大花三色堇FPNIPCR反应体系的优化Word文档格式.docx

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体系优化

　　中图分类号：

Q785文献标志码：

A[HK]

　　融合引物与巢式聚合酶链式反应（fusionprimerandnestedintegratedPCR，FPNI-PCR）是一种基于热不对称交错PCR（thermalasymmetricinterlacedPCR，TAIL-PCR）技术原理的PCR方法[1]，主要是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套特异性引物，与给出的9个特殊设计的随机简并引物（arbitrarydegenerateprime，AD）相结合，进行1次巢式反应，并在简并引物的基础上设计2个嵌套的特殊引物替换第1轮PCR所用随机引物用于第2、3轮的扩增。

FPNI-PCR中融合引物（fusionprimer），即特殊设计的随机简并引物，由3′端的随机寡核苷酸（arbitrarydegenerateoligonucleotides）和5′端可设计特异引物的一段序列组成，该序列用以替换初次PCR所用简并引物。

经过热不对称循环后的产物含有特异引物结合位点，能有效降低产物稀释后非特异性扩增的影响[2]。

FPNI-PCR具有高效灵敏、产物特异性高、重复性好、能够在较短的时间内获得目标片段等优点，是扩增基因侧翼序列特别是启动子的有效方法[3]。

　　FPNI-PCR与TAIL-PCR技术类似，其反应产物的稳定性、可重复性明显受到反应体系模板、引物、TaqDNA聚合酶、Buffer以及3轮退火温度等因素的影响[4]。

在进行FPNI-PCR反应获取未知序列时，有必要根据上述因素，对不同因素进行优化组合，以获得最优的反应结果。

　　大花三色堇（Viola×

wittrockianaGams.）是重要的冬春季花卉，有着十分丰富的花色和花斑类型，是研究植物花斑形成的理想植物[5]。

笔者所在实验室先前的研究表明，二氢黄酮醇还原酶（dihydroflavonolreductase，DFR）和花青素合成酶（anthocyanidinsynthase，ANS）基因是三色堇花斑由无色转向着色的关键性基因[6]。

关于DFR和ANS的相关研究发现，其启动子中含有的众多调控元件，与花色素调控密切相关[7-9]。

因而这2个基因的启动子结构特点，可能是花斑位置形成的一个关键性因素，其启动子的克隆，对于进一步研究三色堇色斑的形成具有十分重要的意义。

FPNI-PCR技术是克隆启动子序列的有效方法，而目前关于三色堇FPNI-PCR技术研究尚无相关报道，本研究以三色堇为材料，对其FPNI-PCR反应体系进行优化，为三色堇VwDFR和VwANS基因启动子的克隆提供技术基础。

　　1材料与方法

　　1.1材料与试剂

　　大花三色堇品种“宾哥”，花色为黄底黑斑，栽培于海南大学园艺园林学院基地。

　　1.2方法

　　1.2.1模板DNA的提取

　　提取三色堇幼叶DNA，步骤参考尚啸等的改良CTAB法[10]，仅核酸分离时改用加1/10体积的5mol/LNaAc。

提取的DNA用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，电泳结果通过凝胶成像仪（Dolophin-Doc，美国）拍照，利用紫外分光光度计测浓度。

小管分装-20℃保存。

　　1.2.2试验中用到的引物包括FPNI-PCR反应体系中的第1轮、第2轮、第3轮的简并引物、特殊引物（表1）[1]以及根据VwANS基因设计的特异引物（表2）。

　　1.2.3FPNI-PCR体系的优化

（1）模板DNA浓度筛选。

将提取的DNA稀释100、200倍，然后将未稀释的DNA和稀释不同倍数的DNA作为第1轮PCR反应的模板，反应采用表1中的FP5、FP6、FP7、FP9这4条简并引物，反应程序见表3，反应体系为20μL，具体组分见参考文献。

（2）FPNI-PCR反应退火温度的梯度筛选。

根据设计的特异性引物GSP3的TM值，对第3轮退火温度进行梯度筛选，筛选温度分别是62、64、66℃。

　　（3）引物、10×

buffer（20mmol/L，Mg2+plus）、TaqDNA酶用量的对比。

PCR反应采用20μL反应体系，分别对影响第3轮反应体系中的主要参数：

引物、10×

buffer（Mg2+plus）、TaqDNA酶，设置不同的浓度梯度，具体参数值见表3。

此外，每20μL反应体系中均含有dNTP（2.5mmol/L）2μL、特异性引物0.2μmol/L，模板为第2轮反应产物稀释100倍取1μL，加ddH2O补足至20μL。

逐一优化每个参数值，优化时，其他参数值均采用表3所列反应参数的第一水平值，引物采用参考文献中的FP5、FP6、FP7、FP9这4条简并引物（表1），反应程序见表4。

　　2结果与分析

　　2.1DNA的提取结果

　　以三色堇嫩叶为材料提取DNA，经紫外分光光度计检测，浓度为（0.901±

0.019）μg/L，D260nm/D280nm介于1.8～2.0之间，说明样品DNA中杂质较少。

0.8%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，点样孔无滞留，条带清晰明亮，无明显拖尾现象，说明RNA等杂质去除较干净。

结果表明，采用改良CTAB法可以有效地提取三色堇幼叶的DNA[10]，对于后续PCR反应有利。

　　2.2DNA的浓度对FPNI-PCR的影响

　　模板DNA的用量对FPNI-PCR反应有着非常直观的影响，过多或者过少都会造成产物的不稳定或者无法产生条带。

普通方法提取的DNA通常含有杂质，而杂质对PCR产物的影响是非常显著的。

为了获得清晰条带，降低非特异性扩增，本试验以3个浓度的DNA为模板，利用FP5、FP7、FP9这3种简并引物分别扩增，其他条件相同，结果如图2所示。

　　以未稀释DNA为模板，3轮扩增后均无清晰条带（图2）。

将DNA模板分别稀释100、200倍，随着DNA稀释倍数的增加，简并引物FP5扩增出的条带数量明显增加，且条带清晰度明显提升；

简并引物FP9扩增的结果，100倍稀释比200倍稀释扩增条带数量更多、条带更加清晰（图2）。

同时，7号引物在多个模板浓度下皆无明显条带，说明利用FPNI-PCR进行扩增时，模板的稀释倍数应配合不同的简并引物进行筛选，以期降低杂质等对反应的影响，才能获得更为清晰的条带。

　　2.3退火温度对扩增产物的影响

　　通过对5、7、9号引物扩增反应的第3轮扩增的退火温度进行筛选，筛选温度为62、64、66、68℃，结果见图3。

总体来看，64、66℃反应效果更好，但是不同引物反应的最佳退火温度不同，如FP5引物64℃下扩增效果较好，FP9号中超过700bp的条带，在66℃下更清晰。

　　2.4Taq酶的用量对FPNI-PCR的影响

　　Taq酶在PCR反应体系中用量少，却极为重要，Taq酶的类型、用量，甚至是生产商，都会对PCR产物造成明显的影响。

在本研究中，分别对以FP6和FP7简并引物扩增获得的PCR产物进行Taq酶的优化，其他条件全部相同，结果如图4所示。

试验发现，Taq酶的用量对反应条带的数量和清晰度都有一定影响，随着Taq酶用量的增加，FP6和FP7扩增的PCR产物的量均有所提高，但FP6更为明显，能获得较为清晰的条带，而FP7无明显的清晰条带。

以简并引物FP6扩增，Taq酶用量1.5U时比1.0U时条带亮度只略有提升，且非特异性扩增也更为明显，表明Taq酶用量1.0U更为合适。

　　2.510×

Taqbuffer（Mg2+plus）用量对FPNI-PCR的影响

　　分别以简并引物FP6和FP7进行扩增，通过改变10×

Taqbuffer（Mg2+plus）用量，其他条件均相同，结果见图5。

结果显示，以简并引物FP6扩增，3种缓冲液用量均获得条带，但用量为2μL时，目的条带更为清晰；

以简并引物FP7扩增，缓冲液为1.5μL时无条带，由1.75μL增至2μL时，条带数量增加，清晰度略有增加。

　　2.6引物浓度对FPNI-PCR的影响

　　以FP6和FP7这2种简并引物扩增，对第3轮引物SP2浓度进行筛选。

结果（图6）显示，引物浓度为0.25μmol/L时，均无条带，随着引物浓度的上升，条带数量、亮度明显增加，非特异性扩增同样增加，条带出现模糊现象。

由图6可知，以FP6和FP7为简并引物扩增，第3轮引物SP2浓度为0.75～1.0μmol/L时，均有较好结果。

但从节约成本、提高条带清晰度、减少非特异性扩增角度考虑，0.75μmol/L时更佳。

　　3结论与讨论

　　3.1结论

　　从试验结果来看，FPNI-PCR适合以低浓度DNA为模板，第1轮反应以稀释后的DNA为模板，20μL体系中，用量在4.5～10ng。

对三色堇FPNI-PCR第3轮体系进行优化，最优反应体系是：

20μL反应体系中，特异性引物浓度0.2μmol/L，引物SP2浓度0.75μmol/L，TaqDNA酶用量10U，dNTP用量2μL，10×

buffer（20mmol/L，Mg2+plus）用量2μL，模板为第2轮反应稀释100倍后取1μL，ddH2O补足。

第3轮反应经温度筛选，退火温度64℃或66℃时条带最佳。

　　3.2讨论

　　FPNI-PCR是基于热不对称PCR技术原理的PCR方法，共包括3轮PCR反应。

其中，第1轮反应中，含3次高严谨反应，目的是使高退火温度的特异性引物SP1与模板序列退火延伸；

1次低严谨反应，目的是使简并引物结合到较多的目的序列上；

5次热不对称的高低特异性循环交替反应，使目的片段得以指数性扩增。

第2、3轮为普通PCR反应，通过特异性嵌套引物进一步扩增目的条带。

它与普通TAIL-PCR的主要区别在于给出了经过优化后的一系列简并引物，并在简并引物的基础上设计了嵌套的特殊引物FSP1、FSP2用于第2、3轮的扩增[2]。

特异性嵌套引物的存在，使非目的条带得不到大量扩增，而非目标序列中的发卡结构也能抑制其扩增，从而提高了目的片段扩增的准确性[11]。

　　由于FPNI-PCR反应步骤较多，因此影响扩增结果的因素也较多。

首先，第1轮的高低严谨热不对称反应是目标片段扩增的最初环节，而本试验证明，模板浓度是影响第1轮反应结果的关键因素。

在研究中发现，低浓度的DNA模板更容易获得扩增结果，且模板DNA的稀释倍数对不同简并引物扩增的影响不同。

在其他PCR反应的研究中同样发现，植物DNA模板的浓度对于目的片段的扩增具有很大的影响[12]。

在TAIL-PCR中，通常需要对模板进行稀释，才能获得较为清晰的条带[4，13]。

原因可能是DNA中所含杂质的影响，未稀释的高浓度DNA中所含杂质更多，影响条带扩增，另外，不同简并引物对模板的浓度要求也可能不同，所适应的模板浓度存在差异。

　　在FPNI-PCR反应中，第1轮扩增产物因条带杂、浓度低，往往无法通过凝胶成像显示，需要通过第2轮对目标条带的进一步扩增获得初步结果。

通过第2轮产物凝胶成像，以有条带的第2轮稀释产物为模板，通过第3轮反应进一步扩增，以期获得较第2轮更为清晰的条带。

因此，第3轮反应体系的优化对最终结果的获得具有重要作用。

　　本研究中，针对第3轮PCR反应中部分因素进行了优化，结果发现，与buffer（Mg2+plus）、TaqDNA酶用量相比，引物的浓度影响最为显著，随着引物浓度的上升，条带数量、亮度明显增加。

需要注意的是，较高的引物浓度虽有利于扩增，但会造成条带模糊、非特异性条带增加，这与其他PCR反应类似[14]，不利于与第2轮条带比对推测目的条带。

虽然FPNI-PCR中融合引物特殊且相对较短，有利于与DNA模板结合扩增目的条带，但经过3轮反应虽然在一定程度上降低了非特异条带的干扰，但杂条带的影响仍是影响试验结果的重要原因[15]。

因此，在第3轮反应中选出最适当的引物浓度，具有十分重要的作用。

含Mg2+的buffer缓冲液主要对引物和模板的退火、TaqDNA酶的稳定起作用，当缓冲液低于一定限度不能产生条带，但用量过多也会使dNTP过量结合，非特异性条带增加，不利于反应[16-17]。

与缓冲液相对应，TaqDNA酶用量的多少，同样对PCR反应存在直接影响，不同的Taq酶需要配合相应的缓冲液使用，过少无法产生条带，过多也会造成非特异性扩增[18-19]。

在本试验中，较高的buffer浓度和TaqDNA酶均有利于扩增。

　　PCR反应中除各因素外，退火温度对目的条带的获取同样具有重要作用。

相关研究发现，对热不对称PCR第3轮反应退火温度的优化，能有效地促进目的片段的富集[20]。

本试验第3轮PCR反应中，特异性引物的Tm值为65℃，通过温度筛选得出，退火温度为64℃或66℃时，条带更为清晰。

　　综上所述，本研究发现，在FPNI-PCR中通过优化反应体系中各因素的浓度或用量，筛选3轮PCR的退火温度，均能有效地增加目的条带的清晰度，减少非特异性扩增，为后续研究打下良好基础，为其他物种基因启动子的研究提供一定的借鉴作用。

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