医药行业生物制品工艺验证Word文件下载.docx

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②2-甲氧/乙氧基反义寡核苷核酸；

③肽核酸（PNA）;

④其他。

重组激素类

①多肽蛋白类激素；

②类固醇激素；

③氨基类激素；

④脂肪酸的衍生物类激素。

不同类型的生物制品所涉及的生物技术及生产工艺相当复杂，国家对生物制品的生产及质量管理要求特别严格，在生产工艺验证方面也存在着一定的难度和挑战。

生物制品的工艺验证常指与生物产品加工生产过程有关的验证活动。

本节将以单克隆抗体的生产工艺验证进行举例说明。

6.4.2单克隆抗体生产的工艺流程

单克隆抗体生产工艺流程简单的可以分为上游（Up-stream）、下游（Down-stream）、制剂（Product）三个部分，如图6-4-1所示。

6.4.2.1单抗上游生产工艺简介

（1）细胞库的建立

单克隆抗体生产常用CHO细胞，CHO细胞是中国仓鼠卵巢（ChineseHamsterOvary,CHO）细胞，1957年美闺科罗拉多大学Dr.TheodoreT.Puck从一只成年雌性仓鼠卵巢离获得，为上皮贴壁型细胞。

CHO细胞可像微生物细胞一样，在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养。

在单克隆抗体药物生产中，对于细胞库的管理是非常严格的，一般将细胞库分为三级管理，即原始细胞库、主细胞库及工作细胞库。

①原始细胞库（PrimaryCellBank，PCB）

由一个原始细胞群体发展成传代稳定的细胞群体，或经过克隆培养而形成的均一细胞群体，通过检定证明适用于生物制品生产或检定。

在特定条件下，将一定数量、成分均一的细胞悬液，定量均匀分装于一定数量的安瓿或适宜的细胞冻存管，于液氮或-130°

C以下冻存，即为细胞种子，供建立主细胞库用。

对于引进细胞，生产者获得细胞后，冻存少量细胞，经过验证可用于生物制品生产，此细胞可作为细胞种子，供建立主细胞库用。

②主细胞库（MasterCellBank，MCB）

也称种子细胞库，取原始细胞通过规定的方式进行传代、增殖后在特定倍增水平或传代水平同次均匀混合成一批，定量分装于一定数量的安瓿或适宜的细胞冻存管，保存于液氮或-130°

C以下，经全面检定合格后，即可作为主细胞库，用于工作细胞库的制备，生产企业的主细胞库最多不得超过两个细胞代次。

③工作细胞库（WorkingCellBank，WCB）

工作细胞库的细胞由主细胞库细胞传代扩增制成。

由主细胞库的细胞经传代增殖，达到定代次水平的细胞，合并后制成一批均质细胞悬液，定量分装于一定数量的安瓿或适宜的细胞冻存管，保存于液氮或-130°

C以下备用，即为工作细胞库。

生产企业的工作细胞库必须限定为一个细胞代次。

冻存时细胞的传代水平须确保细胞复苏后传代增殖的细胞数量能满足生产一批或一个亚批制品。

复苏后细胞的传代水平应不超过批准用于生产的最高限定代次。

所制备的工作细胞库必须经检定合格后，方可用于生产。

（2）细胞的复苏、传代与种子扩增

①细胞复苏与传代

将种子放置在恒温的水浴锅中，一般温度控制在35°

C左右，预热30min，将工作细胞库细胞进行解冻复苏，根据工艺要求控制解冻时间，然后将解冻细胞加入至培养基中，离心分离后转入摇瓶中（如250mL），进行摇瓶传代。

注意控制CO2浓度、培养温度、培养时间等因素，同时也要根据工艺的要求控制接种的密度，控制细胞活率等要求。

将上述的复苏种子细胞按照一定的密度稀释至新摇瓶中（如500mL/2000mL），控制温度、CO2浓度、溶氧浓度、培养温度、培养时间、摇床摇摆速度、pH等因素，逐渐扩增细胞数量至满足一级种子罐的接种要求。

②一级种子培养

将摇瓶种子细胞按照一定的密度接种到一级种子罐内（如20L），控制温度、CO2浓度、溶氧浓度、培养温度、培养时间、搅拌速度、pH、培养基等因素，逐渐扩增至细胞数量满足二级种子罐的要求。

③二级种子培养

将一级种子按照一定的密度接种到二级种子罐内（如50L），控制温度、CO2浓度、溶氧浓度、培养温度、培养时间、搅拌速度、pH、培养基等因素，逐渐扩增至细胞数量满足三级种子罐的接种要求。

④三级种子培养

将二级种子按照一定的密度接种到三级种子罐内（如100L），控制温度、C02浓度、溶氧浓度、培养温度、培养时间、搅拌速度、pH、培养基等因素，逐渐扩增至细胞数量满足细胞发酵培养的接种要求。

（3）细胞大规模培养

种子扩增后要进入细胞大规模培养阶段，注意控制温度、CO2浓度、溶氧浓度、培养温度、培养时间、搅拌速度、pH、培养基等因素。

细胞培养结束后，可采用离心分离或澄清过滤等方法进行抗体蛋白的分离纯化。

6.4.2.2单抗下游生产工艺简介

下游生产工艺即为单克隆抗体纯化的过程。

在单抗药物的生产过程中，多采用色谱法进行产品与杂质的分离纯化。

色谱又称色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分离。

1906年Tswett研究植物色素分离时提出色谱法概念；

他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加人石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。

按光谱的命名方式，这种方法因此得名为色谱法。

以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。

按照固定相形状可将色谱法分为柱色谱、纸色谱及薄层色谱法。

（1）单克隆抗体生产中常用的纯化方法

①亲和层析法

粗提纯化当中常用到的纯化方法。

利用生物分子之间的专一识别性或特定的相互作用的分离技术称为亲和分离技术。

在该技术中，亲和分离过程是通过引入亲和配基得以实现（图6-4-4）。

所谓亲和配基，是指具有对生物分子专一识别性或特异相互作用的物质。

将亲和配基固定在不同的介质上，可实现不同的亲和分离技术，如固定在层析介质上，达到专一性层析分离的技术称为亲和层析技术。

将亲和配基接在分离膜上，实现亲和膜分离技术。

目前常用到的亲和层析填料有ProteinASepharose、ProteinGSepharose、MabSelect、MabSelectXtra、MabSelectSure等。

②疏水层析法

疏水层析（HydrophobicInteractionChromatography，MIC）法是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和杂质的一种较为常用的方法。

蛋白质的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。

不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质等生物大分子的。

常用到的层析填料主要有PhenylSepharoseFF、OctylSepharoseFF、ButylSepharoseFF等。

精制纯化常用到此方法。

P：

固相支持物

L：

疏水性配体

S：

蛋白质或多肽等生物大分子

H：

疏水补丁

W：

盐溶液

通过降低流动相的离子强度.

疏水作用弱（即亲水性强）的物质，

用高浓度盐溶液洗脱时，会先被洗下来

当盐溶液浓度降低时，疏水作用强的物质才会随后被洗下来。

（相同盐浓度下.疏水作用弱的的物质先被洗下来.疏水作用强的物质随后被洗下来）

③离子交换层析法

离子交换层析（IonExchangeChromatography，IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。

离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。

常用的离子交换层析的填料有CaptoFamily系列、DEAESepharoseFF、QSepharoseFF、SPSepharoseFF、CMSepharoseFF等。

图6-4-6为离子交换层析原理图

图6-4-6离子交换层析原观图

④超滤浓缩

超滤（Ultrafiltration）技术是一种膜滤法，也有错流过滤（CrossFiltration）之称。

它能从周围含有微粒的介质中分离出10〜100

的微粒，这个尺寸范围内的微粒，通常是指液体内的溶质。

其基本原理是在常温下以一定压力和流量，利用不对称微孔结构和半透膜介质，依靠膜两侧的压力差作为推动力，以错流方式进行过滤，使溶剂及小分子物质通过，大分子物质和微粒子，如蛋白质、水溶性高聚物、细菌等被滤膜阻留，从而达到分离、分级、纯化、浓缩目的的一种新型膜分离技术。

图6-4-7为超滤浓缩原理图

图6-4-7超滤浓缩原理图

（2）单克隆抗体纯化策略

每个单抗等电点、电荷密度、疏水性、糖基化程度等生化性质各不相同。

选择单抗的纯化方法，既要了解它们的共性，又要了解个性，从而制定相应的纯化策略。

同时也针对不同抗体和其生产宿主的特性制定纯化策略，见表6-4-1和表6-4-2。

表6-4-1单抗基本特性及纯化策略

生化性质

单抗特性

纯化策略

分子量

lgG150-170KD（重链50KDa，轻链25KDa）

lgM约为900KD（五聚体）

单抗样品浓缩一般选择30KD或50KD的超滤膜。

分子筛层析Superdex200或SephacrylS-300，能有效去除抗体聚集体。

选择超滤膜和分子筛介质时除了分子量还须考虑单抗不同亚型（Subclass）的空间结构和形状，如人lgG3较细长，需耍选分子摄较小的超滤膜

GEHC新一代超滤膜孔径更均一，可以使用更大孔径（50〜100KDMWCO）超滤膜进行抗体的浓缩而保持极高的收率，在浓缩单抗的同时，有效地去除大量蛋白酶（多为60〜70KD）和BSA等杂质，从而避免了纯化过程中蛋白酶对抗体的破坏，使终产品更均一，比活力更好

等电点

从pH4.0到9.0不等，大部分超过pH6.0

大多数IgG等电点高于一般血清蛋白，建议用阳离子交换层析捕获浓缩抗体或流穿模式的明离子交换层析以除去大部分杂蛋内、DNA和内毒素。

注意:

CHO细胞表达的基因工程抗体（Gab）由于细胞培养过程带来的糖基化的不均一以及后期的脱氨基脱酰胺等作用，存在着等电点不同的多种抗体变体，离子交换层析根据带电性质的不同可以有效去除这些变体,使产品性质更均一

疏水性

大多数lgG疏水性较强

大多数IgG可以在0.5〜1.0mol/L硫酸铵结合疏水介质，让大部分杂蛋白流穿。

单抗在硫酸铵30%〜50%时会沉淀，可重溶后直接上疏水层析。

不同抗体疏水性程度也不相同，如用Source15PHE可除去含血清培养基中的牛IgG

糖基化

IgG含2%〜3%糖基，IgM含12%糖基

主要在重链的Fc区产生N-link的糖基化。

注意：

抗体糖基化不均一，所带电荷也不同，IEF等点聚焦电泳呈多条带，会影响离子交换层析效果

pH稳定性

稳定性较好

IgG在水溶液或一般的缓冲液中都比较稳定。

但应避免较极端的pH，如低pH促使蛋白聚集；

pH>

8.5,脱酰胺酶可能降解单抗

多聚体、复合物的形成

没有保护剂的情况下IgG浓度高于2mg/mL容易形成二、多聚体

pH、盐浓度、缓冲液种类、温度等都会影响抗体的聚集动力学。

如PH<

3，抗体会发生不可逆聚集；

盐浓度过高增强疏水聚集；

碱性单抗在多价阴离子缓冲液中易形成稳定的离子复合物，导致抗体之间的聚合；

在0.3〜1.0mol/LNaCl中，单抗与核酸可形成可逆的复合物，离子交换层析纯化时须留意

溶解度

大多数IgG在中性偏碱和低电导的缓冲液中是稳定可溶的

有些单杭在温度低于37°

C时溶解度会降低，易结品，纯化过程避免冷室操作

表6-4-2针对不同宿主生产抗体的纯化策略

抗体生产宿主

优/缺点

主要相关杂质

针对宿主特性的纯化策略

鼠/兔等动物

直接免疫动物，方法成熟，产量可达1〜15g/L。

单抗亲和力高，但生产周期长，难以大量生产

动物腹水各种生物大分子、脂类

由于HAMA反应，鼠源单抗大多仅用于诊断试剂，规模较小，产品纯度要求较低（电泳纯90%〜95%）。

ProteinA或G亲和层析配合分子筛Superdex200或SephacrylS-300—般已可以达到所需纯度

杂交瘤细胞

5%〜10%小牛血清培养表达量10g/L，但纯化困难，并有动物源污染风险。

无血清培养表达量可达1〜4g/L

培养基内的杂蛋白，如血清白蛋白、转铁蛋白、酶、小牛IgG、脂类以及宿主蛋白和DNA

用于诊断试剂和治疗性单抗，后者纯度要求较高（95%〜99%）。

需要多步、多维层析去除宿主杂质。

转铁蛋白、牛IgG与目标抗体性质接近，污染问题十分显著。

一般可通过优化疏水层析和离子交换层析去除。

若白蛋白的量较多，可先用白蛋A、蛋甶G等亲和层析法直接捕获抗体

CHO/NSO等哺乳动物细胞

利用基因工程技术将抗体人源化。

目前上万升发酵罐的单抗表达量可达1〜10g/L

宿主、培养基内的杂蛋白、核酸、脂类等

主要为治疗性单抗。

临床剂量大（数十至几百毫克/dose），批产量达公斤级，纯度要求极高（＞99%）。

约80%的下游工艺用ProteinA亲和层析如MabSelectFamily进行快速捕获，再配合离子交换、疏水层析等进行精纯.以达到治疗用要求

E.coli

利用基因工程技术表达人源化小分子抗体（Fab，SeFv）、特殊抗体及抗体融合蛋白。

相比动物细胞，生产周期短，成本较低，怛与相应抗原结合靶点减少

宿主杂蛋白、核酸、脂类、内毒素等

对于E.coli表达的蛋内，可以使用中空纤维结合层析进行纯化。

不同孔径的中空纤维膜广泛用于菌体收集、裂解液澄清和包涵体洗涤，完全代替离心机，收率高成本低。

经过中空纤维洗涤的包涵体可考虑用Sepharose4FF先纯化包涵体，再进行柱上复性，提高回收率。

也可用中空纤维膜做透析复性，不但容易放大，而且效率更高。

融合蛋白可考虑GST或HisTag表达系统,用GSTSepharose或螯合了镍离子的ChelatingSepharose纯化。

两者都可进行柱上酶切

酵母

Pichia

Pasioris

表达量高，培养规模容易放大，相比动物细胞成本低；

糖基化仍然存在问题影响比活，难以表达全分子抗体

宿主细胞蛋白及培养基中蛋白

用中空纤维膜做样品的澄淸，之后用离子交换结合疏水层析进行纯化

转基因动物

可表达全分子抗体，能正确糖基化；

但转基因较困难，表达不稳定

动物蛋白及宿主抗体

转基因动物分泌表达如动物乳中.可采用重空纤维超滤技术进行分级分离，降低纯化难度，然后用高分辨率的疏水层析分离宿主抗体

转基因植物

降低了动物细胞污染的可能性，能够大规模低成本生产；

破碎细胞及分离纯化难度加大

色素、梢物细胞杂蛋白等

用亲和层析纯化植物表达抗体效果比较好，会有少量色素吸附在亲和胶上，但可用分子筛除去

6.4.2.3制剂生产工艺简介

目前市场上销售的单克隆抗体药物绝大多数是以注射剂的形式进行生产、销售和使用。

利用原液解冻装置（如水浴锅）将原液进行解冻，设置解冻温度和解冻时间，待完全解冻后进行配制和灌装。

缓冲液配制

配制（或备料）相关的洁净区级別应根据产品的生产工艺确定。

物料准备中应确保投料量符合指令要求，标识清晰，应采用双人复核，避免投料量或转运过程中差错。

使用自动称量系统的设备，应考虑称量系统的连接电缆、软管对称量线性和称量范围的准确性的影响。

配液结束后对溶液的品质应进行必要的监控，如含量、pH等。

除菌过滤可以降低灌装前的药液微生物的污染水平。

过滤器与产品成分的相容性应在最差条件下得到确认，通常使用两只过滤器串联过滤。

推荐配液后直接过滤至专用缓冲罐，以缩短除菌过滤前的药液存放时间。

药液配制过程中风险主要源自上一批次产品的残留污染。

配制容器和附属系统首先应考虑在线清洁和在线灭菌；

必要时也可以考虑人工清洁、湿热灭菌后组装或组装后在线灭菌。

过滤后的滤器完整性应该进行检査，必要时过滤前滤器的完整性也应进行检査。

完整性检査宜考虑在线检査。

使用容易产尘的物料时应采取物理隔离、除尘或其他装置，降低污染。

现场通风设施应能阻止气流引起的交叉污染。

灭菌

制剂工序使用的铝盖、胶塞、西林瓶和器具都要经过灭菌的处理，应结合灭菌物的特性、特殊要求（如除热原）选择合适的灭菌工艺。

灭菌设备性能、灭菌工艺应得到验证。

单克隆抗体产品因对热不稳定，为非最终灭菌产品，应采用无菌生产工艺（除菌过滤法或无菌操作法）进行制备。

灌装

液体装量控制一般使用计量活塞泵或者时间-压力控制系统，装量更准确。

通过活塞孔容积和螺杆间隙体积进行定量灌装。

对无菌生产工艺而言，灌装（或分装）是高风险的生产工序，除菌过滤后的药液、无菌原料药将直接暴露在开放空气条件下，虽然在A级环境下操作，但仍应该缩短灌装和密封（如扣塞）的时间以最大程度降低污染的可能。

低温存放的产品应控制在低湿度条件下，以防止设备和容器的结露。

灌装后部分产品（如对氧气敏感的粉针剂）需要通入除菌过滤的氮气，降低灌装中氧气的混入量。

灭菌后灌装零部件应采取防止污染措施，如在A级保护或者密闭条件下传送。

轧盖

轧盖工序主要是防止胶塞脱落，为产品提供长期的密封保证。

轧盖区域应结合产品的密封性能、设备状况、铝盖特性等设计合适的洁净级别。

轧盖过程中容易产生金属微粒或胶塞脱落现象，因此应考虑设定必要的除污染设施和检査装置，以消除污染和确保产品的密封完整性。

灯检

通过灯检剔除个别有异物的产品，应通过生产工艺及其控制保证产品中产生异物的概率。

灯检仅为防止有异物产品上市的最后措施。

灯检人员的素质和培训水平、灯检台的照度和背景、灯检的时间是该工序效果的主要影响因素。

采用自动灯检设备必须通过验证，不低于人工灯检的质量保证水平。