝粒均在1／2处，2号染色体的着丝粒约在3/8处。

1号染色体

短臂：

在分裂中期显示的320条带左右的分裂相上，近侧段有二条深带，第2条深带稍宽，在处理较好的标本上，远侧段可显示3～4条淡染的深带。

此臂分为三个区，近侧的第1条深带为2区1带，第2条深带为3区1带。

长臂：

副缢痕紧贴着丝粒，着色深度大小不一，其远侧为一宽的浅带。

近中段与远侧段各有两条深带，中段两条深带稍靠近，其中第2条深带染色较浓。

此臂分为4个区，副缢痕远侧的浅带为2区1带，中段第2条深带为3区1带，远侧段第1深带为4区1带。

2号染色体

可见4条深带，中段的两条深带稍靠近。

此臂分为2个区，中段两条带之间的浅带为2区1带。

有4～7条深带，第3和第4深带有时融合。

此臂分为3个区；

第2和第3深带之间的浅带为2区1带，第4和第5深带之间的浅带为3区1带。

3号染色体

着丝粒染色较浓。

在长臂和短臂的近中段各具有一条明显而宽的深带。

一般在近侧段可见一条较宽的深带，远侧段可见两条深带，其中一条较窄，且着色淡，这是区别3号染色体短臂的显著特征。

在处理较好的标本上，近侧段的深带可分为两条深带。

此臂分为2个区，中段浅带为2区1带。

一般在近侧和远侧各有一条较宽的深带，在显