植物染色体标本制备.docx

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植物染色体标本制备

用Hcl是使得用作制片的组织材料，细胞疏散而解离，有利于压片。

实验9、植物染色体标本制备及核型分析

目前，国内外常用的植物染色体制片技术可以分为两种，即压片技术和去壁低渗技术。

Belling（1921）提出植物染色体压片技术后，压片已成为植物染色体研究中最广泛应用的常规技术；但是由于植物细胞有坚实的细胞壁，染色体很难象动物染色体那样平整地贴在载玻片上，Omura和Kurata（1978）把植物原生质体技术应用到水稻染色体研究之中，用纤维素酶、果胶酶和0.075mol.L-1氯化钾处理取得了一定的进展，陈瑞阳等人（1979、1982）提出了植物染色体标本制备的酶解去壁低渗技术，并在多种植物上得到广泛应用，成为当今植物染色体研究中的重要方法。

压片技术和去壁低渗技术在取材和预处理要求及其操作都是相同的，即两者的材料基础条件是相同的，但它们所采用的染色体分散方法是不同的。

压片法是以人工外加机械压力使染色体分散，而去壁低渗法是用酶分解细胞壁，低渗液使细胞膜吸胀、水表面张力使染色体分开。

两种技术各有其优缺点，前者操作快速简便、省材省时，后者染色体易于展开、且真实不变形，尤其是对成熟细胞多的植物组织，如芽、愈伤组织等材料有独到效果，本实验主要介绍去壁低渗染色体制片技术。

一、实验目的

1、掌握植物根尖、茎尖及叶片去壁低渗染色体制片技术，通过3周开放性实验教学，进行植物染色体制片技能训练；

2、掌握植物染色体显微照象技术及组型分析技术，通过大量的制片观察，能获得图象清晰、完整、高度分散的染色体典型制片；通过显微摄影，获得某植物染色体自然核型图，并能用国内外通用的植物核型分析标准，确定该植物染色体模型图、核式公式及类型；

3、掌握植物有丝分裂制片技术，通过大量的制片观察，能比较快速准确地判断细胞有丝分裂前、中、后、末期的染色体图象，并对其典型制片照像，收集核型分析及有丝分裂过程观察的染色体制片素材；

4、结合实验，对某一新资源植物进行染色体组型分析，获得该物种染色体组型公式、类型、核型图及核型模式图。

二、实验内容

1、植物染色体制片技术训练，独立完成植物根尖、茎尖及幼叶的取材、预处理、低渗、酶解、固定、制片、染色等去壁低渗染色体制片全过程，并获得图象清晰、完整、高度分散的染色体典型图象制片；

2、染色体显微照相技术训练，用生物摄影显微镜，摄制某新资源植物种典型的染色体图象照片40张，并从中挑选确定，被用于核型分析的染色体自然核型图5张；

3、植物染色体核型分析技术训练，用国内外植物染色体核型分析标准，确定该新资源植物种的染色体组型公式、类型、核型图及核型模式图；进行该新资源植物种染色体核型分析，力争能将该新资源植物实验结果，撰写成一篇研究小论文，或一篇能发表的研究论文；

4、细胞有丝分裂典型时期识别技能训练，通过大量的染色体图象观察，能比较快速准确地判断细胞有丝分裂前、中、后、末各个时期的。

三、实验材料

1、蚕豆根尖，2n=2x=12;

2、某新资源植物茎尖、幼叶或子房，如显齿蛇葡萄、泥蒿、鱼腥草等有开发潜力的新资源植物种的茎尖、幼叶或子房。

四、实验器材

1、设备：

普通生物显微镜、NIKON数码摄影显微镜、NIKON数码相机、计算机图象处理系统、培养箱、恒温水浴锅、喷墨彩色打印机等；

2、用具：

载玻片、盖玻片、眼科镊子、不锈钢剪刀、单面刀片、磨口三角瓶、移液管、试剂瓶、凹型孔白瓷板、玻璃板、烧杯、天平、电炉、染色缸、扩大镜、游标卡尺、滤纸片、玻片标签纸等；

3、药品：

8－羟基喹啉、秋水仙素、氯化钾、甲醇、冰乙酸、纤维素酶、果胶酶、对二氯苯、氯化钠、柠檬酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氢氧化钡、甘油、盐酸、胰蛋白酶、尿素、氯化钙、EDTA、Giemsa、洋红、地衣红、卡宝品红、锡夫（Schiff）试剂。

附试剂配制

⑴0.002mol.L-18－羟基喹啉配制：

取8-羟基喹啉0.29g，先用少许乙醇溶解，用鲜蒸馏水定溶1000ml。

⑵0.01%秋水仙素配制：

称取1g秋水仙素，用少许乙醇溶解后，用鲜蒸馏水定溶至100ml。

⑶饱和对二氯苯溶液配制：

鲜配鲜用，称取5g对二氯苯结晶，用40-45℃蒸馏水100mL溶解，振摇5min，静置1h，取上清液，10-20℃下预处理。

⑷0.075mol.L-1KCL溶液配制：

称KCL5.592g，加少许鲜蒸馏水溶解后，定溶至1000ml。

⑸2.5%混合酶配制：

常用浓度2.5%，取纤维素酶、果胶酶各1g，分别溶于20mL蒸馏水中，配成5%的纤维素酶及果胶酶，再等量混合，配成2.5%浓度混合酶，溶后用0.1mol.L-1盐酸或0.1mol.L-1NAOH调pH值为5.5左右，鲜配鲜用或棕色瓶4℃下保存备用。

⑹2XSSC溶液配制：

2XSSC溶液即0.3mol.L-1氯化钠与0.03mol.L-1柠檬酸钠Na3C6H5O7溶液。

称氯化钠17.53g,Na3C6H5O78.8233g,加少许鲜蒸馏水溶解后，定溶至1000ml。

⑺Sorensen磷酸缓冲液配制。

A液：

0.067mol.L-1磷酸二氢钾溶液，称取KH2PO49.118g，用少许鲜蒸馏水60℃下溶后，定溶至1000ml。

B液：

0.067mol.L-1磷酸氢二钠溶液，称取Na2HPO.12H2O,23.995g,用少许鲜蒸馏水60℃下溶后，定溶至1000ml；根据使用时pH值的要求按下例比例混合。

pH值：

6.56.66.76.86.97.07.17.27.37.4

A液：

68.762.857.051.044.838.833.027.622.318.2

B液：

31.337.243.049.055.261.267.072.577.781.8

⑻Giemsa母液配制：

：

取Giemsa1g，甲醇66ml，优质甘油66ml；先将Giemsa加适量甘油充分研磨60min，无颗粒时倾尽全部甘油充分磨匀，然后在56℃下，保温2h，冷却后再加入甲醇（GR或AR），充分混合，盛入棕色瓶内，4℃下保存备用，保存的时间越久越好。

⑼Giemsa染液：

染色前鲜配鲜用，按Giemsa母液：

Sorensen磷酸缓冲液=1：

10稀释后用。

⑽45%醋酸溶液配制：

95%冰乙酸，稀释成45%浓度。

所需浓度（45%）=冰乙酸体积／溶液体积=45ml冰乙酸×0.95／（45+50），

⑾0.1mol.L-1盐酸溶液配制：

用滴定管量取浓盐酸8.25ml，加蒸馏水至1000ml。

⑿饱和氢氧化钡溶液配制：

鲜配鲜用，称取5-8g氢氧化钡，用100mL煮沸的蒸馏水溶解，振摇充分溶解，待冷却后过滤，配成5%-8%的饱和氢氧化钡水溶液

⒀1mol.L-1磷酸氢二纳溶液配制：

称取Na2HPO.12H2O156.01，用少许鲜蒸馏水60℃下溶后，定溶1000ml。

⒁0.85%生理盐水溶液配制：

称取0.85g氯化钠溶于100ml蒸馏水中。

⒂0.01%胰蛋白酶溶液配制：

取活性单位1：

250胰蛋白酶0.1g，Hank’液100ml，先用少许Hank’液溶解胰蛋白酶，然后再将余液加入，置于37℃水溶液中溶解1h，（时间长短取决于溶解度，待溶液全部透切清凉为止）。

溶解后用除菌过滤器过滤，无菌分装，密封，贴好标签，置于-20℃冰箱中保存，使用前用0.1mol.L-1NAOH调pH值为7.6-7.8。

⒃Hank’原液配制：

称取1.4g氯化钙溶于30-50ml的重蒸馏水中；取1000ml的烧杯及容量瓶各一个，先加入重蒸馏水800ml于烧杯中，再分别称取氯化纳80.0g、Na2HPO4.12H2O，0.6g、氯化钾4.0g、KH2PO40.6g、MgSO4.7H2O2.0g、葡萄糖10.0g（含1分子水时为11.0g），均在前一药品完全溶解后，方可加入后一药品，直到完全溶解后，定溶至1000ml；用滤纸过滤后，加入氯仿2ml防腐，充分混匀后，分装，贴好标签，4℃下保存。

Hank’缓冲液配制：

Hank’原液100ml，重蒸馏水896ml，0.5%酚红4ml，混匀后，在5.28×104Pa下灭菌，4℃下保存。

使用前用0.1mol.L-1NAOH调pH值为7.6-7.8。

⒄Dhank’溶液或0.02%EDTA钠盐溶液配制：

氯化钠8g，绿化钾0.20g，磷酸氢二纳0.073b，磷酸二氢钾0.20g，无水葡萄糖2.00g，EDTA20mg。

重蒸馏水加至1000ml。

⒅铁醋酸洋红染液配制：

先将50mL45%的醋酸水溶液放入150mL的锥形瓶中煮沸，然后慢慢地加入0.5-1g洋红粉末（注意不要一下倒入，以防溅出），过1-2min后，加入一锈铁钉，再过几分钟后取出铁钉（使染色剂略含铁质，以增强染色性能），继续用微火加热1h后，冷却过滤，即可使用，保存于棕色瓶中（避免阳光直射）。

如无洋红也可用地衣红代替，配制方法同前。

此液常用于植物细胞核，特别是花粉母细胞的涂抹和压碎法染色，效果良好。

⒆席夫（Schiff）试剂配制：

称0.5g碱性品红溶于煮沸的重蒸水（或蒸馏水）中，搅动使充分溶解，冷却至50℃时，过滤于—棕色细口瓶中，加入10mLlNHCl，冷却至25℃左右，加入1g偏亚硫酸钾或钠（Na2S2O5或K2S2O5），振荡使溶解，密封瓶口，置于黑暗和低温处过夜，次日检查，如染色液透明无色或呈淡茶色，即可使用。

如颜色较深，可加入少量优质活性炭（0.5-2g），振荡1min，置4℃冰箱中过夜，经过滤后即可使用。

此液配好后，应紧塞瓶塞，外包黑纸，贮藏于冰箱中。

⒇卡宝品红（Carborfuchsin）试剂的配制:

称3g碱性品红，溶于100ml70%的乙醇中，称为A原液（此液可以长期保存），取10mlA液，加入90ml15%的石碳酸溶液（两周内使用），称为B原液。

使用前，取B原液10ml，加入90ml45%的醋酸和1.8克山梨醇，充分溶解后备用。

此液适用于植物核型分析、染色体形态观察。

五、实验原理

凡是细胞处于活跃增殖状态或经过某种实验处理后进入细胞分裂状态的任何植物组织，如植物根尖、茎尖、幼叶、花蕾、幼花粉、幼胚、核型胚乳、愈伤组织、居间分生组织、茎形成层等细胞分裂状态的植物组织均可以作为染色体分析的实验材料；通过8-羟基喹啉、秋水仙素、对二氯苯等预处理药剂处理，来降低细胞质的粘度，促进染色体缩短分散，障碍纺锤体形成；通过纤维素酶、果胶酶酶解去壁，使分生细胞的原生质体能从细胞壁里压出来，经过精心制片，使染色体周围不带有细胞质或仅有少量的细胞质，获得图象清晰、完整、高度分散的染色体典型图象。

各植物种的染色体数目都是恒定的，二倍体植物体细胞内都含有两组相同的染色体（chromosome），每一条染色体都有两条染色单体（chromatids）。

细胞有丝分裂时，每一条染色单体分向细胞两极，形成子细胞；细胞分裂间期染色单体复制，纵裂并向的两条染色单体往往通过着丝粒（centromere）联在一起。

着丝粒在染色体上的位置是固定的，呈现出一个淡染色区间。

着丝粒的两端是染色体的“两臂”，着丝粒不在中央的染色体，就必然有长臂（q）、短臂（p）之分。

由于着丝粒位置不同，可以把染色体分成中部着丝粒染色体（m）、近中部着丝粒染色体（sm）、近端部着丝粒染色体（st）及端部着丝粒染色体（t）。

有些染色体除了着丝粒之外，还有一段稍窄的淡染色区，叫次缢痕；次缢痕的远端突起，为随体（satellite）。

所谓核型（karyotype）就是指：

一个细胞内的染色体按照一定的顺序排列起来，所构成的染色体图象；通常是将显微摄影得到的染色体照片粘贴或染色体核型分析系统软件处理生成的染色体图象。

所谓组型（idiogram）就是指：

通过许多细胞染色体测量，取其平均值绘制成的染色体模式图；通常是用染色体相对长度（relativelength）、臂指数（amindex）、着丝粒指数（centromereindex）等形态特征参数来描述染色体模式图。

人类染色体研究早在1960年就召开了专门的国际会议，确定了人类染色体核型分析的国际标准，即Denver命名标准；但植物染色体核型分析至今还没有一个专门的国际标准；1984年8月，我国第一次全国植物染色体学术讨论会上，李懋学、陈瑞阳（1984）所作的“关于植物核型分析的标准化问题”报告，经过与会代表的充分讨论，成为大家的约定标准，被同行所承认。

由于染色体是基因的载体，核型代表了种属的特征，所以染色体组型分析对于探讨植物生命奥秘、生物起源、物种间亲缘关系、远缘杂种鉴定等方面都有重要意义。

六、实验方法

（一）植物染色体制片技术及方法

1、正确取材

一般来讲，凡是能进行细胞分裂的植物组织或单个细胞，都可以作为染色体制片材料；如根尖、茎尖、幼花、幼胚、愈伤组织及正在分裂的大、小孢子母细胞等；正确取材就是强调取材部位一定要准确，取材数量一定要少而精、切忌多而杂，材料新鲜、尽可能是活材料。

⑴根尖

用能见根冠的根尖材料作为实验材料比较适宜；植物根尖不同部位的细胞，其分裂细胞频率有明显的差别；根冠是由不同分化程度的薄壁细胞组成，且常含淀粉粒，根冠细胞已经停止细胞分裂，染色体制片时应该切除根冠；但因根冠很容易识别，且根冠后1-2mm长的根段就是根尖分生区细胞，所以，根冠是确定根尖分生细胞区的重要标志；染色体制片时，比较重视能见根冠的根尖材料作为实验材料比较适宜。

根尖分生细胞区多为等直径的分裂细胞，其细胞质浓，细胞核大、细胞核体积约占整个细胞体积的3/4，是染色体制片的好材料；染色体制片取材如果不是在根尖分生细胞区取材，即使制片全过程每一环节都作得很好，也是徒劳的。

根尖分生区上端是伸长区，该区的细胞主要是细胞体积增加，基本上已停止分裂。

所以，根尖染色体制片的取材部位是根冠末端1-2mm的根段为宜。

以洋葱为例，根冠区约0.5mm，分生区1－2mm，3mm之后为伸长区（图9-1）。

物种不同根冠及分生区的长度也不同，一般而言，用于染色体制片的根尖长度，以根冠末端1-2mm为宜。

图9-1洋葱跟尖纵切面，各部分细胞分裂的频率差异

植物体细胞染色体的研究中，根尖分生组织是主要的染色体制片材料；因为它取材方便，分生区易于区别，如果用种子发芽取根，还不受季节的影响，这是其他材料所不及的。

根尖材料获得的方法很多，常有种子发芽、鳞茎水培、扦插取根、引发气生根等。

①种子萌发取根：

生长健壮的根尖不仅细胞分裂频率较高，而且染色体形态也比较平直，也就是所谓的“硬染色体”；而根尖生长势差的材料，不仅细胞分裂频率低，而且染色体形态也多是扭曲的，也就是所谓的“软染色体”。

所以，种子萌发取根，不仅要求种子的饱满度、生活力等品质性状好之外，还要求种子萌发条件最佳，获得最佳的“硬染色体”。

②鳞茎水培：

洋葱、水仙、蒜、风信子等材料多用此方法；在水培过程中，注意经常更换新鲜的同温水，是获得良好材料的关键。

③扦插取根：

扬、柳、桑、葡萄、菊花等扦插繁殖植物多用此方法；在扦插繁殖过程中，注意保湿通气，可以获得良好的根尖材料。

⑵茎尖

用能见生长锥的茎尖材料作为实验材料比较适宜；茎尖一般包括有生长锥和叶原基两部分，广义上讲的芽，还包括有幼叶和腋芽原基。

生长锥是茎的顶端分生细胞组织区，不同植物或同一植物的不同发育阶段，其生长锥的大小和形状都有较大的变化，他们可以是下凹、园丘、园锥或极端伸长（如禾本科）等多种不同的形状；生长锥的宽度，因物种不同也不同；丁香生长锥宽度<40μm，苏铁生长锥宽度达300μm。

生长锥不同部位的细胞，其细胞分裂的频率及细胞周期长短有明显的差异。

一般来讲，生长锥则面的叶原基细胞比生长锥中心区细胞的分裂周期短一倍左右；如曼佗罗生长锥中心区及叶原基区细胞分裂周期分别为76、36h，菊花生长锥中心区及叶原基区细胞分裂周期分别为140、70h。

也就是说，生长锥则面的叶原基细胞也是染色体制片取材的好材料。

茎尖取材以生长锥顶开始1.0-1.5mm为宜，休眠芽不宜用作染色体制片的材料。

茎尖取材工作是比较繁复的，需要细心地剥掉全部幼叶，用扩大镜观察，能见生长锥时方可（图9-2）。

9-2茶叶叶芽纵切面图

物种不同，生长锥的形状及宽度，因物种不同也不相同，且易受季节影响；所以，茎尖取材技术难度比根尖取材技术要高。

茎尖的正确取材，更需要强调取材部位一定要准确，取材数量一定要少而精、切忌多而杂，应在扩大镜下，尽可能地剥除幼叶、尽可能地减少木质分子结晶的干扰。

⑶幼叶

幼叶是叶原基顶端分生细胞继续分裂发育形成的小叶，其发育早期主要是细胞分裂使叶原基伸长、增加体积、形成叶轴，所以幼叶可以作为染色体制片的材料。

幼叶的分生组织，按其分布位置可以分为顶端分生组织、近轴分生组织、边缘分生组织、居间分生组织及板状分生组织等。

一般来讲，顶端分生组织的细胞分裂使整个叶原基伸长、形成锥形的叶轴（图9-3），是没有分化的细胞，但其分裂活动停止较早；居间分生组织的细胞分裂活动停止较晚，是染色体制片取材的好材料；边缘分生组织的细胞分裂形成扁平的叶片，其分裂活动依物种叶片厚度不同而不同。

幼叶的取材大小，依物种而异，但总原则是幼叶越小越好，一般以含有叶轴的幼叶5－10mm长为宜，子叶则以1.5－3mm为宜。

图9-3烟草幼叶顺序图解

⑷花蕾

花蕾是指花芽分化始期至减数分裂之前的幼蕾，包括花辨原基、雌蕊原基及雄蕊原基正在细胞分裂的花芽（图9-4）。

图9-4桃的花芽分化

花蕾是仅次于根尖染色体制片的理想材料，它的最大优点是在植物孕蕾阶段，可以直接从植株上取得大量的制片材料，幼小的花药和子房，往往比根尖更便于制片操作，且细胞分裂指数比根尖材料高；花蕾的取材时间，通常需要定期镜检作出选择，其方法是取幼小花药或子房在植物孕蕾期，多数植物在开花前10d以上；其方法是取含有幼小花药和子房的小花3－5mm左右方可。

⑸花粉

是指花粉母细胞减数分裂后，所形成的小孢子至发育成为雄配子体过程中的花粉粒，植物小孢子形成后，要经过1-2次有丝分裂，形成具有两核或三核细胞花粉。

如百合科、石蒜科、鸭跖科、茄科等植物为两核细胞花粉，禾本科、菊科等植物为三核细胞花粉，极少数植物是两核和三核细胞兼有，如堇菜属植物。

利用小孢子有丝分裂过程来观察染色体，有独特的优点：

其一、是染色体数目减半后的细胞，染色体数目是单倍数，为染色体记数或核型分析提供了极大的方便；其二、花粉分裂细胞数目多，可以同时获得大量的实验材料；其三、一般都不需要进行预处理和细胞解离，操作简便。

因此，对难以获得种子或种子发芽困难的植物来说，是比较理想的材料来源。

取样时间，与减数分裂取材时间相当，多数植物在开花前3－12d，主要以植物的某些形态特征为参考依据。

如小麦在麦穗伸出旗叶1-4cm,玉米雄花序抽出3cm左右，棉花花蕾10-13mm,芍药花蕾直径1.5-2cm,银杏花药呈黄绿色时等形态特征，都是处于减数分裂后第一、二次有丝分裂时期，是染色体制片最佳取样时期。

⑹愈伤组织

是指人工培养条件下产生的愈伤组织。

在一块愈伤组织中，细胞分裂比较集中的部位，通常难以确定，受培养条件的影响较大，因此，准确取材比较困难。

一般来讲，以转移到新鲜培养基上，经3-7天培养后的材料比较适宜；在解剖镜下观察，细胞个体小，细胞核大，细胞质浓的愈伤组织分生细胞是染色体制片最佳取样材料，而细胞体积较大、比较疏松透明的细胞群，因细胞老化，而难以获得理想的染色体。

2、预处理

⑴目的及作用：

植物有丝分裂中期染色体高度浓缩，形态和结构都比较清楚，但因纺垂体的作用，染色体紧密地排列在赤道板上，很难将其分开,尤其是染色体数目较多的植物材料，很容易产生染色体严重重叠；而且因细胞分裂中期维持的时间短，一般仅10-30min，使中期染色体细胞出现频率不高。

为了克服上述矛盾，常用化学或物理方法对材料进行预处理。

这些方法的作用机理及其作用是：

①阻止或破坏纺垂体微管的形成，由于没有纺垂体的作用，细胞有丝分裂过程，被阻抑在细胞分裂中期阶段，从而累计比较多的处于细胞分裂中期的染色体图象。

②促进染色体浓缩变短，减少染色体之间相互缠绕重叠，有利染色体的高度分散。

③改变胞质粘度，促进染色体清晰，促进细胞质清洁。

所以预处理是否适宜，是染色体制片技术中最关键的操作步骤；如果预处理的效果良好，即使是初学者也不难制作出优良的染色体标本，反之，如果预处理失败，即使是很有经验的人也难以制作出好的制片。

⑵处理药剂

可以用作染色体预处理的化学药品，主要有生物碱、甙类、酸类及其他物质；最常用的化学药品有秋水仙素、8－羟基喹啉及对二氯苯。

①秋水仙素（Colchicine）：

是从石蒜科秋水仙素属秋水仙（Colchicumautumnale）种子或鳞茎中提取的一种生物碱，其分子式为C22H25NO6+1.5H2O，分子量为399.45。

纯秋水仙素为针状结晶，商品多为白色或淡黄色粉末,融点155℃，易溶于水、酒精、氯仿及甲醛中,但在热水中的溶解度差，不溶于苯。

剧毒,易引起眼睛失明或中枢神径麻醉，使用时一定要要注意安全。

秋水仙素预处理的有效浓度为0.001-1%，常用浓度为0.05-0.2%。

②8－羟基喹啉（8-hydroxyquinoline）：

白色结晶或粉末,其分子式为HO8H3N：

CHCH：

CH，分子量145.17。

溶于酒精，难溶于水,需60℃、2－3h才完全溶解。

8－羟基喹啉不仅具有秋水仙素的预处理的效果，而且所显示的染色体缢痕及随体的结构，往往比秋水仙素更为清晰，尤其在处理中、小型染色体比秋水仙素好，能使染色体、缢痕及随体的图象更清晰。

常用浓度为0.002mol/L，少数学者使用0.004mol/L浓度，但使用者不多。

③对二氯苯（p-dichlorobenzene）:

为一种苯的衍生物，其分子式为C6H2CI2，分子量为147.00。

商品对二氯苯为无色结晶，大块时呈白色，具有特殊臭味，常温下可以升华挥发；易溶于乙醇、乙醚、苯等有机溶剂，难溶于水；易燃、有毒，通常用作防腐剂。

对二氯苯比秋水仙素远为价廉而易得，药剂配制及使用方便，易于广泛使用。

对二氯苯在水中的溶解度很低，多用饱和水溶液进行预处理；所以，对不同植物预处理时仅需要考愈处理的时间长短，不需要考愈浓度。

对二氯苯应用范围广泛，对大染色体、小染色体植物预处理都有效。

对二氯苯不仅对纺锤体微管的组装有较强的阻抑作用，还可能对其他微管蛋白或某些细胞器有分解作用，能很大程度上改变细胞质粘度，称之为细胞质清除作用。

因此，使染色体易于分散，尤其是对染色体数目多的细胞，染色体分散效果好。

但对二氯苯对细胞代谢活动有较大的毒害作用，预处理温度太高或时间太长，都容易导致染色体断裂、粘连等类似于辐射畸变的效果，曾被用作植物的化学诱变剂。

因此，严格控制预处理时间、温度条件是非常重要的。

一般采用鲜配鲜用的方法，即称取5g对二氯苯结晶，用40-45℃蒸馏水100mL溶解，振摇5min，静置1h，取上清液，10-20℃下预处理。

⑶处理方法

预处理的方法往往容易被忽视，但预处理失败的实验多是预处理的方法使用不当而致。

就材料本身而言，预处理的方法有离体处理、非离体处理和低温三种。

①离体处理：

即将处理器官或组织从母体上切除下来，浸没在预处理液中。

该处理方法的主要特点是药物作用迅速，短时简便，良好的预处理效果是在细胞的某些合成作用受到抑制，而前期分裂过程又能正常进行的条件下获得的。

由于被处理的材料小，离开了母体，细胞代谢的能源被中断，加上处于严重缺氧和有毒的恶劣环境中，一旦处理时间太长或毒害太大，细胞将会因缺氧中毒、死亡。

所以，预处理的技术性强，操作要求高。

多用培养皿铺2层滤纸，加一浅层预处理液，均匀摆齐，让少部分材料能露出预处理液的液面，也可以用指形管沉没材料的方法进行处理。

一般来讲，提高预处理效果，应该做到：

被处理的材料忌多，根尖或茎尖每管不超过15个，每皿不超过30个；切取的材料忌大，根尖或茎尖长2－3mm；注意避光通氧，采用经常更换预处理液或振摇的方法完成预处理过程；预处理温度不宜太高，2