表达谱基因芯片样品制备指南Word文档下载推荐.docx
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冷冻或新鲜组织、培养或分离的细胞以及RNA样品。
同时本公司还可以根据客户的要求在公司内部实验室进行包括细胞培养，不同条件的处理以及样品的收集工作。
客户如果提供除此以外其它特殊类型的样品请咨询本公司商务中心。
对于样品量的要求必须根据客户提供样品的取材难易以及客户要求提供的芯片服务类型而异。
包括：
对于取材量不受限制和不要求进行扩增的样品，客户需按每张芯片提供至少60μg总RNA或总RNA可提取量相当的其他类型样品；
对于取材相对较难或根据客户实验的要求必须进行扩增处理的样品，客户需按每张芯片提供至少5μg的总RNA或总RNA可提取量相当的其他类型样品；
对于其他特殊情形或客户有任何疑问请咨询本公司商务中心了解详细情况。
由于样品类型直接影响到其中的总RNA产量，对于不同的样品所需要的原始样品量也有差异，需要客户自己掌握或咨询本公司商务中心。
四、本公司的样品接收程序以及质检标准
样品采集、包装、运输过程中的注意事项：
1.在包裹样品的铝箔或冷冻保存管表面，用油性记号笔标明样品编号及样品类型。
并且不要与乙醇等有机溶剂接触。
2.不要用纱布、纸张直接包裹样品，而是用铝箔或冷冻保存管包裹后再装入样品袋中。
3.不要把标签纸或其他纸制的说明性文件放入样品袋内，因为纸张在液氮中是易碎的。
4.不要用玻璃容器在液氮中保存样品；
样品包装中不要使用透明胶带；
5.标签纸应该贴于样品袋绳上，不要贴于容器表面以免脱落造成样品混乱。
6.不要在一只样品袋中放过多的样品，以防无法放入液氮罐或无法从液氮罐中取出。
样品袋在使用前先在液氮中预冷。
7.客户在填写《样品登记单》时，应当详细描述样品的类型、处理方法、储存条件以及储存时间等相关细节，同时需要客户自己或由客户授权本公司协助填写详细的实验设计（包括实验组与对照组的分组方式，样品是否需要扩增，使用的芯片类型），以便技术人员确定合理的处理方案。
样品接收程序：
1.客户与公司签订委托服务合同并付预付款后，将符合要求的样品（附样品登记单）直接或委托客户工程师送至本公司商务中心。
2.商务中心收到样品后，立即登记并送技术服务平台。
3.技术服务平台在接收样品时，将检查运输包装中液氮、干冰等量是否足以保持样品稳定以及实际样品数目与样品登记单中的记录样品数目是否相符，样品登记单填写是否完整，实验设计说明是否明确。
4.技术服务平台接收样品后，将在规定的工作日内完成总RNA提取而后送质量部质检。
质量部质检后，将向商务中心出具质检报告。
商务中心在规定的工作日内向客户提供质检报告。
5.质检合格的样品，技术服务平台在规定的工作日内完成实验。
样品的质检标准及各种样品的主要不合格原因：
本公司在收到客户样品后首先需要进行质检，本公司的质检标准包括对总RNA进行定量（A260/A280比值在2左右），总RNA电泳检查（需要有清晰的18s和28srRNA条带，同时28s/18s的比例应在2：
1以上）。
客户样品未达到质检标准通常包括以下情形：
冷冻组织样品的RNA降解；
细胞样品的总RNA量不足或降解；
客户提供的RNA样品降解。
五、组织样品采集操作流程
1.首先准备好用于包装样品的铝箔或冷冻保存管，并且用油性记号笔在铝箔或冻存管外表多处写明样品编号。
2.准确切除所需组织。
3.离体新鲜组织，立即剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织类型。
4.在RNase-free的0.9％生理盐水中漂洗样品，以去除血渍和污物。
5.用准备好的铝箔或冷冻保存管装载包裹组织，迅速投入液氮冷却。
6.把样品袋（纱布袋等）放入液氮中冷冻一下，而后将液氮冷却的组织放入样品袋（每个样品袋只保存同样的组织，样品较多时应分装至多个小袋，不要在一只样品袋中放过多的样品以防无法放入液氮罐或无法从液氮罐中取出），袋口留一根编号绳，绳上粘2张标签纸（标签上注明：
客户名、样品名称、编号、日期，粘2张标签纸是为了防止标签脱落造成样品混乱），迅速转入液氮罐。
7.填写样品登记单，写明样品名称、组织类型、编号、取样日期、样品处理过程等情况。
注意事项
1.对肿瘤组织的取材，应尽可能准确地判定肿瘤组织和正常组织，如果有可能请根据冰冻切片报告的结果来判定要进行研究的取材部位。
2.不要用Eppendorf管保存组织样品，因为Eppendorf管从液氮中取出时极易发生爆裂而造成样品损失。
3.步骤2～5应在冰上尽可能快速进行，时间过长会导致样品RNA降解。
4.在临床手术过程中采集的病理或正常样品，如果没有条件立即从手术室中取出进行后续处理，请在切除后立即转移到液氮中保存。
六、细胞及血液样品采集操作建议流程.
贴壁细胞
1.贴壁细胞培养或处理结束后，去除培养液；
2.按每10cm2培养面积加1mLTRIzol试剂的比例加入TRIzol试剂；
3.用1mL枪头反复吹打,使TRIzol接触所有长有细胞的培养瓶表面进行充分消化；
4.转移到RNase-free的试管中用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液应该为清亮而且不粘稠的状态；
5.放入干冰或-80℃冰箱中保存。
悬浮细胞
6.悬浮细胞培养或处理结束后，去除培养液；
7.保留的细胞用PBS缓冲液快速洗一次，离心除去PBS缓冲液；
8.按照每5×
106个细胞加1mLTRIzol的比例加入TRIzol试剂，用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮而不粘稠的状态；
9.放入干冰或-80℃冰箱中保存。
血液
1.在已加入抗凝剂的新鲜全血中加入等体积PBS（1×
），充分混匀；
2.缓慢转入另一已加入淋巴细胞分离液的离心管中，并使上述混合液处于淋巴细胞分离液液面之上（即两种液体不要混合，保留清晰的界面），3000g离心30min；
3.用移液枪小心分离出白细胞层；
用PBS（1×
）清洗白细胞，离心回收白细胞，弃去上清；
4.加入白细胞20倍体积的TRIzol试剂，用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮而不粘稠的状态；
1.我们不接收未经TRIzol试剂处理的细胞样品以及未经分离白细胞的全血样品。
2.客户如果提供冻存可复苏的细胞株，应首先验证所用冻存方法用于RNA提取的可靠性，并且在送样时提供详尽的复苏方法，以便确保实验成功。
3.所有样品均应标明准确的样品编号，同时配有一张样品登记表，写明样品名称、种类、编号、取样日期、样品处理情况等。
七、总RNA样品制备操作流程
1.用于RNA提取的试剂及其他物品必须为RNase-free的，并且尽量在洁净、不通风的环境中进行实验。
2.客户应当选用自己熟悉的或公认可以得到良好实验结果的提取方法（如使用EasyExtract、TRIzol或RNeasy）进行RNA的提取。
3.可以根据实际需要选择RNA的保存方法：
需要长期保存的RNA样品保存于75％乙醇中；
无需长期保存的RNA样品保存于RNase-free的双蒸水或Elutionbuffer中。
4.建议客户送样时提供保存于RNase-free的双蒸水或Elutionbuffer中的RNA样品。
样品浓度不应低于3μg/μl（需要扩增的样品浓度不应低于0.2μg/μl）。
5.建议客户送样时提供RNA样品的电泳图谱以及相关的OD值等实验数据。
6.RNA样品的保存介质请务必在样品登记单上加以说明。
7.RNA样品完全干燥后很难溶于水，因此不要提供干燥状态的RNA样品。
8.样品到达公司后，技术服务平台将在规定的工作日内进行质检。
9.按RNA质量按我公司的质检标准判定，即A260/A280比值应在2左右，总RNA电泳检查需要有清晰的18s和28srRNA条带，同时28s/18s的比例应在2：
1以上，70°
C水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。
如果经质检证明RNA样品未达到我公司质检标准时，商务中心将及时与客户联系，协商进一步处理事宜。
八、其他的样品处理方法
RNAlater（以下内容源于Qiagen公司的产品说明书，仅供参考）
1．简介
RNAlater是一种液态的，无毒的组织保存试剂。
它能迅速稳定组织，保护非冷冻细胞RNA于原位。
获得组织块后，迅速浸泡在RNAlater中保存，而不会引起RNA的降解，这样可以不必马上处理样品或将样品冷冻在液氮之中以备以后处理。
RNAlater应保存在室温下，保质期6个月。
如放置在4℃条件下则会引起沉淀，此时需加热到37℃才可澄清。
RNAlater可广泛应用于多种脊椎动物样品。
包括脑、心、肾、脾、肝、睾丸、骨骼肌、脂肪、肺和胸腺。
RNAlater对大肠杆菌、果蝇、组织培养细胞、全血细胞和一些植物也有效。
RNAlater能否与RNA提取试剂盒兼容？
RNAlater可与大多数RNA提取方法相协调。
特别是TRIReagent.,RNAwiz,TōTALLYRNA,RNAqueous,andPoly（A）Pure。
2.如何使用RNAlater
RNAlater只能用于新鲜组织，在浸入RNAlater之前不能冷冻组织。
简单切碎组织样品，任何一边的最大厚度不能大于0.5cm,然后将组织碎块放入到5倍体积的RNAlater中保存。
动物组织
RNAlater不会溶解或破坏组织样品的结构。
如果需要的话，仍可将已经平衡在RNAlater溶液中的组织取出并分割成更小的块再重新放入到RNAlater中。
小器官如鼠肝、肾和脾可以完整地保存在RNAlater中。
植物组织
许多植物组织可以简单浸泡在5倍体积的RNAlater中保存。
具有自然屏障防止扩散的植物如蜡表皮的叶组织可能需要先破坏其屏障，以允许RNAlater进入组织。
组织培养细胞
沉淀细胞，用PBS洗一次，再用少量的PBS悬浮细胞，然后加5~10倍体积的RNAlater保存。
白细胞
如果将白细胞从红细胞和血清中分离出来，并按组织培养细胞一样处理后，白细胞便能有效地保存在RNAlater中。
不要将全血、血浆或血清中的RNA保存在RNAlater中，因为它们蛋白含量过高，与RNAlater混合后易形成不溶的沉淀。
细菌
RNAlater是抑菌的，虽然细菌在RNAlater中不能生长，但细胞仍保持其完整性。
大肠杆菌保存在RNAlater中4℃条件下1个月仍很完整，产生不降解的RNA。
3.RNAlater中样品的保存
保存于-80℃
建议用于批量保存。
将样品在4℃条件下孵育过夜，然后从RNAlater溶液中取出样品保存于-80℃。
对于组织培养细胞，不必移去RNAlater，只需简单冻存整个溶液。
实验证明，细胞在-80℃条件下冻存于RNAlater溶液中并未出现溶解。
样品可随后在室温下解冻及再冻存，其RNA的质和量都不会受到影响。
保存于-20℃
将样品在4℃条件下孵育过夜，然后转移到-20℃。
样品在-20℃条件下不会冻结，但在存贮缓冲液中会有结晶形成，这并不影响随后的RNA提取。
样品可随后在室温下解冻及再冻存，其RNA的质和量都不会受到影响。
保存于4℃
厂家认为，目前尚无证据证明样品存于4℃1个月内会出现RNA降解。
如果没有冰箱：
将样品放在尽可能冷的环境中。
如果周围温度超过25℃，应尽可能使RNAlater中的样品冰浴数小时。
4.RNAlater中样品的RNA提取
组织
用消毒镊子将组织从存贮溶液RNAlater中取出，浸泡在RNA提取溶液中。
一旦将组织放入RNA提取溶液中，匀浆一定要迅速进行。
细胞
从存贮在RNAlater中的细胞中提取RNA有两种操作方法可供选择：
去除RNAlater或者从细胞与RNAlater的混合物中直接提取RNA。
5.从RNAlater中取出样品
去除RNAlater
因为RNAlater的浓度比典型的细胞培养介质的浓度高，因此用通常沉淀活细胞的离心力无法沉淀RNAlater中的细胞。
离心沉淀细胞，去除RNAlater。
（HeLa细胞大约需要3000×
g，但其他细胞可能不能容忍这个速度，或者他们需要更大的离心力。
）
从RNAlater中的细胞直接提取RNA
作为选择，我们可以用一步法破碎/提取溶液（如TRIReagent和RNAwiz ）从没有去除
RNAlater的细胞中纯化RNA。
这可通过向细胞混合物中加入10倍体积的一步提取溶液完成，
其他照常。
RNAsecure：
（以下内容源于Ambion公司的产品说明书，仅供参考）
1.简介
在分子生物学试剂中用的RNAsecure代替DEPC，有很多优点：
1）可以加入到不能用DEPC处理的溶液中（如：
Tris或MOPS缓冲液）；
2）可以加入到不能被高压灭菌的溶液中；
3）可以加入到加酶之前的酶促反应中。
Ambion已经测试了有RNAsecure试剂存在的如下酶促反应（先于酶加入）：
RNA多聚酶T7，T3和SP6的体外转录（37℃），MMLV和AMV逆转录（42℃），以及SuperTaqPCR（94℃），均没有出现酶抑制现象。
2.使用方法
1）用缓冲液或经过处理的溶液稀释RNAsecure试剂到1×
，充分混匀。
2）将混合物在60℃水浴温浴20min，冷却至室温。
这样的溶液可备用于接下来的RNA提取和分析，或者保存于室温、4℃或-20℃以备将来使用。
3）为了消除任何可能发生在经过初处理之后的RNA酶的污染，在使用前可以将RNAsecure溶液在60℃水浴中重新温浴10~20分钟。
3.注意事项
RNAsecure试剂只在高于45℃的条件下才有活性，但当反应体系孵育温度超过该温度时可能会使一些酶失活。
因此，用RNAsecure处理反应缓冲液时要以加入酶之前做为临界点，然后进行酶促反应时孵育温度低于45℃。
注意：
这不适用于Taq多聚酶。
九、样品制备常用仪器和试剂及耗材
1.常用试剂及耗材
DEPC
TRIzolReagent
氯仿：
异戊醇
一次性注射器及针头
QiagenRNeasyMinikit
QiagenRNAlater
AmbionRNAsecureReagent
Tip（RNase-free）
微量离心管（RNase-free）
2.样品制备过程中使用物品的RNase-free处理
RNase-free水：
0.1%DEPC处理（用磁力搅拌器搅拌过夜），高压灭菌。
氯仿
无水乙醇（新包装开封后注明RNA专用）
75%乙醇：
用RNase-free的水配制。
离心管和冷冻保存管以及Tip头浸泡在0.1%DEPC水中过夜，干燥后高压灭菌。
其他玻璃或金属器具用铝箔纸包裹后180℃干烤过夜。
任何接触样品的操作需佩戴一次性手套,避免直接接触样品。
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