胶原蛋白的提取.docx

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胶原蛋白的提取

目录

英文缩写对照表………………………………………………………………………1

中文摘要………………………………………………………………………………2

英文摘要………………………………………………………………………………4

1前言…………………………………………………………………………………6

2材料…………………………………………………………………………………6

2.1主要仪器设备……………………………………………………………………6

2.2实验动物…………………………………………………………………………7

2.3样品与试剂………………………………………………………………………8

2.4常用工作液………………………………………………………………………8

3方法…………………………………………………………………………………9

3.1CPⅠ的制备………………………………………………………………………9

3.1.1粗提法…………………………………………………………………………9

3.1.2高效液相色谱分离纯化……………………………………………………10

3.2CPⅠ的理化性质鉴定…………………………………………………………10

3.2.137OC凝结试验………………………………………………………………11

3.2.2紫外吸收值测定……………………………………………………………11

3.2.3氨基酸组成和含量分析……………………………………………………11

3.2.4蛋白质浓度测定……………………………………………………………11

3.2.5SDS-PAGE凝胶电泳…………………………………………………………12

3.2.6RP-HPLC分析CPⅠ…………………………………………………………12

3.2.7生物安全性实验……………………………………………………………13

3.3CPⅠ防止UVA氧化损伤实验…………………………………………………14

3.3.1L929细胞的培养、冻存与复苏………………………………………………14

3.3.2UVA对L929细胞活性的影响………………………………………………14

3.3.3CPⅠ对细胞UVA氧化损伤的保护作用……………………………………14

4结果………………………………………………………………………………16

4.1CPⅠ的制备……………………………………………………………………16

4.2CPⅠ的理化性质鉴定…………………………………………………………16

4.2.137OC凝结试验………………………………………………………………16

4.2.2紫外吸收值测定……………………………………………………………16

4.2.3CPⅠ氨基酸组成和含量分析………………………………………………17

4.2.4蛋白质浓度测定……………………………………………………………18

4.2.5SDS-PAGE凝胶电泳…………………………………………………………19

4.2.6RP-HPLC分析CPⅠ…………………………………………………………19

4.2.7生物安全性试验……………………………………………………………20

4.3CPⅠ防止UVA氧化损伤实验…………………………………………………22

4.3.1UVA对L929细胞活性的影响………………………………………………22

4.3.2CPⅠ对细胞UVA氧化损伤的保护作用……………………………………22

5、讨论………………………………………………………………………………25

5.1CPⅠ的制备……………………………………………………………………25

5.1.1提高CPⅠ得率的因素………………………………………………………25

5.1.2提高CPⅠ纯度的因素………………………………………………………26

5.1.3高效液相色谱是分离纯化CPⅠ的有效途径………………………………27

5.2CPⅠ的理化性质鉴定…………………………………………………………27

5.2.1CPⅠ在223nm处有紫外最大吸收值………………………………………27

5.2.2CPⅠ氨基酸组成及含量分析………………………………………………27

5.2.3SDS-PAGE鉴定………………………………………………………………28

5.2.4RP-HPLC分析CPⅠ…………………………………………………………28

5.2.5CPⅠ具有生物安全性………………………………………………………28

5.3CPⅠ防止UVA氧化损伤研究…………………………………………………29

5.3.1UVA对成纤维细胞有活性有抑制作用……………………………………29

5.3.2CPⅠ能够降低UVA氧化损伤的细胞MDA活性…………………………30

5.3.3CPⅠ能够提高UVA氧化损伤细胞的GSH-px活性………………………30

小结…………………………………………………………………………………31

参考文献……………………………………………………………………………32

文献综述胶原蛋白的研究进展…………………………………………………37

致谢…………………………………………………………………………………46

英文缩写对照表

英文缩写

英文名称

中文名称

CPⅠ

CollagenproteinⅠ

Ⅰ型胶原蛋白

A

Absorbance

吸光值

BPB

Bromophenolblue

溴酚蓝

ddH2O

Doubledistilledwater

双蒸水

PBS

Phosphatebufferedsaline

磷酸盐缓冲液

SDS-PAGE

SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis

聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS

Sodiumdodecylsulfate

十二烷基磺酸钠

Tris

Tris（hydroxymethyl）aminomethane

三（羟甲基）氨基甲烷

TEMED

N,N,N’N’-tetramethylethylenediamine

N,N,N’N’-四甲基乙二胺

DMSO

Dimethylsulphoxide

二甲基亚砜

CBB

CoomassieBrillantBlue

考马斯亮蓝

MTT

3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5

-diphenyltetrazoliumbromide

噻唑蓝

HPLC

Highperformanceliquidchromatography

高效液相色谱

UVA

UltravioletradiationA

长波紫外线

MDA

Malondialdehyde

丙二醛

GSH-px

Glutathioneperoxidase

谷胱甘肽过氧化物酶

Ⅰ型胶原蛋白的制备、鉴定及其

抗UVA氧化损伤作用的初步研究

学科专业：

动物学研究方向：

生化制药指导教师：

魏泓教授研究生：

王琳（2001345）

内容摘要

本文围绕Ⅰ型胶原蛋白（CPⅠ）的制备及其理化性质进行研究，同时在其防止长波紫外线（UVA）对细胞的氧化损伤方面进行了初步探索，为CPⅠ的进一步研发提供理论基础和科学依据。

以猪皮为材料，比较酸溶法、酶解法、中性盐溶液法三种粗提方法，选择得率和纯度都较高的酶解法为最佳粗提法，结合高效液相色谱进行CPⅠ的分离纯化。

CPⅠ理化性质鉴定结果表明：

样品在223nm处有紫外最大吸收值；含有十八种氨基酸，氨基酸总量在90%以上；样品的蛋白质浓度为1.03mg/ml；SDS-PAGE测定CPⅠ由α、β、γ三条链组成；色谱分析纯度约为100%。

通过小鼠急性毒性试验、豚鼠致敏试验、细胞毒性试验对自制CPⅠ进行整体水平和细胞水平的生物安全性评价，观察期内，小鼠未见异常毒性反应；豚鼠注射点无红斑及水肿情况；细胞毒性小于Ⅰ级，结果证明本方法制备的CPⅠ无毒副作用。

评价CPⅠ对UVA氧化损伤的L929细胞的保护作用。

结果表明：

随着UVA照射时间的延长，细胞的活性明显降低，说明UVA对细胞的氧化损伤是明显的，其中表现为MDA的含量升高、GSH-px的含量降低。

加入不同浓度的CPⅠ后照射同样的时间，MDA的含量有所下降、GSH-px的含量有所升高，其中50%CPⅠ组的效果极为显著（P﹤0.01）。

提示该物质有防止UVA氧化损伤的作用。

综上所述，利用酶解和高效液相色谱制备相结合的方法可以从猪皮中分离纯化CPⅠ，该方法具有高效性，高选择性和易放大性；理化性质鉴定及生物安全性试验表明，该物质为纯活性胶原蛋白，无毒副作用；同时对体外细胞的UVA氧化损伤具有较好的保护作用。

关键词：

Ⅰ型胶原蛋白；高效液相色谱；制备；鉴定；氧化损伤

Studiesonthepreparation，identificationofCPⅠanditsprotectiveeffectoncellsdamagedbyUVA

Major:

BiologySpeciality:

Zoology

Tutor:

Prof.WeiHongAuthor:

WangLin（2001345）

Abstract

Inthispaper,howtoprepareCPⅠandidentifyphysico-chemicalpropertyhadbeenstudied,andUVAoxidativedamageL929wasperliminarydiscussed.Thesedatasprovidedtheoreticfoundationandscientificproofforfurtherresearchanddevelopmentofthisproduct.

Pigskinwasusedasmaterial.Accordingtothecomparationamongthethreekindsofcrudeextractionmethodsincludingaciddissolve,enzymolysisandneutralsaltsolution.ThemethodofenzymolysiscombinedwithHPLCwaschosentoprepareCPⅠ.

Thephysico-chemicalpropertyofCPⅠwasidentified.Theresultsshowedthat:

CPⅠshowedcharacterabsorptionpeakat223nm;CPⅠhad18kindsofaminoacids,totalcountofaminoacidwasmorethan90%;theconcentrationofproteinwas1.03mg/ml;CPⅠwascomposedofαchain,βchainandγchainbySDS-PAGE;OnepurepeakwithHPLCwasfoundedanditspuritywas100%.ThesecurityofCPⅠaccordingtotheexperimentsofmiceaccutetoxicitywasevaluated,Guineapigsensitizationandcytotoxicityexperimentinintegerlevelandcelllevel.Itwasshowedthat:

themicehadnotoxicreaction;theGuineapig’spointsofinjectionhadnoerythemaanddropsy;thecytotoxicitywaslowerthanⅠclass.TheresultsprovedthatCPⅠhadnopoisonsideeffects.

CPⅠpreventedUVAfromoxidativedamagingL929wasstudied.Theactivityofcellsbecameweakerandweakerwithexposuretime.ItwasconspicuousthatUVAdamagedtheactivityofcells.ThecontentsofMDAupgradedandthecontentsofGSH-pxdegraded.WhenaddingdifferentconcentrationofCPⅠ,thecontentsofMDAdecreasedandthatofGSH-pxincreased.Theeffectof50%concentrationgroupwasextremelyremarkable（P<0.01）.ItshowedthatCPⅠcancounteractoxidativedamagefromUVA.

Inconclusion,themethodofenzymolysiscombinedwithHPLCtoextractCPⅠfrompigskinwasproposed.Thismethodshowedtheadventagesofhighperformance,highselectivityandeasilyamplification.Acoordingtotheexperimentsofidentifyingthephysico-chemicalpropertyandthebiosafetyofCPⅠ,itwasconcludedthatCPⅠhadhighbioactivityandnotoxicityeffect,andthatCPⅠhadtheabilitytoprotectcellsfromoxidativedamnification.

.

Keywords:

CPⅠ,highperformanceliquidchromatography,physico-chemicalproperty,identification,oxidativedamnification

1前言

Ⅰ型胶原蛋白（CollagenProteinⅠ）是一组由多种糖蛋白组成的大家族，不仅具有合成高分子不可比拟的生物相容性、生物降解性和抵抗原性[1]，而且具有一系列重要的生物学功能，如：

具有明显的提高人体免疫功能与改变心肌功能作用；保护胃粘膜以及抗溃疡作用；抗过敏作用；抑制血压上升作用；其中某些特殊氨基酸还具有防癌作用[2]。

因此Ⅰ型胶原蛋白在生物医学材料、美容保健、药物缓释等诸多领域具有良好的应用前景。

Ⅰ型胶原蛋白由于其结构复杂，生物学特性各异，因此从生物组织中纯化Ⅰ型胶原蛋白比较困难。

关于Ⅰ型胶原蛋白的分离纯化工作，国内相关报道不多，常见的提纯方式只是简单的利用一步柱层析进行[3]，此方法存在生产周期长、分离效率低、产物纯度不高等缺点。

长的分离周期和低的分离效率不仅增加了胶原蛋白的生产成本，而且使很多资源无法得到有效的利用。

本文在此基础上对制备工艺进行改进，使用酶解和高效液相色谱相结合的方法，从猪皮中分离纯化Ⅰ型胶原蛋白。

高效液相色谱具有操作条件温和，选择性高，批处理量大和操作自动化等优点[4]，是分离纯化胶原蛋白的有效方法。

本文探索了Ⅰ型胶原蛋白的提取方法，为其高效制备工艺的形成提供有力的技术依据。

近年来由于臭氧层的破坏而使长波紫外线辐射增强，长期的紫外线辐射会导致皮肤老化，黑色素瘤及多种皮肤癌等病变[5-8]。

自由基抑制剂或清除剂能防止紫外线的氧化损伤，保护皮肤，延缓皮肤衰老[9][10]。

以往的研究多是集中于天然植物提取物的抗氧化作用，而对动物活性物质抗氧化作用的研究少见报道。

本文在建立UVA氧化损伤L929细胞模型的基础上，探索Ⅰ型胶原蛋白防止UVA氧化损伤的作用和机理，为具有抗UVA氧化损伤作用的活性物质的开发开辟新的领域。

因此，本文选取Ⅰ型胶原蛋白作为研究对象，通过对Ⅰ型胶原蛋白的提取分离、理化性质及生物功能的研究，为Ⅰ型胶原蛋白产品的深入开发提供必要的技术支持。

2材料

2.1主要仪器设备

CR22G型高速冷冻离心机，日本HITACHI株式会社；

FTS系列冻干机，Dupont公司；

79型控温多用高速组织捣碎机，江苏江阴科研器械厂；

BD-462型冰柜、SC-320型冷藏箱，青岛澳柯玛股份有限公司；

LS-B501型立式圆形压力蒸汽灭菌器，上海医用核子仪器厂；

电泳仪，美国BIO-RAD公司；

QPLS-22型不锈钢绞肉机，江苏丹徒县纪庄食品机械铸件厂；

ZT-2000型圆筒式过滤器，绍兴市卫星医疗设备制造有限公司；

UV751，GD紫外/可见光分光光度计，上海分析仪器厂；

SPX250B型系列生化培养箱，上海跃进医疗器械厂；

PB310S型电子天平，北京赛乌利斯有限公司；

LAC214型电光分析天平，常熟市衡器厂；

HHS-8S电热恒温水浴锅，上海天平仪器厂；

B5060型二氧化碳培养箱，美国HERAEUS公司；

COTC型倒置显微镜，重庆光学仪器厂；

紫外线灯管（UVA），北电光源研究所；

SXK-103型超净工作台，安徽省蚌埠净化设备厂；

超声波细胞粉碎机，宁波东芝生物技术有限公司；

550型酶标仪，美国BIO-RAD公司；

HP-1100型高效液相色谱仪，Agilent公司；

ZORBAX300SB-C18半制备色谱柱（9.4mm×25cm），Agilent公司；

HypersilODSC18分析柱（4.0mm×250mm），Agilent公司；

FC203B馏分收集仪（FractionCollector），美国Gilson公司；

8453E型紫外分光光度系统，Agilent公司；

高速氨基酸自动分析仪，6300黄金系统，美国贝可曼公司；

2.2实验动物

2.2.1豚鼠

英国种封闭群，普通级，健康，雌雄均可，体重250～350g，试验前及试验后的观察期内，均应按正常饲养条件饲养，做过本试验的动物不得重复利用。

由第三军医大学实验动物中心提供。

2.2.2小鼠

昆明（KM）小鼠，普通级，健康，6～8周龄，18～22g，合格证号：

310101014，由第三军医大学实验动物中心提供。

2.3样品与试剂

市售猪皮；

NIH3T3细胞，L929细胞，由第三军医大学免疫教研室提供；

Ⅰ型胶原蛋白对照品，Sigma公司；

胃蛋白酶（1：

2500），Sigma公司；

胰蛋白酶，Sigma公司；

甲醇，Merck公司；

羟脯氨酸对照品，南京建成生物工程研究所；

DMEM培养基干粉，美国GIBCO公司；

小牛血清，兰州民海生物工程公司；

丙烯酰胺，Tianjin,H&Y.Bio,Co;Ltd；

甲叉双丙烯酰胺，Tianjin,H&Y.Bio,Co;Ltd；

TEMED，PromegaCorporation;

考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；

MTT，Sigma公司；

DMSO，上海生工有限公司；

分子量蛋白Marker，上海生物化学研究所；

MDA活性检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；

GSH活性检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；

其它试剂均为国产分析纯。

2.4常用工作液

D-Hank’s溶液：

将NaCl8.0g，KCl0.4g，KH2PO40.06g，NaHCO30.35g，Na2HPO4.7H2O0.06g，酚红0.02g，加ddH2O至1000ml溶解，0.07Mpa高压灭菌15min。

双抗储备液：

将青霉素100万单位，链霉素100万单位溶于10mlddH2O，即为每毫升含青霉素10万单位，链霉素10万单位的双抗储备液，-20OC保存。

DMEM培养液：

DMEM培养基干粉10g，双抗储备液1ml,NaHCO32.0g，用三蒸水溶解，定容至1000ml。

溶液用5.6%NaHCO3调pH至7.2左右，不锈钢滤器除菌分装，此为不完全DMEM培养液，加入20%小牛血清后为完全DMEM培养液，-20OC保存。

胰蛋白酶液：

将0.25g胰蛋白酶粉末溶于100ml的PBS中，即为0.25%胰蛋白酶液。

丙烯酰胺单体贮液：

将14.55g丙烯酰胺和0.45g甲叉双丙烯酰胺溶解于40ml的ddH2O中，搅拌直到溶液变成透明，再加ddH2O至50ml，过滤，装入棕色瓶，4OC可保存一个月。

浓缩胶缓冲液贮液（1mol/LTris-HCL，pH6.8）：

将6.06gTris溶解在40ml的ddH2O中，用4mol/LHCL调节pH至6.8，再加ddH2O至50ml，4OC保存。

分离胶缓冲液贮液（1.5mol/LTris-HCL，pH8.8）：

将9.08gTris溶解在40ml的ddH2O中，用4mol/LHCL调节pH至8.8，再加ddH2O至50ml，4OC保存。

10%SDS溶液：

将25gSDS溶解在250mlddH2O中，室温保存。

10%过硫酸铵溶液：

将0.1g过硫酸铵溶解在1mlddH2O中，使用前新鲜配置。

10%TEMED溶液：

将0.1ml的TEMED溶解在0.9mlddH2O中，-20OC保存。

电泳缓冲液：

将3gTris、14.4g甘氨酸、1gSDS溶解在1LddH2O中，调节pH至8.3左右，室温下保存。

样品缓冲液：

将0.6ml的1mol/LTris-HCL（pH6.8）、5ml50%的甘油、2ml10%的SDS溶液、0.5ml的β-巯基乙醇和1ml的1%溴酚蓝混合，加ddH2O至10ml，4OC保存。

染色液：

0.29g考马斯亮兰R-250溶于250ml脱色液中。

脱色液：

50ml乙酸和165ml甲醇，加ddH2O至1L。

3方法

3.1Ⅰ型胶原蛋白（CPⅠ）的制备

Ⅰ型胶原在皮肤中含量丰富。

本实验选择猪皮作为提取材料，分别用酸溶法、酶解法及中性盐溶液法来粗提CPⅠ。

3.1.1粗提法

3.1.1.1酸溶法

前处理：

称取新鲜猪皮100g，用氯仿/乙醇（2:

1）溶液对其进行脱脂后切除皮下脂肪，去毛并细切。

将用蒸馏水洗涤后的组织小块放入高速组织捣碎机中捣碎成糊状（12000r/min），用含4.5mol/LNaCl的0.05mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.5）充分洗涤以去除脂质及血清等成分，低温离心（8000r/min，30min，4OC）。

抽提：

将沉淀用含0.45mol/LNaCl的0.05mol/LTris-HCl缓冲液在4OC下反复抽提，以去除非胶原杂蛋白。

用蒸馏水反复洗涤。

然后在