溶菌酶的提取分离和纯化实验报告doc.docx

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溶菌酶的提取分离和纯化实验报告doc

生物工程综合实验

溶菌酶的提取、别离纯化及其活性测定

实验报告集

班级生工1411

学号—

组别_7

姓名—

实验室学生守那么

一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员的指导。

二、严格按照实验要求，做好实验预习，实验之前5分钟进入实验室，及时、

准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。

三、严格执行操作规定，保护仪器设备及工具。

凡不按教师的指导擅自操作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。

四、保护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。

未经允许不得随便挪动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室外。

五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和吃东西。

六、严防事故，确保实验室平安，发现异常情况，应及时向有关教师和管理人员报告。

七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作,经指导老师许可后，方可离开。

预习报告〔手写，可自行续页〕

名称溶菌酶的提取、别离纯化及其活性测定

实验目的和要求:

实验材料:

主要仪器:

主要步骤:

教师签名：

时间：

实验报告

溶菌酶的提取、别离纯化及其活性测定

一、目的

对从鸡蛋清中提取并别离纯化出洛菌酶进行活性测定

二、原理

鸡蛋是溶菌酶的主要来源，等电点约为10.5-11,最适温度50°C,最适pH为6~7左右。

1、溶菌酶别离纯化原理：

〔1〕等电点法利用溶菌酶等电点较高，在酸性条件下除去一些杂蛋口

〔2〕阳离子树脂柱层析法进一步除去杂蛋白

2、溶菌酶鉴定分析

〔1〕考马斯亮蓝法测蛋口含量

〔2〕分光光度法测定酶活性

〔3〕使用SDS-PAGE鉴定溶菌酶纯度

三、实验材料与方法

1、实验材料与试剂

鸡蛋清，PBS缓冲液，40%甘油、冰醋酸、氢氧化钠，D152大孔弱酸性阳离子交换树脂、透析袋，考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、乙醇、磷酸，溶菌酶标准品、底物微球菌粉，蛋口质分子量Marker、SDS、聚乙二醇-20000等

2、实验仪器

低速离心机、高速冷冻离心机、离心管、分光光度计，玻璃层析柱，Bio-Rad垂直电泳系统，移液枪、移液管，培养皿、玻璃棒、普通漏斗、滤纸、量筒、刻度试管及试管架、冰箱、摇床、烧杯、止水夹等。

3、实验方法

1.新鲜鸡蛋清的制备与粗别离

2.树脂柱层析别离纯化

〔1〕D152树脂处理〔2〕湿装法装柱〔3〕上柱离子交换吸附〔4〕冲平〔5〕洗脱

3.透析与浓缩

〔1〕透析除盐〔2〕聚乙二醇浓缩

4.蛋白质含量的测定

5.溶菌酶纯度的测定〔SDS凝胶电泳〕

四、实验结果与分析：

1•蛋白浓度实验结果

〔1〕蛋口质标准曲线的绘制

管号

1

2

3

4

5

6

O.lmg/mL标准蛋白液〔inL〕

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

蒸憾水〔mL〕

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0

考马斯亮蓝〔mL〕

4

4

4

4

4

4

蛋白质含量〔pg/mL〕

0

20

40

60

80

100

OD595

0

0.222

0.434

0.648

0.802

0.948

〔2〕待测样品蛋口浓度测定

管号

El

E2

E3

E4

蛋白质待测样品提取液〔mL〕

0.1

0.1

0.1

0.1

蒸懈水〔mL〕

0.9

0.9

0.9

0.9

考马斯亮蓝〔mL〕

4

4

4

4

OD595

2.374

1.009

0.038

0.972

蛋白质含量〔ug/mL〕

244.07

101.88

0.74

98.03

分析：

山图中数据与制作的蛋白质标准曲线的样品比拟可知，经过处理后，El,E2的蛋口质的含量的数值急剧下降，到E3已经儿乎趋于0,可说明溶菌酶粗提取的过程中已经除去了大量的杂蛋白，得到了进一步别离纯化后的蛋白质。

2、酶活力实验结果

酶活力测定结果

时间

AOs

AlSOs

酶的活力单位数

E1

0.682

0.625

19

E2

0.625

0.585

13.3

E3

0.685

0.661

8

E1

0.822

0.537

95

根据实验所得的E1〜E4各样品，汇总结果如下表所示

样品

体积ml

蛋白浓度mg/ml

总蛋白

mg

酶活力

u/ml

比活力u/mg

总活力U

回收率%

提纯倍数

E1

Vl=57.5

0.244

14.03

31

127.0

1782.5

100%

1

E2

V2=134.8

0.102

13.75

13.3

130.4

1792.8

100.5%

1.03

E3

—

0.00074

-

8

—

—

-・・・

-・・・

E4

V4=4.2

0.098

0.41

95

973.2

399

22.4%

7.66

分析：

山上述数据可知，吸光度值总体呈下降趋势，且随着时间的推移，在朵蛋口提纯后，样品E4的酶活力和比活力较先前的E1和E2有了极大的增长，说明经过提纯后，所需要的酶活性增加，但总活力下降，说明溶菌酶的纯度比拟好。

3.电泳实验结果

2）49»r•91011UrI）IIH

分析:

聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及不同迁移率将蛋白质别离成假设干条区带，如果别离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只别离出一条区带。

SDS能够和蛋口质分子结合成复合物，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异，各种蛋白质SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，只与分子量有关，这种方法常用来鉴定蛋白质别离样品的纯化程度。

根据以上原理和上述图片，可观察到，本组所在的11-15泳道，11泳道为标准品,15泳道为样品E1,12到14泳道依次为样品E3,E3,E4,由于人为操作问题导致12-15泳道的结果不是特别清晰，但是仍然能比拟蛋白质分子量的大小。

4、回收率与提纯倍数实验结果

样品

体积ml

蛋白浓度mg/ml

惡蛋白

mg

酶活力

u/ml

比活力u/mg

总活力U

回收率%

提纯倍数

E1

Vl=57.5

0.244

14.03

31

127.0

1782.5

100%

1

E2

V2=134.8

0.102

13.75

13.3

130.4

1792.8

100.5%

1.03

E3

―

0.00074

—

8

—

—

—

-

E4

V4=4.2

0.098

0.41

95

973.2

399

22.4%

7.66

分析：

从E1到E4阶段，回收率下降，提纯倍数升高，说明在提纯过程中由于人为操作问题，离子交换层析柱底部损坏，导致蛋白质大量流失，所以回收率较低，但是提取的纯度比拟高。

五、结论与讨论

山于溶菌酶比拟稳定，分子量、等电点等与蛋清中其他蛋白质有较大差异。

因此可以利用常规方法的科学组合别离得到纯度较高、活性较强的溶菌酶。

本实验所采用的从鸡蛋中提取溶菌酶的方法，简单易行,本钱低廉、别离周期短、洛菌酶纯度高。

但山于各个实验的要求比拟严格，所制得的洛菌酶过程中易因为各种原因而受到损失，实验误差比拟大，因此还需要继续研究更为适合规模化生产，提取纯度更高的方法。

参考文献

[1]陈钧辉主编?

生物化学实验?

第四版

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10-14.D01:

10.3969/j.issn.1009-7848.2003.zl.003.

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发,2021,29

（1）:

182-185.D01:

10.3969/j.issn.1005-6521.2021.01.057.

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河南大学出版社

[5]陈慧英，吴晓英，林影等.溶菌酶别离纯化方法的研究新进展[J].广东药学院学报，2003,19（4）:

356-358.D01:

10.3969/j.issn.1006-8783.2003.04.025.

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