工农业废料玉米浆和豆饼粉浓...docx
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工农业废料玉米浆和豆饼粉浓度
对松茸胞外多聚物产率的影响
Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｗａｓｔｅｃｏｒｎｓｔｅｅｐｌｉｑｕｏｒａｎｄ
ｓｏｙｂｅａｎｌｍｅａｌｏｎｔｒｉｃｈｏｌｏｍａｍａｔｓｕｔａｋｅｅｘｏ-ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
吴昊李婷婷刘东来张地孟庆繁
ＷＵＨａｏＬＩＴｉｎｇ-ｔｉｎｇＬＩＵＤｏｎｇ-ｌａｉＺＨＡＮＧＤｉＭＥＮＧＱｉｎｇ-ｆａｎ
（吉林大学生命科学学院吉林长春130012）
（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅＪｉｌｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｈａｎｇｃｈｕｎＪｉｌｉｎ130012Ｃｈｉｎａ）
摘要：
利用工农业废料作为廉价培养基培养名贵药食用真菌松茸从而获得其有效成分胞外多聚物。
通过单因素试验选取试验因素与水平在单因素试验的基础上以培养基中玉米浆浓度和豆饼粉浓度为响应因子胞外多聚物产率为响应值做两因素五水平的中心组合试验。
培养基中玉米浆浓度为9．07％豆饼粉浓度为10．43％时胞外多聚物产率最大可达36．20ｇ／Ｌ比传统试验试剂培养基提高了2．6倍这对实现新生物技术产业化具有重要的理论与实践意义。
关键词：
工农业废料；松茸胞外多聚物；响应面分析法
Ａｂｓｔｒａｃｔ：
Ｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｃａｐａｂｉｌｉｔｙｏｆｉｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｗａｓｔｅｂｅｉｎｇｌｏｗｃｏｓｔｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｏｎｔｈｅｅｘｏ-ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇｔｈｅｍｏｓｔｖａｌｕａｂｌｅａｎｄｈｉｇｈ-ｃｌａｓｓｅｄｉｂｌｅｆｕｎｇｕｓＴｒｉｃｈｏｌｏｍａｍａｔｓｕｔａｋｅ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｃｏｒｎｓｔｅｅｐｌｉｑｕｏｒａｎｄｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌｏｎｔｈｅｅｘｏ-ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｐｒｏｄｕｃ-ｔｉｏｎｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｂｙｍｅａｎｓｏｆｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｔｅｓｔｓａｎｄｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（ＲＳＭ）ｂａｓｅｄｏｎａｆｉｖｅ-ｌｅｖｅｌｔｗｏ-ｆａｃｔｏｒｃｅｎｔｒａｌｃｏｍｐｏｓｉｔｅｄｅ-ｓｉｇｎ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｆａｃｔｏｒｓａｎｄｌｅｖｅｌｓｗｅｒｅｆｉｒｓｔｓｅｌｅｃｔｅｄｂｙｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｔｅｓｔｓ．Ｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｔｈｉｓｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｃｏｒｎｓｔｅｅｐｌｉｑｕｏｒａｎｄｓｏｙ-ｂｅａｎｍｅａｌｗｅｒｅｃｈｏｓｅｎａｓｔｈｅｆａｃｔｏｒｓｉｎＲＳＭａｎｄｅａｃｈｆａｃｔｏｒｉｎｔｈｅｄｅｓｉｇｎｗａｓｓｔｕｄｉｅｄａｔｆｉｖｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｖｅｌｓ．Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄｖａｌｕｅｓｏｆｔｈｅｆａｃｔｏｒｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ：
ｃｏｒｎｓｔｅｅｐｌｉｑｕｏｒ9．07％ｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌ10．43％ａｎｄａｍａｘｉ-ｍｕｍｅｘｏ-ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ36．2ｇ／Ｌｗｈｉｃｈｗａｓ2．6ｔｉｍｅｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｅｃｏｓｔｌｙｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｄｉｕｍ．Ｉｔｗａｓｌｏｗｃｏｓｔｂｙｕｓｉｎｇｃｈｅａｐａｎｄａ-ｂｕｎｄａｎｔｓｏｕｒｃｅｏｆｉｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｗａｓｔｅｔｏｒｅｐｌａｃｅｔｈｅｅｘｐｅｒｉ-ｍｅｎｔａｌｒｅａｇｅｎｔｓａｓａｍｅｄｉｕｍｆｏｒｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇＴｒｉｃｈｏｌｏｍａｍａｔｓｕｔａｋｅａｎｄｈａｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄｐｒａｃｔｉｃａｌｍｅａｎｉｎｇｔｏｔｈｅｒｅａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｎｅｗｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｄｕｓｔｒｙ．
基金项目：
2007年雅鹿吉林大学大学生科技创新基金资助项目（项目编号：
2007ＣＸ20）
作者简介：
吴昊（1986－）男吉林大学生命科学学院在读本科生。
Ｅ-ｍａｉｌ：
ｗｕｈａｏ334＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
通讯作者：
孟庆繁
收稿日期：
2008－04－26
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：
Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｗａｓｔｅ；Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａｍａｔｓｕｔａｋｅｅｘｏ-ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ；Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ
松茸（ＴｒｉｃｈｏｌｏｍａｍａｔｓｕｔａｋｅＳｉｎｇ．）又名松口蘑属于担子菌纲、伞菌目、口蘑科、口蘑属［1］是一种与松树共生形成菌根的珍稀食、药用真菌在国际市场上享有“蘑菇之王”的赞誉。
松茸多糖及蛋白是其重要活性成分具有明显的增强机体免疫能力和很强的抗肿瘤活性。
然而松茸是一种典型的难培养真菌迄今尚无人工纯培养栽培出子实体成功的报道［2］。
采用深层培养方法生产松茸并从中提取包括多糖及蛋白等多聚物成分以弥补野生松茸资源的严重缺乏已经成为生物工程领域研究的重要课题。
但是使用试验试剂培养基成本高不利于大规模产业化生产为此采用价格低廉且来源丰富的工农业废料玉米浆和豆饼粉来取代试验试剂作为培养基的成分进行发酵试验并提取其胞外多聚物这使成本大大降低。
本试验利用工农业废料液体深层发酵松茸将单因素和响应面分析法［3］应用于松茸胞外多聚物产率的优化为松茸产业化生产奠定了理论基础。
1材料和方法
1．1材料与仪器
菌株：
松茸（ＣＧＭＣＣ5．0793）：
中国科学院微生物研究所；
培养基：
斜面培养基采用ＰＤＡ培养基即200ｇ土豆的煮出滤汁葡萄糖20ｇＫＨ2ＰＯ43ｇＭｇ2ＳＯ4·7Ｈ2Ｏ1．5ｇＶＢ150～100ｍｇ加20ｇ琼脂补水至1000ｍＬ；
种子培养基：
配制方法同斜面培养基不加琼脂；
发酵培养基：
玉米浆、豆饼粉、ＫＨ2ＰＯ40．1％、ＭｇＳＯ4·
7Ｈ2Ｏ0．05％、ＣａＣｌ20．02％、ＶＢ10．001％。
ＨＺＱ-Ｆ160全温振荡培养箱：
哈尔滨市东联电子技术开
发有限公司；
ＭｇＳＯ4·7Ｈ2Ｏ0．05％、ＣａＣｌ20．02％、ＶＢ10．001％。
培养基
装液量50ｍＬ／250ｍＬ接种量4％在26℃125ｒ／ｍｉｎ摇床上培养4ｄ后测定胞外多聚物产量。
结果如图1。
ＢＰ221Ｓ型电子天平：
德国塞多利斯；
ＳＫＰＣ-01电热恒温鼓风干燥箱：
湖北省黄石市医疗器械厂；
可调式微量取液器：
德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ；
ＭＬＳ-3750型高压自动灭菌锅：
日本ＳＡＮＹＯ；
超净工作台：
苏净集团安泰公司；
ＳＨＢ-ＩＩＩ型循环水式多用真空泵：
郑州长城科工贸公司；
Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ5810Ｒ高速冷冻离心机：
德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ；
玉米浆、豆饼粉、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、
ＶＢ1、95％乙醇。
1．2培养方法
1．2．1种子培养方法将斜面母种接入ＰＤＡ综合培养基中于26℃下活化培养7ｄ。
斜面菌株活化后接入液体种子培养基在26℃125ｒ／ｍｉｎ的摇床培养4ｄ。
1．2．2摇瓶发酵方法将种子液按4％接种量接入发酵培养基26℃125ｒ／ｍｉｎ摇床培养4ｄ。
发酵结束后测定胞外多聚物产率。
1．3胞外多聚物的测定方法
将发酵液离心（5500ｒ／ｍｉｎ10ｍｉｎ）上清液加95％乙醇至终浓度为80％剧烈震荡4℃醇析24ｈ离心沉淀烘干至恒重称重。
1．4胞外多聚物产率计算
胞外多聚物产率（ｇ／Ｌ）＝胞外多聚物质量（ｇ）／发酵液体积（Ｌ）
1．5发酵培养基不同组分对松茸胞外多聚物产率的影响
在发酵培养过程中培养基各组分的浓度对最终发酵产
物的产量有很大影响。
利用单因子试验观察了培养基中玉
图1玉米浆浓度对松茸胞外多聚物产率的影响
Ｆｉｇｕｒｅ1Ｅｆｆｅｃｔｏｆｃｏｒｎｓｔｅｅｐｌｉｑｕｏｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎｅｘｏ-ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
从图1可明显看出随着玉米浆浓度从1％～9％胞外多聚物的产率逐渐增加玉米浆浓度为9％时胞外多聚物产率最大为10．4ｇ／Ｌ。
玉米浆浓度增加到10％胞外多聚物产率反而有所降低。
这说明较高浓度玉米浆对胞外多聚物的产生有一定的抑制作用。
因此选取玉米浆浓度9％进行以下试验。
2．1．2豆饼粉浓度对胞外多聚物产率的影响豆饼粉是大豆（主要是黄豆和黑豆）榨油后的副产品。
从油料中提取的常用方法有两种即压榨法和有机溶剂浸提法采用压榨法提取油之后的大豆剩余物大多数压制成饼状所以被称作豆饼。
一般来讲每千克豆饼的干物质中粗蛋白质含量在40％以上。
试验设培养基中豆饼粉浓度分别为6％8％10％12％14％玉米浆浓度为9％ＫＨ2ＰＯ40．1％、ＭｇＳＯ4·7Ｈ2Ｏ0．05％、ＣａＣｌ20．02％、ＶＢ10．001％。
培养基装液量50ｍＬ／250ｍＬ接种量4％在26℃125ｒ／ｍｉｎ摇床上培养4ｄ后测定胞外多聚物产量。
结果见图2。
米浆和豆饼粉浓度对胞外多聚物产率的影响。
在单因子试验的基础上根据中心组合试验设计原理［45］采用响应面法在两因素五水平上对松茸胞外多聚物产率的发酵培养基组成进行了优化。
2结果与分析
2．1单因素试验
2．1．1玉米浆浓度对胞外多聚物产率的影响玉米浆（ＣＳＬ）是玉米淀粉等产品加工过程中的浸泡水经浓缩至含固形物70％左右后得到的副产品［6］。
制造玉米淀粉须将玉米粒先用亚硫酸浸泡浸泡液浓缩即制成黄褐色的液体即为玉米浆。
玉米浆中含有丰富的可溶性蛋白、生长素和一些前体物质是微生物生长很普遍应用的有机氮源。
试验设培养
基中玉米浆浓度分别为1％2％3％4％5％6％7％8％9％10％豆饼粉浓度为2％ＫＨ2ＰＯ40．1％、从图2可看出豆饼粉浓度从6％增加到10％胞外多聚物产率迅速增加10％以后胞外多聚物产率变化不大因此
选取豆饼粉浓度为10％。
2．2培养基的响应面优化
根据单因素探索的试验结果以培养基中玉米浆、豆饼粉浓度两个因素为自变量胞外多聚物产率为响应值采用响应面分析法在两因素五水平上对废料培养基的组成进行优化以达到最大限度获取松茸胞外多聚物的目的。
试验因素与水平设计见表1。
复5次用以估计试验误差。
采用ＳＡＳＲＳＲＥＧ程序对所得数据进行回归分析获得松茸胞外多聚物产率对编码自变量玉米浆、豆饼粉浓度的二次多项回归方程：
Ｙ＝35．28569＋1．245417ｘ1＋2．400417ｘ2－2．937144ｘ1ｘ1－1．90625ｘ1ｘ2－2．631519ｘ2ｘ2其中Ｙ为胞外多聚物产率ｘ1和ｘ2分别是玉米浆、豆饼粉浓度的编码自变量。
二次响应面模型的变量分析结果见表3。
试验号
ｘ1
ｘ2
胞外多聚物产率／（ｇ·Ｌ－1）
1
－1
－1
22．75
2
－1
1
31．10
3
1
－1
29．78
4
1
1
30．50
5
－2
0
22．00
6
2
0
26．26
7
0
－2
20．42
8
0
2
30．29
9
0
0
38．25
10
0
0
31．40
11
0
0
36．00
12
0
0
36．30
13
0
0
36．85
参数
参数估计
标准误
ｔ值
Ｐｒ>｜ｔ｜
ｘ1
1．24542
0．65272
1．90805
0．09804
ｘ2
2．40042
0．65272
3．67757
0．00789
ｘ1ｘ1
－2．9371
0．47236
－6．2181
0．00044
ｘ1ｘ2
－1．9063
1．1305
－1．6861
0．13563
ｘ2ｘ2
－2．6315
0．47236
－5．5711
0．00084
方差来源
自由度
平方和
均方
Ｆ值
Ｐ>Ｆ
回归
5
380．49
76．098
14．885
0．0013
线性
2
87．757
43．878
8．5826
0．0131
平方
2
278．20
139．10
27．208
0．0005
交互
1
14．535
14．535
2．8431
0．1356
参差
7
35．787
5．1125
失拟项
3
9．0404
3．0135
0．4507
0．7307
纯误差
4
26．747
6．6868
总离差
12
416．28
水平
ｘ1玉米浆／％
ｘ2豆饼粉／％
－2
7
8
－1
8
9
0
9
10
1
10
11
2
11
12
表1响应面分析因素与水平
Ｔａｂｌｅ1ＶａｒｉａｂｌｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｌｅｖｅｌｓｕｓｅｄｉｎＲＳＭ
其它因素的值分别为ＫＨ2ＰＯ40．1％ＭｇＳＯ4·7Ｈ2Ｏ0．05％ＣａＣｌ20．02％ＶＢ10．001％装液量50ｍＬ／250ｍＬ接种量4％。
对玉米浆Ａ、豆饼粉Ｂ各水平进行如下编码：
ｘ1＝（Ａ－9）／1ｘ2＝（Ｂ－10）／1以ｘ1ｘ2为自变量以胞外多聚物产率Ｙ为响应值分析方案及试验结果见表2。
表2响应面分析方案及试验结果
Ｔａｂｌｅ2ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｓｉｇｎａｎｄｒｅｓｕｌｔｓｏｆＲＳＭ
表2中试验1～8为析因试验9～13为中心试验。
13个试验点分为析因点和零点其中析因点为自变量取值在ｘ1ｘ2所构成的三维顶点；零点为区域的中心点零点试验重
表3胞外多聚物产率的ＡＮＯＶＡ回归分析结果
Ｔａｂｌｅ3ＡＮＯＶＡｒｅｓｕｌｔｓｆｏｒｔｈｅｅｘｏ-ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍＲＳＭ
从表3可以看出整个模型的Ｐ值为0．0013说明该模型能够较好的预测胞外多聚物产率。
方程的相关系数Ｒ2为91．40％表明回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系也说明91．40％的变量可以用这个模型来解释。
各因素的影响可以根据ｔ检验和Ｐ值来确定ｔ检验的结果越大Ｐ值越小则说明因素的影响越显著（表4）。
表4回归方程偏回归系数的估计值
Ｔａｂｌｅ4Ｔｈｅｌｅａｓｔ-ｓｑｕａｒｅｓｆｉｔａｎｄｐａｒａｍｅｔｅｒｅｓｔｉｍａｔｅｓ
从表4可以看出从单个因素对响应值的影响来看ｘ2豆饼粉对胞外多聚物产率具有显著的正效应它的Ｐ值为0．00789。
其次为ｘ1玉米浆对于结果具有较显著的正效应Ｐ值为0．09804。
在各2次项中ｘ1ｘ1和ｘ2ｘ2均具有显著的负效应它们的Ｐ值分别为0．00044和0．00084。
交互项ｘ1ｘ2对结果的影响并不显著。
根据回归分析结果做出相应的响应曲面图及其等高线图以确认培养基中玉米浆、豆饼粉浓度对胞外多聚物产率的影响结果如图3。
图3Ｙ＝ｆ（ｘ1ｘ2）的响应面及等高线图
Ｆｉｇｕｒｅ3Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｐｌｏｔｓｏｆｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｃｏｒｎｓｔｅｅｐｌｉｑｕｏｒａｎｄｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌ
从响应面的最高点和等高线可以看出在所选的范围内存在极值响应面的最高点同时也是等值线中的最小椭圆的中心点。
从图3可以看出ｘ1与ｘ2的交互作用并不显著它们对Ｙ值的影响规律并不会随着另一因素的改变而有明显变化。
同时也可以看出ｘ2对Ｙ值影响的显著性要大于ｘ1。
ｘ2在低浓度（编码值为－2）ｘ1编码值从－2增加到1时Ｙ值逐渐增加ｘ1编码值从1增加到2时Ｙ值出现略微降低。
而ｘ2在高浓度（编码值为2）ｘ1编码值从－2增加到－0．5时Ｙ值略微增加ｘ1编码值从－0．5增加到2时Ｙ值显著降低。
ｘ1编码值从－2增加到2ｘ2对Ｙ值的影响规律变化没有ｘ2编码值增加ｘ1对Ｙ值的影响规律变化大。
因此ｘ2浓度发生变化时ｘ1对Ｙ值的影响规律变化较明显ｘ2对Ｙ值影响的显著性要大于ｘ1。
两个因素对Ｙ值的影响以及其交互影响与回归分析结果吻合。
ＳＡＳ工具箱给出了能够得到最大响应值（Ｙ）的ｘ1ｘ2对应的编码值ｘ1＝0．072ｘ2＝0．430。
即在玉米浆浓度为9．07％豆饼粉浓度为10．43％时胞外多聚物产率有最大值35．85ｇ／Ｌ。
2．3验证试验
为了检验模型预测的准确性按最佳培养基配方进行发酵培养试验重复3次进行。
结果3个平行的平均胞外多聚物产率为36．20ｇ／Ｌ与理论预测值相比相对误差为0．986％可见该模型能较好地模拟和预测试验胞外多聚物产率。
3结论
本试验通过单因素试验对影响松茸胞外多聚物产率的培养基中玉米浆和豆饼粉浓度进行了探索选取中心组合试验的范围和水平应用响应面分析法对各因素的最佳水平范围及其交互作用进行了研究和探讨建立了影响胞外多聚物产率的2次多项数学模型依据回归分析结果松茸胞外多聚物产率最大的最佳培养基配方为：
玉米浆9．07％豆饼粉10．43％。
在此条件下胞外多聚物产率为36．20ｇ／Ｌ与模型理论预测值35．85ｇ／Ｌ的相对误差为0．986％。
前期研究发现利用试验试剂培养基（蔗糖4．5％、酵母粉0．45％、（ＮＨ4）2ＳＯ40．45％、葡萄糖2％、ＫＨ2ＰＯ40．2％、ＭｇＳＯ40．1％、ＣａＣｌ20．02％、ＶＢ10．001％）深层培养松茸胞外多聚产率为9．995ｇ／Ｌ工农业废料玉米浆和豆饼粉作为培养基成分可以替代传统的价格昂贵的试验试剂培养基而胞外多聚物产率可以提高2．6倍。
试验结果证明利用工农业废料作为原料培养松茸从而获得其有效成分胞外多聚物可以降低成本同等成本可以扩大生产规模对实现新生物技术产业化具有重要的理论与实践意义。
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