细胞生物学实验讲解Word文档格式.docx

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1.熟练掌握细胞传代培养的操作方法。

2.观察外培细胞在不同时期的形态变化及生长状况。

（四）死活细胞的鉴别

掌握死活细胞的鉴别原理及方法。

2．实验原理、实验流程或装置示意图

1.清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。

2.体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌操作的要求程度很高。

细胞培养不好与清洗不彻底有很大关系。

3.灭菌手段的选择也十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。

假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。

1.细胞培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。

合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。

其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。

它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。

2.小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必需的生长因子；

酶、微量元素和激素；

保护作用；

提供伸展和贴附因子等，是合成培养基所无法替代的。

此外它还能中和有毒物质（重金属、抗菌素）的毒性。

3.氨基酸是组成蛋白质的基本单位。

不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养基提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。

其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。

因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。

但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。

当原代培养细胞或细胞系细胞增殖达到一定密度后，则需要做在培养。

一般将传代培养的累计次数作为细胞代数。

悬浮型细胞培养常见于淋巴细胞、白血病细胞、骨髓瘤细胞和腹水型恶性细胞等的培养。

由于这类细胞或细胞集体可悬浮在液体培养基中，而不附着在固体表面上，因此无论原代培养或传代培养的细胞增殖过程都没有贴附性细胞那种明显可辨的3个变化阶段，其培养的可见效果是细胞数目的增多及溶液中细胞浓度和密度的加大。

悬浮型细胞传代培养的最大特点是原代细胞不必经过机械分离或消化酶消化处理，传代时只须把培养的悬浮细胞做适度稀释或把培养细胞经简单的离心处理后再加入适量的培养液即可培养。

因此，细胞在从原代到传代的转变过程中遭受的机械损伤和化学损伤的可能性较少，损伤程度也较轻，相对而言，传代的成功率较高。

细胞的存活率是反映细胞群体生活状态的重要指标。

多种方法可以鉴别细胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。

原理：

许多酸性物质不容易穿过活细胞的质膜进入胞内，却能渗入死亡的细胞内，使其着色，以次来区别死活细胞。

3．实验设备及材料

（1）仪器

超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤器

（2）材料

微孔滤膜（直径25mm）：

孔径为0.22um

（3）试剂

75%酒精、重铬酸钾、浓硫酸、NaOH、HCl等

超净工作台高压灭菌锅多重蒸馏水器磁力搅拌器天平

微量加样器

细胞培养瓶量筒、研钵、烧杯、漏斗、滤纸pH试纸

微孔过滤器（0.22μm）及注射器各种规格的Tip、离心管

NaOH、酚红RPMI1640干粉小牛血清、青霉素、链霉素

NaHCO3、L-谷氨酰胺三蒸水

超净工作台微量加样器（移液枪）倒置显微镜光学显微镜

高压灭菌锅蒸馏水器超低温冰箱二氧化碳培养箱

细胞培养瓶血球计数板滴管培养细胞

台盼蓝（染料）乙醇

人类淋巴细胞株

0.4%台盼蓝溶液

显微镜血球计数板

4．实验方法步骤及注意事项

一．细胞培养准备工作（清洗、消毒、灭菌）

（一）清洗

1.新玻璃器皿的清洗

先用自来水刷洗，再浸泡5%稀盐酸中和玻璃表面的碱性物质和有害物质。

2.使用过的玻璃器皿的清洗

（1）立即进入清水，避免干涸难洗；

（2）用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥；

（3）浸酸性洗液过夜；

（4）从洗液捞出自来水冲洗10~15次去除酸性洗液，蒸馏水刷洗10次，倒置烘干；

（5）包装（牛皮纸或不透水纸）；

（6）高压（15磅20min）或干热（160度2h）灭菌；

（7）备用。

（二）胶塞处理

（1）新胶塞应先用清水清洗之后再用0.2%NaOH煮沸10~20min。

（2）自来水清洗10次

（3）用1%稀盐酸浸泡30min。

（4）自来水清洗10次，蒸馏水刷洗10次。

晾干

（5）旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装高压灭菌，可使用。

（三）塑料制品的清洗

（1）用洗涤剂清洗，自来水冲洗数遍

（2）强（次强）酸洗液浸泡2~6h.

（3）自来水冲洗10次以上，蒸馏水刷洗10次

（4）浸泡在70%乙醇0.5~1h,备用。

（5）用前从乙醇中取出，在超级工作台内紫外线照射1h。

（四）洗液的配制

（1）将重铬酸钾6.3g放入大烧杯中，加入蒸馏水20m

l放在石棉网上加热至沸腾并搅拌，使重铬酸钾充分溶解。

（2）将重铬酸钾倒入酸缸中，然后缓慢加入浓硫酸100ml并用一长玻璃棒不断搅

拌，充分溶解。

注意事项：

操作时注意安全，穿戴好耐酸手套和围裙，防止洗液飞溅到衣物皮肤上，不慎飞溅到皮肤应立即用大量清水冲洗。

二．培养基的配制

（1）合成培养基的配制

1.1%酚红：

配制0.1mol/LNaOH100ml。

称量1g酚红于研钵中，取30ml0.1mol/LNaOH逐渐加入研钵中，尽量研细，然后过滤。

过滤后的酚红液加三蒸水至100ml。

4℃保存。

2.饱和NaHCO3的配制：

称取10g的NaHCO3溶于200ml三蒸水中，灭菌后分装于50ml试剂瓶。

3．RPMI1640培养液配制：

配制50mlRPMI1640培养液：

每组称取RPMI1640干粉0.52g，溶于50ml的三蒸水。

置于搅拌器上搅拌20min，直到液体变为澄清为止。

4.RPMI1640合成培养基配制：

加入0.1ml1%的酚红，通入CO2，使液体变为金黄色，说明培养基完全溶好。

配制好的培养基，用时用饱和NaHCO3液调节pH至6.8-7.0。

溶好以后的培养液在超净台中进行0.22μm滤过除菌，分装至细胞培养瓶中。

瓶口封好，-20℃或4℃贮存。

（2）小牛血清的处理

新买的新生小牛血清一定要灭活。

将买来的新生小牛血清不开封置于水浴锅中56℃，30min，期间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。

处理后的血清贮存于4℃。

（3）生长培养基的配制

1．双抗：

（100000U/ml）

160万单位青霉素/瓶+8ml3DW=20万单位/ml

1g链霉素+5ml3DW=200000μg/ml

各取以上的液体5ml混合，使其浓度为10万单位/ml，0.22μm过滤至1.5ml离心管，-20℃贮存。

2．谷氨酰胺储备液（200mmol/L）：

1.5g的谷氨酰胺溶于50ml三蒸水中

（30mg/ml=200mmol/L）,0.22μm过滤至1.5ml离心管中。

-20℃贮存。

3.RPMI1640生长培养基的配制

50毫升

储备液浓度

终浓度

RPMI1640培养液

44.5

—

谷氨酰胺

0.5

30mg/ml

0.3mg/ml

双抗

0.05

100000u/ml

100u/ml

小牛血清

5

10%

三．细胞传代培养

选取拟作传代培养的样本，取0.5mL细胞悬浮液加入等量台盼蓝染液，混匀后用血球计数板计算细胞的成活率。

如果样本成活率高，无污染即可用于传代。

用弯头吸管将原代培养瓶内的细胞吹打均匀，注意将那些半贴壁生长的细胞吹打脱离以免在移换容器时丢失。

把细胞悬液吸入无菌离心管中，塞紧反口橡皮塞以防止空气污染，用1000r/min离心5min。

吸去上清夜，加入适量的培养液，用吸管打匀制成细胞悬液。

重复步骤1，计算细胞数，加入适量培养液把最终细胞数调节至1×

105～3×

105个/mL。

把细胞悬浮分装至新备的细胞培养瓶中，置于37℃二氧化碳培养箱中继续培养。

操作：

每小组先用一个培养瓶配制50ml的生长培养基

每人取10ml培养基到自己的细胞培养瓶内

然后向细胞培养瓶内接种400ul的人淋巴细胞株原液

放入二氧化碳培养箱，旋松瓶盖

根据细胞的数量看细胞瓶是否平放或直立放置

观察

倒置显微镜的使用方法

利用课余时间和下次实验课时间用倒置显微镜进行观察。

四．死活细胞的鉴别

取20ul细胞悬液放入干净的离心管中，加入等体积的0.4%的台盼蓝染液混合，放置1min。

取一干净的血球计数板，盖上盖片，从盖片两边滴入细胞悬液使之充满计数板和盖片之间。

注意滴液勿有气泡，也不能太多，否则会使盖片浮起而是细胞计数不准。

低倍镜下观察，活细胞不着色，台盼蓝着色的细胞呈深蓝色，是不健康或已死亡的细胞，不能计数。

找出计数板上的方格，计算四角大格内总的细胞数，压着大格线者只计左侧或上方，不计右侧或下方。

注意事项

1．接种的血样愈新鲜愈好，最好是在采血后24小时内进行培养，如果不能立刻培养，应置于4℃存放，避免保存时间过久，会影响细胞的活力。

2．在培养中成败的关键，除了至为重要的PHA的效价外，培养的温度和培养液的酸碱度也十分重要。

人的外周血淋巴细胞培养最适温度为37±

0.5℃。

培养液的最适pH7.2～7.4。

3．培养过程中，如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻振荡，使凝块散开，继续放回37℃恒温箱内培养。

4．制片过程中，如发现细胞膨胀得不大，细胞膜没有破裂，染色体聚集一团伸展不开，可将固定时间延长数小时或过夜

5.参考文献

[1]吴昆,拜合提亚·

阿扎提,王文光,安尼瓦尔·

牙生,王玉杰.小鼠骨髓来源树突状细胞培养鉴定和诱导T淋巴细胞增殖[J].南京医科大学学报（自然科学版）,2011,（08）

[2]李静,郭文文,罗彬,陈芳,王炜炜,肖绍文,谢小薰.OY-TES-1诱导的树突状细胞对T淋巴细胞的增殖活化作用[J].免疫学杂志,2011,（07）

[3]史嘉林,杨栋.细胞培养及避免细胞污染的方法[J].养殖技术顾问,2010,（07）.

[4]朱庆虎,陈弘,秦红丽,刘兰刚,康二勇.动物细胞培养反应器的主要操作模式[J].畜牧兽医科技信息,2010,（10）.

[5]姚飞.常用的细胞培养方法、污染及污染处理[J].科技信息,2009,（07）.

[6]周丽薇.细胞培养技术与防止细胞污染的方法[J].医学信息（上旬刊）,2010,（11）.

[7]王洪跃,戴晓云.现代动物细胞培养反应器概述[J].中国医药生物技术,2010,（02）.

二．实验报告

1.实验现象与结果

第一大格

第二大格

第三大格

第四大格

活细胞

A

4

3

2

B

8

6

10

平均

5.5

7

死细胞

1

计算：

每毫升原液细胞数=4大格细胞总数/4×

10000×

稀释倍数

细胞存活率（%）=（细胞总数-死细胞数）/细胞总数

每毫升原液细胞数=4大格细胞总数（A、B平均）/4×

稀

释倍数

=（3+5.5+4+7+0.5+1+2+3）/4×

10000

=65000

细胞存活率（%）=（3+5.5+4+7）/（3+5.5+4+7+0.5+1+2+3）

=75%

2．对实验现象、实验结果的分析及其结论

死细胞被染成蓝黑色，而活细胞是透明的，不容易观察到。

给细胞着色在细胞计数中，便于区分死活细胞。

停滞期细胞不增殖,有代谢活动。

培养液中的营养已逐渐耗尽,代谢产物积累增多,pH降低，此时需要传代,否则细胞将会中毒,发生形态改变,细胞会从底物脱落死亡，所以便出现了死细胞。

3.实验总结

通过这次实验，学到了关于细胞培养的很多知识。

学会用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法；

熟练掌握RPMI1640培养基的配制方法；

熟练掌握细胞传代培养的操作方法；

更加熟练了各种仪器的使用。

掌握了细胞培养过程中的注意事项。

教师评语及评分：

签名：

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