体外培养第二章DOC文档格式.docx
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所以，不论是植块培养还是分离细胞培养，都不一定仅可以进行原代培养，而也可以进行传代培养。
一、原代培养的过程
原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种、加培养液、置培养箱中培养等步骤。
在所有操作步骤中，都要注意保持培养物及其生长环境的无菌条件。
（一）取材及培养材料的制备
取材及培养材料的制备过程就是从生物体切取欲培养材料，制备成可用于培养的组织块或细胞的过程。
整个取材与制备过程一般要在超净工作台或其它无菌台面上进行。
1．取材及制备培养材料的基本过程
这里以动物组织为例介绍其步骤。
用于植块培养与分离细胞培养的材料制备过程略有不同。
后者需要将组织分散为单个细胞。
（1）准备工作：
主要涉及取材器具、用品的灭菌以及实验者、实验动物的清洁与消毒。
1）对所要用到的解剖器械和器具进行高温高压消毒。
对取材过程中用到的培养液、平衡盐溶液以及蛋白酶消化液等可用微孔滤膜过滤除菌。
取材常用的器械包括手术刀、剪、镊子、止血钳、空针、解剖针以及不锈钢（或尼龙）筛网等。
常用的器具包括培养皿、小烧杯、吸管、离心管、三角瓶、棉球、血细胞计数板等。
2）对准备进行取材的工作台面严格消毒。
消毒方法包括紫外线照射（于取材前照射30min以上）、消毒液或酒精棉球擦洗消毒等。
3）对操作者本人进行一定的清洁处理及准备。
原则上，每次进入培养室前须按外科手术要求那样洗手和着装。
即，肥皂水刷洗干净后，再用0.2％苯扎溴铵（新洁尔灭）浸泡前臂或以酒精棉球擦拭消毒。
然后，穿衣、着帽、戴口罩和手套。
若在实验过程中，误触怀疑带菌物体，一般都要用酒精棉球擦拭消毒。
4）对实验动物进行消毒。
具体方法见后。
（2）取材及制备培养材料的基本步骤：
技术路线如图2-1所示。
1）切取或摘取意欲培养的动物器官或大组织块，在培养液或者平衡盐溶液中洗涤以去除血污。
剔除可能附带的脂肪组织、被膜结缔组织以及坏死组织。
必要时，还需借助解剖显微镜进一步切除不要的结构成分。
在操作过程中，要不时给所取组织块上滴加一些培养液或平衡盐溶液以保持湿润。
2）将所取组织块放在盛有培养液的培养皿中。
在解剖显微镜下，将所取组织切成1mm3左右的小块用于植块培养。
3）对于分离细胞培养来说，先在培养液或平衡盐溶液中剪碎所取组织，将组织块连同培养用液用吸管吸至一离心管中，稍事静置，待组织块下沉后吸去上清液。
加入蛋白酶消化液，密封后置37℃或其它温度条件下消化15～45min，中途用手摇匀数次。
消化结束后，吸去含酶溶液，加入蛋白酶抑制剂溶液或者含血清的培养液以终止蛋白酶活性。
然后，用吸管或空针吸取液体吹打组织块。
吹打的程度以组织块刚好消散为宜。
4）将经过蛋自酶消化和机械吹打等方法制成的细胞悬液用不锈钢网筛过滤。
收集滤过液。
如果未滤过的组织尚多，而且需要尽可能获得实验材料，可将未滤过的组织再行上述步骤3）处理，然后再一次用不锈钢网筛过滤。
5）对滤过液离心。
转速一般为800～1000r／min。
离心时间一般为5～10min。
6）弃去上清液。
将细胞沉淀用少量培养液重新悬浮为细胞悬液。
7）用血细胞计数板计数细胞密度。
8）用培养液调节细胞悬液的密度至期望的程度。
准备接种。
切取意欲培养的动物器官或大组织块
↓
洗去血污
↓
剔除多余成分
切成约lmm3大小的植块将所取组织剪碎
↓↓
用于植块培养蛋白酶溶液消化
机械方法吹打组织块
不锈钠网筛过滤
对滤过液离心（＜1000r/min，＜10min）
用培养液悬浮成细胞悬液
↓
计数并调节细胞密度
用于分离细抱培养
图2-1植块与分离细胞原代培养的材料制备过程示意图
2.几类常用实验动物的取材
（1）胚胎动物的取材：
胚胎动物是体外培养常用的实验动物。
由于胚胎生存于母体子
宫内或者蛋壳内（鸟类），取材时只要注意对母体动物或蛋壳进行消毒就可以了。
下面以鸡胚为例，介绍鸟类胚胎的获取过程。
鸡胚由受精蛋孵化而成。
方法是，将受精蛋放到38℃孵（卵）箱或恒温箱中，静置。
每日翻动l～2次，以防止鸡胚粘连到蛋壳上影响发育。
箱内湿度（40％～70％）可通过在箱底放一盛水盘来维持。
鸡胚的孵化期21d。
孵化前，如遇蛋壳表面污物较多，可用刀片等器具刮除，不要用湿布擦拭，更不能用酒精棉球消毒或者用水洗蛋。
孵育前可将受精蛋保存在l0℃左右，保存期一般不超过10d，也有人将受精蛋保存在4℃冰箱中。
1）将孵育一定时间的受精蛋取出，分别用碘酒与酒精棉球擦拭消毒。
晾干。
2）将受精蛋大头朝上。
用一已消毒金属器具将受精蛋大头端击破，用镊子小心夹去破碎壳，然后撕去气室外面的膜，暴露出尿囊绒膜及附着的血管。
开口大小以受精蛋内容物不溢出为宜，但不宜太小。
3）用弯镊撕破尿囊绒膜。
然后轻轻夹住鸡胚的颈部，托出鸡胚。
放到事先盛有培养用液的培养皿内。
备用。
接下来以鼠胚为例，介绍其胚胎获取过程。
鼠胚取自于孕鼠。
孕鼠的准备方法是，成年雄鼠与雌鼠放置在同一鼠笼内让其交配，于合笼后每天早晨检查雌鼠阴道，查看有无阴道栓形成。
一旦形成阴道栓，即可肯定雌鼠受孕。
以阴道栓形成之日开始（零日），计算妊娠天数（即鼠胚的胚龄）。
大、小鼠的妊娠期均为21d。
1）取一定妊娠天数的孕鼠，处死或麻醉。
对于小鼠母鼠，可以通过颈椎骨脱位的方法处死。
对于大鼠，可以通过让孕鼠吸入乙醚进行麻醉或者吸入过量CO2致死。
2）分别用碘酒与酒精棉球擦拭孕鼠腹部进行消毒。
然后，切开或剪开孕鼠腹部皮肤，露腹部肌肉。
在此过程屮，注意不要使剪开的皮肤接触到腹肌。
3）沿腹屮线切开或剪开腹肌，暴露内脏。
用剪刀和镊子解剖出包含鼠胚的子官，放置一事先盛有培养用液的培养皿内，稍事清洗后，换入另一培养皿内。
4）撕破或剪开子官，取出所有胚胎。
置入一新的盛有培养用液的培养皿内，洗去血污。
（2）成年动物组织的取材：
对于能够拿到培养室准备间的成年实验动物来说，取其内脏器与从孕鼠体内取出子宫的步骤是相似的，基本上也是麻醉、消毒、切开皮肤和肌肉，取出脏器等步骤。
但对于一些无法运送到培养室附近的动物，如大型动物，由于动物的宰杀场所可能不具备培养室那样的无菌环境，若要取其脏器用于培养，要注意杀菌、运输以及保持细胞活性等问题。
1）切取所要的脏器或大组织块。
对于带有鞘膜的器官如睾丸，取材时争取连同鞘膜一起切取。
2）取材后迅速置于冰冷的已加入抗生素的培养液或者平衡盐溶液中，在密封的容器内尽快运送到培养室处理。
3）材料送到培养室以后，要尽快更换抗生素溶液并将组织块切成小块。
然后，放置在培养液中。
（3）人体手术、活检材料的取材：
在临床上，有时候会遇到因手术或病理活检而从病人体内取得的一些人体组织可用于培养，或者需要借助体外培养技术进行深入研究。
但由于从临床上得来的这些材料常常会受到病菌污染，而且手术过程中切除人体组织不像专门为了进行体外培养工作时取材那样规范，所以，利用人体手术或活检材料进行培养时须尽量注意减少污染、避免延误，事先要做好一切准备工作，随时可以最快的速度处理材料并进行培养。
1）在与临床上有关人员联系好以后，须准备以下物品：
①数个用于运送标本的瓶皿（标本瓶），标本瓶内盛有含抗生素的培养液，置于冰壶中；
②70％或75％乙醇若干；
③不同规格的培养瓶皿烧杯若干；
④有关的解剖器械。
所有物品均须经过消毒。
1）实验人员要等候在手术室外，随时准备将所取组织处理并运送往培养室。
对于体积较大污染较严重的组织块，可在70％或75％乙醇中浸泡消毒30～60s。
用培养液冲洗后，再放入标本瓶内。
对于小块组织，不能用酒精消毒，可直接用含抗生素的培养液处理。
将标本瓶置冰壶中送往培养室。
2）在培养室内，尽量切除标本上的坏死组织。
将标本切割成可用于培养的植块或分散成细胞悬液。
3.关于取材过程的讨论
以上所介绍的取材过程仅涉及如何为体外培养准备活体组织的过程，而没有强调对细胞的进一步处理。
按照上述步骤所获得的组织块或细胞悬液，内含各种原本存在的细胞成分，用这样的材料进行培养，培养物将是含有多种细胞的混合物。
如何从所制备的细胞悬液中得到单一的细胞类型，亦即如何分离出各种各样的细胞成分，才是培养前更为重要的过程。
关于体外培养接种以前或者培养过程中细胞分离（ce11separation）的原理与具体方法，将在第四章内介绍。
（1）取材要准确：
取材是体外培养工作的开端。
如果在这最初的实验过程中没有取到合格、理想的实验材料，整个体外培养过程就很难达到预期的目的。
如本书后面的章节内介绍的，对于动物的基本组织细胞的体外培养而言，大多数种类的细胞培养实质上主要在于取材这一步骤。
原则上，从上皮组织取材，不可能培养成结缔组织，而从肌肉组织取材，不可能培养成神经组织。
所以，取材一定要准确，真正取到目的组织，而且要尽置剔除干净附带的其它组织成分或结构成分。
譬如，要培养神经组织的中脑黑质的神经元，无论如何也只有从黑质部位切取组织，黑质与红核部位一起切取，经培养后的神经元只能是黑质与红核神经元的混合物。
又如，对于脊髓灰质的神经元培养来说，取材时坚决不能附带白质组织，否则后者会对体外培养的神经元产生生长抑制作用。
对于材料来源有限的动物结构，取材时尤其要作到准确。
必要时，可以借助解剖显微镜进行。
（2）关于取材及制备培养材料的步骤：
就动物不同组织的取材而言，取材的步骤大同小异。
但在具体操作过程中，还需要根据具体的实验情况，对前面介绍的基本步骤做一些调整。
譬如，对于将组织块分散为细胞悬液的过程，有的组织细嫩、组织内部纤维性成分少，可能仅以机械分离方法就可以将组织分散成单个细胞。
而有的组织坚硬、内含较多结缔组织尤其是纤维性成分，对这样的组织，一般需要蛋白酶消化处理与机械分离方法同时使用才能将组织分散，甚至可能需要使用不止一种的蛋白酶消化处理，而且各种分散处理的时间与强度都要加大。
又如，用不锈钢网筛过滤这一步是放在整个分散处理过程的最后还是放在机械分离处理之前都无定式。
有的操作者喜欢采用在不锈钢网筛上边研磨边过滤的方法（也属于机械分离处理方式）来分散组织，这种情况下，用不锈钢网筛过滤这一步可以放在其它方式机械分离处理之前。
如果用不锈钢网筛过滤仅仅是为了滤去未分散的组织块或者一些纤维性成分，那就可以放在整个分散处理过程的最后。
（3）需要注意的事项：
整个取材过程中，都要注意保持组织的湿润，随时给组织块滴加一些培养液或平衡盐溶液。
一般情况下，最好是使用冰冷的液体。
在剪碎或切割组织块时，尽量使用锋利的刀剪，防止以钝器对组织揉、捻、撕拉等而造成细胞损伤。
整个取材过程耗时越短越好。
在万不得已的情况下，取材后也可将组织贮存在冷的（4℃）含平衡盐溶液（或其它缓冲盐溶液）的营养液中，最好不超过24～48h（视不同组织类型而定）。
4．无菌操作技术
无菌观念和无菌操作必须贯穿整个体外培养过程的始终。
操作者在进行每一步实验过程中，必须具有微生物污染“无处不有处处有”以及预防为主的观念。
这里简要总结一下培养过程中的无菌操作技术。
（1）进行培养工作前的准备：
首先需要对培养过程中可能用到的所有器具器皿及培养用液进行消毒和灭菌。
操作细节见第一章。
进入培养室前，操作者洗手着装要求亦如前述。
（2）培养操作过程中的无菌技术：
为在培养操作过程中随时进行灭菌或消毒处理，在超净工作台上一般都要有酒精、碘酒棉球，并点燃酒精灯。
任何怀疑被污染的物件都要补充消毒。
开启或封闭瓶口，安装针头滤器、吸管帽、移液器头或针头等操作均宜在靠近火焰的地方进行。
重新使用搁置的金属器械，最好先烧灼一下再用（注意须于冷却后使用）。
每一次开封瓶口，最好能习惯性地略微烧灼瓶口、瓶塞或瓶盖。
操作过程中，忌坐立不安、到处走动、抓耳挠腮、大声喧哗等多余动作。
用过的物品与未用的物品分开搁置，保持工作台面上物件放置布局合理、井井有条。
不要过早打开消毒包装。
瓶口、管口尽量不要竖直朝上以防微生物落入。
当然，微生物污染也不是随时都有，在不同季节、不同地域、不同预防措施下，情况会有很大不同，完全不必因惧怕污染而拒绝体外培养这门技术。
（二）分离（散）细胞的方法
从动物组织取材后，若要进行分离（散）细胞培养，紧接着的一个工作就是将所取得的组织块分离（或分散）（dissociate）成单个细胞，亦即制备细胞悬液（cellsuspension），这个过程也可以称之为解离释放细胞的过程。
分离（散）细胞培养法过去也曾有人称之为细胞悬液培养法（cellsuspensionculture）。
大多数情况下，这种培养方法都是使所培养的细胞粘附、铺展于培养器皿的表面而静置培养，培养物（正常机体细胞）呈单层细胞的形式在器皿表面生长，故又称为单层细胞培养（monolayerculture）。
少数情况下，也可以通过专门设备持续摇晃使细胞始终呈悬液状态而在体外生长，此即为后面介绍的悬浮培养法。
将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。
1.机械解离细胞法
所谓机械解离细胞法，指通过各种各样的物理学处理手段，将所取动物组织解离成为
单个细胞的方法。
最常用的是以巴斯德吸管（Pasteurpipette）、细口径吸管、空针（带较粗
的针头）或者移液器吸头反复吸吹（吹打）液体，使其中的组织块被击散。
另外，用不锈钢
（或尼龙）网筛边研磨边滤过也是一种常见的机械解离方法。
广义上，用刀切割、用剪刀剪
碎，都可以归入机械解离细胞的范畴。
机械解离细胞法适用于解离质地较软、内含纤维性
成分较少且对机械分离较具耐受能力的组织，例如胚胎组织、成年的脑组织与肝组织、某
些软肿瘤组织等。
（1）用吸管吹打的操作方法：
需要的主要器材包括：
①细口径吸管、空针（带较粗的针头）或者移液器（剪去吸头尖端，使口径较大）；
②试管、离心管或容量约25ml的培养瓶。
所有物品须经消毒。
1）将所取组织块用平衡盐溶液漂洗，洗去血污。
转移至一盛有培养液的试管（或者离心管、培养瓶）内。
2）用吸管、空针或者移液器反复吸吹培养液，吹打在组织团块上。
至组织块基本消散或者刚好消散为宜。
3）离心（1000r／min，5min）。
4）用培养液将细胞沉淀重新悬浮成细胞悬液。
计数并调整细胞密度，备用。
如果对细胞密度无特别要求，离心与调整细胞密度这两步可以省略。
（2）过筛法分散组织：
①不锈钢（或尼龙）网筛；
②可用于研磨组织的粗大空针内芯或玻璃匀浆器内芯；
③培养皿、烧杯、吸管、离心管等。
2）在1个盛有培养液的培养皿内，放1张网眼孔径为100μm的不锈钢（或尼龙）网筛。
网筛浸于培养液中，网筛的四角朝上。
也可以将不锈钢（或尼龙）网筛捆扎在一小烧杯口上，按压网筛的中间部分使其稍微凹陷下去一些。
3）将漂洗过的组织块放到网筛上面，用空针或玻璃匀浆器内芯轻轻挤压组织块，使细胞释放出来。
用镊子夹起网筛，用培养液冲洗网筛上的细胞，使之通过网眼进入培养液中。
若使用捆扎在小烧杯口上的网筛，直接可以边研磨组织边冲洗，使分散的细胞滤到烧杯内。
4）用吸管吸取解离下来的细胞悬液，通过孔径100μm的网筛，过滤到另一个培养皿内，以除去小块组织和组织残渣。
必要时，还可以再用另一张孔径更小的网筛过滤。
5）离心（1000r／min，5min）。
6）用培养液将细胞沉淀重新悬浮成细胞悬液。
（3）有关机械解离细胞法的讨论：
机械解离细胞法所需时间少。
原则上，这种方法对
于分化程度较高的细胞如成熟的神经细胞、肌肉细胞易造成伤害，细胞的存活率相对较
低。
使用时需根据不同细胞的耐受能力调整强度和时间。
2．酶学解离细胞法
用蛋白消化酶解离细胞是体外培养动物细胞时分散组织的基本方法。
能用于体外解离组织细胞的蛋白消化酶有多种，如胰蛋白酶（trypsin）、胶原酶（collagenase）、链霉蛋白酶（pronase）、透明质酸酶、粘蛋白酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶以及弹性蛋白酶等。
最常用的消化酶是胰蛋白酶和胶原酶两种。
配制蛋白消化酶溶液，一般使用不含Ca2+、Mg2+的平衡盐溶液或其它无Ca2+、Mg2+的缓冲溶液。
（1）胰蛋白酶解离细胞法：
胰蛋白酶是从动物胰脏分离的一种水解酶，主要用于消化细胞间质。
根据使用温度的不同，用胰蛋白酶解离细胞可分为热处理和冷处理两种方法。
热处理法是指消化温度为37℃，而冷处理法是指消化温度为4℃。
以热处理法最为常用。
1）将所取组织用平衡盐溶液或不含血清的培养液洗涤，洗去血污。
2）在培养皿内将组织用刀切成1～2mm3的小块，或者将组织用剪刀剪碎。
用无Ca2+、Mg2+的Hanks平衡盐溶液（CMF-HanksBSS）洗涤组织小块。
3）将组织小块转移到一试管内或者一离心管内，加入CMF-HanksBSS，静置10min。
间或摇动或搅拌。
4）吸去CMF-HanksBSS后，加入胰蛋白酶消化液。
胰蛋白酶消化液可用CMF-HanksBSS配制，也可以不加血清的培养液配制。
工作浓度为0.01％～0.5％，常用的是0.08％、0.125％或者0.25％。
密封管口后置37℃下消化15～45min，中途用手摇匀数次。
也可以将消化液及欲消化的组织块（量较大时）加在一小的三角烧瓶内，内置磁棒，在可加温的磁力搅拌器上进行消化处理。
5）消化结束后，收集内含解离下来的细胞之消化液。
置4℃冰箱内冷却。
在所余组织上再一次加入消化液，重复步骤4）的消化过程。
再一次收集内含解离下来的细胞之消化液，与已冷却的细胞悬液混合。
待消化的组织量过大时，可多次重复消化与收集过程。
另外，在步骤4）后，还有一种做法是：
消化结束后，稍事静置，待组织块下沉后，吸去含酶溶液，加入蛋白酶抑制剂溶液或者含血清的培养液以终止蛋白酶活性。
然后用吸管或空针吸取液体吹打组织块。
6）将经过蛋白酶消化或又行机械吹打等方法制成的细胞悬液用不锈钢网筛过滤。
7）对滤过液离心。
8）弃去上清液。
9）用血细胞计数板计数细胞密度。
用培养液调节细胞悬液的密度至期望的程度。
上述步骤3），即将组织块在CMF-HanksBSS中静置10min，其实也有解离细胞的作用。
因为，Ca2+、Mg2+原本就在细胞间质中存在，对稳定细胞间质和细胞之间相互粘着起一定作用。
当使用无Ca2+、Mg2+的溶液处理组织块时，组织内部的Ca2+、Mg2+会进入溶液之中，从而起到破坏细胞间质使细胞分离的作用。
如果拟消化的组织量很大，上述步骤所用的各种器皿及液量均要相应加大。
胰蛋白酶解离细胞的冷处理法与热处理法不同之处在于：
①用胰蛋白酶消化液进行消化的温度为4℃；
②消化液浓度一般使用0.25％；
③消化时间延长至4～18h。
冷处理法相对于热处理法其优点是对细胞损伤较小，细胞产量（得率）较高。
但其最大的缺点是耗时太长，故大多数操作者更倾向于使用热处理法。
（2）胶原酶解离细胞法：
胶原酶主要用于水解结缔组织中的胶原蛋白成分。
当拟消化的组织较硬，内含较多结缔组织或者说胶原成分时，用胰蛋白酶解离细胞的效果较差，这时可以采用胶原酶解离细胞法。
消化过程与胰蛋白酶消化法相似。
l）将组织块剪碎并洗涤，转移到一小烧杯或者小培养瓶内，加入CMF-HanksBSS，静置10min。
间或搅拌或摇动。
2）吸去CMF-HanksBSS后，加入胶原酶溶液。
一般使用的终浓度为0.03％～0.3％或者为200IU／m1。
在37℃恒温摇床上消化15～45min。
用胶原酶消化组织的时间与组织的类别很有关系，对于某些肿瘤组织或其它较坚硬致密结缔组织，消化时间可为数小时甚至数天。
也可以将消化液及欲消化的组织块加在一小的三角烧瓶内，内置磁棒，在可加温的磁力搅拌器上进行消化处理。
3）离心除去含酶溶液。
4）用培养液重新悬浮细胞。
5）计数并调整细胞密度。
拟用于种植或其它处理。
（3）有关酶学解离细胞法的讨论：
用酶消化法解离细胞总的来说对细胞的损害程度较之机械分散法为轻，尤其是
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