三种荧光定量PCR检测方法比较.docx

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三种荧光定量PCR检测方法比较

三种荧光定量PCR检测方法比较

定量pcr：

以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。

定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。

常见荧光定量PCR检测方法可分为以下几类：

（1）SYBRGreenI检测模式

SYBRGreenI是一种能及双链DNA结合发光的荧光染料。

其及双链DNA结合后，荧光大大增强。

因此，SYBRGreenI的荧光信号强度及双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。

SYBRGreenI的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。

PCR扩增程序一般为94℃～55℃～72℃三步法，40个循环。

SYBRGreenI的缺点：

由于SYBRGreenI没有特异性，不能识别特定的双链，只要是双链就会结合发光，对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，所以在临床上使用可能会有假阳性发生。

SYBRGreenI的优点：

SYBRGreenI的优点是因为其缺点产生，由于它能所有的双链 DNA相结合，所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针，通用性较好，并且价格相对较低。

这对科研是很有利的，因此国内外在科研中使用比较普遍。

（2）水解探针模式（taqman探针）

TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。

当探针及靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因及3’端的淬灭剂接近而被淬灭。

在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团及淬灭剂分离，发射荧光。

一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。

随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。

因此Taqman探针检测的是积累荧光。

PCR扩增程序通常是：

94℃～60℃40个循环。

常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。

（3） 杂交探针模式（Beacon、FRET）

分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团及标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。

荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。

分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并及目标序列互补;茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。

荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂则标记在另一端。

在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将及模板配对。

及模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团及淬灭剂分开。

当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。

由于是酶切作用的存在，分子信标也是积累荧光。

常用的荧光基团：

FAM，TexasRed。

PCR扩增程序通常是：

94～55～72℃三步法，40个循环。

FRET探针又称双杂交探针，FRET探针由两条相邻探针组成，在一条探针的5`端标记FAM荧光基团，另一探针的3`端标记Red640荧光基团。

当复性时，探针结合在模板上，FAM基团和Red640基团相邻，激发FAM产生的荧光，作为Red640基团的激发光被吸收，使Red640发出波长为640的荧光。

当变性时，探针游离，两基团距离远，不能产生640波长的荧光。

由于FRET探针是靠近发光，所以检测信号是实时信号，非累积信号。

常用的荧光基团是：

LC-Red640，LC-Red705。

能用于实时荧光PCR定量的方法很多，各有优缺点，应根据实验的需要和当前的实验条件选择适合自己的方法。

下面为各种方法的比较：

实验中的一些好习惯：

加入试剂之前，把它混匀一下，以免放置时间长了浓度不均;移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性。

一定要记着关水浴箱，切记切记;多和大家讨论，同时多关注别人讨论的经验，这几乎是最快提高的捷径了;所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因。

防止RNA酶污染的措施：

1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。

2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：

有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。

3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。

4.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37℃处理12h以上。

然后用高压灭菌除去残留的DEPC。

不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。

6.设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。

常用的RNA酶抑制剂：

1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：

是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。

它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

2.异硫氰酸胍：

目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。

它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。

3.氧钒核糖核苷复合物：

由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。

4.RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：

从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。

RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。

5.其它：

SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

因为DEPC不加选择的修饰蛋白质和RNA，因此在分离和纯化RNA过程中不能使用，而且它及一些缓冲液（例如Tri）不能相容

在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。

而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。

RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。

研究人员造成的污染RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。

因此进行RNA实验时应勤换手套。

但DEPC能及胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理

动植物总RNA提取-Trizol法：

Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。

用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。

RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly（A）+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。

1.将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。

2.研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。

3.取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。

4.弃去上清液，按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。

5.小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。

然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。

RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

[注意]

1.整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。

另外，提取上清这步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然会有蛋白质污染，影响比值

2.加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。

总mRNA的提取经验：

一、关于TrizolReagent需要的试剂

1.Chloroform：

氯仿（分析纯）

2.Isoproplylalcohol：

异丙醇（分析纯）

3.75%Ethanol（inDEPC-treatedwater）：

75%乙醇。

要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。

4.RNase-freewater：

无Rnase的水。

方法是：

将DEPC按0.01%（V/V）加在dH2O中500ml（50ul），在37℃过夜，并高压灭菌即得（150℃3小时）

5.一次性塑料手套

6.注意：

DEPC有致癌之嫌

二、关于TrizolReagent的使用过程：

1.Homogenization（匀浆）

a.Tissues：

组织

每100mg组织匀浆加1mlTrizol试剂，样品体积不能超过Trizol试剂的10%。

b.CellsGrowninmonolayer（单层细胞接毒后出现病变的）

针对JEV细胞总RNA的抽提法：

BHK21细胞长成单层后，接毒0.5-1ml（采用大瓶），37℃吸附1h，倒掉，加维持液（含2%的血清和HEPE8的MEM）约5ml，维持天。

出现75%-100%的病变时，以PBS（预冷）冲洗细胞两次，直接在细胞瓶中加入Trizol试剂1ml/10cm2，吹吸几次，以裂解细胞（细胞瓶有两种常用规格：

大的约45cm2，小的约30cm2，故所用Trizol试剂分别约为4.5ml和3ml。

Trizol试剂的加入是依细胞瓶而定，以盖满瓶底为度，而不是依据细胞的数量，否则可导致DNA的污染）具体方法如下：

（样品一定要新鲜）

（1）组织接入预冷的EP管中，加入Trizol试剂1ml/10cm2（量一定要加足，否则易污染），混匀，吹吸几次，以破裂细胞，置室温5min，以使核蛋白复合物彻底分离。

（2）加氯仿0.2ml（每1mlTrizol试剂加入氯仿0.2ml），盖好，剧烈震荡15s，置室温2-3分钟。

（3）4℃离心，10000g×15min，离心后，混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、上层为无色的水相。

RNA包含在水相中，水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%。

（4）仔细吸取上层水相，移至另一EP管中。

（5）加0.5ml异丙醇，以沉淀RNA（每1mlTrizol试剂加入0.5ml异丙醇），置室温10min。

（6）4℃离心，10000g×10min。

RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁。

（7）弃上清液，加入预冷的75%乙醇1ml（每1mlTrizol试剂加入75%乙醇至少1ml），震荡，充分洗涤沉淀，4℃离心，5500g×5min。

弃上清液，空气干燥（或真空干燥）后，沉淀重悬于无RnasedH2O中，吹吸几次，55℃-60℃作用10分钟以溶解RNA，-70℃保存备用。

（8）抽提出的细胞总RNA干燥后加水50ul，取10ul加无Rnase水990ul，稀释100倍成1ml。

于0.5cm厚的石英比色杯中，以无Rnase水为对照，在721型紫外分光光度计下检测，结果应为：

A260/280ratio<1.6。

（9）分离组织10mg（纯组织）加800ulTrizol试剂。

（10）扩增产物的鉴定。

DEPC处理方法如下：

1.DEPC处理：

（1）DEPC水：

100ml超纯水加入0.2mlDEPC，充分混匀，高压灭菌。

（2）Tip头（枪头）、EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材（包括1ml、200μl、20μlTip头;EP管和PCR反应管等）：

用0.1%的DEPC水（1000ml超纯水加入1mlDEPC）37℃浸泡过夜，高压灭菌。

2.提取RNA，用DEPC水溶解。

3.RT：

我是用PCR仪来控制温度和时间的，所以RT是在PCR反应管中作的。

4.操作过程中要戴一次性手套，并经常换手套。

最好把要直接接触样品的东西都用DEPC水处理一下，枪头盒插好枪头后，加入1-2ml的0.1%DEPC水，在灭菌就行了;现在有进口的RNASEFREE的枪头买，直接用不用处理的。

如何消除污染：

机器运行完后，取出PCR产物时不能随便丢弃，应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。

（1）试剂：

mixer尽量分装，不要原瓶多次取用。

（2）加样：

原则是DNA最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。

如果是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均匀之后再分装到各个管子里去，这样可以有效地避免误差及污染。

另外，普通实验室容易污染，且污染程度很高，及跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系，最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。

目前，国内外各个公司提供的诊断试剂盒大多采用了UNG来防污染。

Uracil-DNAN-glycosylase（UNG）尿嘧啶DNA糖基酶，来源于大肠杆菌重组克隆表达。

RNA定量：

RNA也最好至少要用电泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。

至于用分光光度计比较不同标本之间就更不准了。

RNA的贮藏，最主要的是温度，-20不够，最好-80，液氮最保险。

mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因为还有翻译效率和RNA降解速度的影响。

RT-PCR有两种做法：

条件具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。

两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，由此推测是体系更加单一比较利于PCR的进行。

一定要做内参的，不作内参的结果是不可信的。

电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量mRNA的分离及纯化中。

步骤（4）中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNAPoly（A+）尾处的二级结构，使Poly（A+）尾充分暴露，从而提高Poly（A+）RNA的回收率;另一个目的是能解离mRNA及rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。

所以此步骤不能省略。

下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。

保温试验：

方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000ng的RNA加入至0.5ml的离心管中，并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10ul的总体积，然后密闭管盖。

把其中一份放入70℃的恒温水浴中，保温1h。

另一份放置在-20℃冰箱中保存1h。

时间到了之后，取出两份样本进行电泳。

电泳完成后，比较两者的电泳条带。

如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件），则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。

相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。

PCR污染及对策：

PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，所以，扩增区的仪器什么如枪头等要注意。

还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气及液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。

1.标本处理区，包括扩增摸板的制备;

2.PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增;

3.产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。

各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。

如：

标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。

切记：

产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。

使用一次性吸头，严禁及PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染;

操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度。

反应液污染

可采用下列方法之一处理：

DNaseI法：

PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5UDNaseI，室温反应30min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。

该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列;

尿嘧啶糖苷酶（UNG）法：

由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。

1、提取mRNA时所用的EP管、玻璃等器皿全部都要用0.1%DEPC水浸泡。

然后烘干，高压灭菌，再烘干。

2、用DEPC水洗过后当然不能用双蒸水洗了。

那你用DEPC处理还有什么意义呢?

还要用双蒸水洗吗?

3、玻璃器皿干烤：

180度，8小时或更长时间;小器皿也可以用少许氯仿处理一下。

另外，铁制品、研砵等也可倒上酒精直接烧。