免疫组化操作规程Word文档格式.docx
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1、脱蜡和水化
脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；
2）无水乙醇中浸泡5分钟；
3）95%乙醇中浸泡5分钟；
4）70%乙醇中浸泡5分钟；
2、抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
1）抗原热修复
（1）高压热修复在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。
盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。
将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。
本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
（2）煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。
（3）微波热修复在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。
适用的抗原有：
AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，ChromograninA，Cyclin，ER，Heatshockprotein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
2）酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。
胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；
胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。
适用于被固定遮避的抗原，其中有：
Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
3、免疫组织化学染色
SP法
1）脱蜡、水化；
2）PBS洗2～3次各5分钟；
3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；
4）PBS洗2～3次各5分钟；
5）抗原修复；
6）PBS洗2～3次各5分钟；
7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。
甩去多余液体。
8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
10）PBS洗3次各5分钟；
11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；
12）II抗中可加入0.05%的tween-20。
13）PBS洗3次各5分钟；
14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；
15）PBS或自来水冲洗10分钟；
16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；
17）自来水冲洗10～15分钟；
18）脱水、透明、封片、镜检。
SABC法
1）脱蜡、水化。
2）PBS洗两次各5分钟。
3）用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。
4）抗原修复。
5）PBS洗5分钟。
6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。
7）滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。
8）PBS洗三次每次2分钟。
9）滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。
10）PBC洗3次每次2分钟。
11）滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。
12）PBS洗4次每次5分钟。
13）DAB显色：
DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。
14）蒸馏水洗。
苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。
15）脱水、透明、封片、镜检。
石蜡切片免疫组化染色步骤
1、载玻片的处理：
抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。
为保证试验的正常进行，APES、Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。
具体方法如下：
1.1APES：
现用现配。
将洗净的玻片放入以1:
50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。
用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。
1.2Poly-L-Lysine：
将洗净、干燥的载玻片放入以1:
10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。
装盒备用。
试验中使用的器具均为非玻璃制品。
2、常用酶消化：
2.1胰蛋白酶：
一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。
2.2胃蛋白酶：
一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：
Laminin（层粘蛋白），CollagenIV（IV型胶原）等。
2.3皂素（Saponin）：
一般使用浓度为2~10g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。
3、抗原热修复：
可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。
抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。
请选用我公司提供的ZLI-9064枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0±
0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。
3.1石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：
切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×
3。
将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：
无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。
取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：
不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。
PBS洗，下接免疫组化染色步骤。
3.2石蜡切片高压抗原修复操作方法：
切片脱蜡至水。
将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。
切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。
当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×
3，下接免疫组化染色步骤。
3.3石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：
切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。
4、免疫组化染色步骤：
（以美国ZYMED公司SP试剂盒为例）
4.1石蜡切片免疫组化染色步骤
①石蜡切片脱蜡至水。
②3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
③蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，（如需采用抗原修复，可在此步后进行）。
④5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
⑤PBS冲洗，5分钟×
3次。
⑥滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；
或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
⑦PBS冲洗，5分钟×
⑧滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；
或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
⑨PBS冲洗，5分钟×
⑩显色剂显色（DAB或AEC）。
自来水充分冲洗，复染，封片。
4.2冰冻切片免疫组化染色步骤
①冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×
②用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×
2。
下接免疫组化染色操作步骤。
免疫组化常见问题的处理
当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。
对照/标本无染色
①确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
②确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。
③对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。
比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；
或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
④检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。
⑤检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。
⑥检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。
⑦检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。
需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。
⑧检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。
⑨检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。
弱阳性
如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：
①标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。
②不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。
③抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。
一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。
④切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。
⑤孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。
如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。
非特异性染色
①是否有效地去除了内源性酶和生物素。
应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。
处理的方法为：
灭活碱性磷酸酶：
最常用的方法是将左旋咪唑（24mg/m1）加入底物液中，并保持pH值在7.6~8.2，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。
饱和处理内源性生物素：
消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素，以饱和内源性生物素，使之不再有剩余的结合位点。
具体方法是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25ug/ml亲和素溶液中处理15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。
②是否选择使用了正确的封闭血清。
电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清，用PBS稀释为3%-10%溶液孵育切片，以封闭吸附位点。
有时其它无关蛋白，如牛血清白蛋白也常应用。
另外，取材时避开出血、坏死区亦极重要。
最近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭，效果也不错。
③所选择的抗体是否符合试验要求。
因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色只能通过采用高纯度、高效价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。
④一抗的使用浓度是否过高。
⑤清洗是否充分。
应严格操作规程。
因在缓冲液中含有一定量的盐，这亦有利于减低背景着色，通常0.05mol/lTris—HCl，0.15mol/lNaCl已适用于多数染色方法，溶液内加入吐温20，效果更佳。
特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。
⑥DBA的使用是否正确。
DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型DAB试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的pH值，以确保实验结果的正确性；
粉剂DAB溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去，否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。
另外，DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将DAB保存于避光干燥处，现用现配，临用前加H2O2。
孵育时间过长也会造成背景染色。
⑦标本染色过程中是否曾经干涸，否则会造成边缘部的非特异性染色。
⑧检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。
免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及对策
良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。
由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。
需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。
虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：
无色片（即无阳性信号）和“杂音”染色片（有阳性信号）。
一、无色片
染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。
这是常规工作中比较常见的现象，出现这种现象，有两种可能：
1、真阴性结果：
整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。
2、假阴性结果：
即此阴性结果不是真实的反映。
假阴性结果又可分为两种情况：
（1）切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。
出现这种情况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。
获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。
由此表明：
制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不可缺少的作用。
（2）染色过程中的某一或某些环节出了问题。
比如，组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；
或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；
或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。
也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。
为了避免这种简单的错误，有一种简单的方法：
在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出现棕色。
如果出现了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。
如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。
如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗DAB或DAB的配制过程。
这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。
解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。
如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。
如果此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织或细胞没有相应的抗原表达。
反之，如果阳性对照没有着色，表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。
应一一寻找原因。
阳性对照包括两种，一种称为“自身对照”或“内部对照”，这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原，CD20或CD3都应该有表达。
自身对照是一种比较理想的对照，对照和测试组织或细胞都在同一张切片中，都处于相同的试验条件下，结果更可靠也更具有可比性。
在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，这样有利于对比。
另一种称为“外部对照”，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1来检测，在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原，如果病变出现阳性反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴性结果，就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。
因此，应另外设立一个已知的阳性对照。
这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。
在实际工作中需要设立外部对照的情况很多，如果每一种抗体都要选不同的阳性对照，工作量会很大。
为了解决这个问题，目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起，制成多组织切片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯片等，其连续切片储备待用，需要时取出一张便可作为阳性对照。
另外，比较简单的方法，是采用阑尾作为阳性对照，因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多，如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。
一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。
设立阳性对照是病理医生的任务或责任，而不是技术员的责任。
病理医生观察了HE切片，了解切片中是否有自身对照，如果没有，就应告诉技术员采用阳性对照。
因此，病理医生在免疫组化中的作用是不可忽视的。
抗体未覆盖上测试组织：
当多块散开的小组织染色时，可能漏掉某块组织染色。
二、“杂音”染色片
免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色称为“杂音”染色。
“杂音”染色种类繁多，产生的原因也多种多样，为了便于说明，笔者将其归纳为下面几种。
1、全片着色
全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。
出现这种现象的原因有：
（1）、抗体浓度过高：
一抗浓度过高是常见的原因之一。
解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。
（2）、抗体孵育时间过长或温度较高：
解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。
现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。
（3）、DAB变质和显色时间太长：
DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。
配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。
DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。
不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。
（4）、组织变干：
修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。
解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAPPen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。
（5）、切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：
原因上不清楚，但现象存在。
有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4º
C冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。
（6）、一抗变质、质量差的多克隆抗体：
注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。
用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。
2、切片边缘着色
切片边缘着色也是一种常见的现象，这种现象称为边缘效应。
产生的原因：
（1）、组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致。
解决办法：
制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。
（2）、切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。
试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。
用DAKO笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。
3、“阴阳脸”着色
指组织一半着色一半无着色，形成交界清晰或不甚清晰的两种染色结果。
其成因是试剂仅覆盖了部分组织而不是全部。
如加试剂后未让试剂流散开而集中在部分组织上。
通常应该在加完试剂后，仔细看一遍，是否有的组织未被试剂完全覆盖，如有这种情况，建议用牙签而不是用吸头或试剂瓶口将试剂引流开使之将组织全部覆盖。
另外，染片盒不平，切片倾斜，虽然开始试剂已全部覆盖了组织，但后来试剂流向一边，部分组织未被试剂覆盖。
对于这种问题，只要留心或想到了很容易发现，也很容易解决。
有时，用DAKO（或PAP）笔在组织周围画圈时，划线太靠近或画到了组织上，由于笔油的力学原理，试剂不能达到靠近划线附近的组织。
还有气泡也可引起阴阳分明的着色，只是不着色区域是圆形，由于气泡中含气，试剂被推到周围，因此，气泡中心的组织不着色。
解决办法是滴加试剂时手法要轻，有气泡时用牙签捅破。
4、灶片状着色
切片中着色区东一块西一块，呈灶片状分布，出现这种问题的原因有：
（1）、裱片时水未排尽，在局部形成气泡使组织突起，染色时试剂渗入后不易洗尽，显色过深所致。
解决办法是，漂片盒里的气泡应去尽，晾片热台不能平放，应有45度左右的斜度，利于水流走和蒸发。
（2）、坏死组织灶，组织坏死后细胞破坏、酶的释放、蛋白游离、分解，复杂的肽链残段（如Fc段）可能与一抗或/和二抗结合导致最终着色。
解决办法是在选择染
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