保护性酶.docx

保护性酶.docx

《保护性酶.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《保护性酶.docx（37页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

保护性酶

保护性酶

保护酶系：

1.过氧化物酶POD

2.超氧化物歧化酶SOD

3.苯丙氨酸解氨酶PAL

4.过氧化氢酶CAT

5.多酚氧化酶PPO

6.丙二醛（MDA）含量、游离脯氨酸含量、

7.谷胱甘肽还原酶（GR

8.谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）

9.抗坏血酸（ASA）过氧化物酶（APX）Ascorbicacidperoxidase

活性氧酶促保护系统主要包括：

1超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）、

2.过氧化氢酶（Catalase,CAT）

3.抗坏血酸过氧化物酶（AscorbatePeroxidase，AP）、

4脱氢抗坏血酸还原酶DehydroascorbateReductase，DR）

5.单脱氢抗坏血酸还原酶（MonodehydroascorbateReductase，MR）

6谷胱甘肽还原酶（GlutathioneReductase，GR）

7.非特异性过氧化物酶（non—specificperoxidase，POD）等。

张家口农专学报,2002年6月,第l8卷第2期

自由基清除酶一抗坏血酸自由基还原酶

抗坏血酸过氧化物酶（APX）

亚硒酸钠对小麦幼苗中谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽转硫酶活性以及谷胱甘肽含量的影响--《植物生理学通讯》2004年02期

谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX）测试盒说明书

一、测定意义

谷胱甘肽过氧化物酶是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶。

它特异的催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。

谷胱甘肽过氧化物酶的活性中心是硒半光氨酸，硒是GSH-PX的必需部分，每克分子酶含4克原子硒。

测定GSH-PX的活力可以作为衡量机体硒水平的一项生化指标。

测定原理

谷胱甘肽过氧化物酶可以促进过氧化氢与还原型谷胱甘肽反应生成H2O及氧化型谷胱甘肽，谷胱甘肽过氧化物酶的活力可用其酶促反应的速度来表示，测定此酶促反应中还原型谷胱甘肽的消耗，则可求出酶的活力。

H2O+2GSH→2H2O+GSSG

谷胱甘肽的活力以催化GSH的反应速度来表示，由于这二个底物在没有酶的条件下，也能进行氧化还原反应（称非酶促反应）,所以最后计算此酶活力时必须扣除非酶促反应所引起的GSH减少的部分。

GSH量的测定:

GSH和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基苯甲酸阴离子呈现较稳定的黄色，在412nm处测其吸光度即可计算出GSH的量。

试剂盒有效期和保存条件

本试剂盒保存期：

6个月；储存温度:

4℃.

实验中所需的仪器和自备的试剂

1.412nm的分光光度计

2.37℃恒温水浴锅

3.台式离心机

4.可调式移液器

5.蒸馏水

二、试剂组成与配制

1.储备液（100T为1ml1瓶，50T为2ml1瓶）用时取0.1ml加蒸馏水至10ml，也就等于是100倍稀释配成应用液。

现用现配，4℃保存。

2.甲粉，乙粉，各1瓶，甲加90-100℃的热蒸馏水充分溶解（100T加170ml，50T加85ml）；乙粉加90-100℃的热蒸馏水充分溶解（100T加50ml，50T加25ml）。

将已经配好的甲乙两种溶液混合，室温静置冷却后如有结晶，取上清进行实验。

4℃或室温保存

3.粉剂，1瓶，加蒸馏水溶解（100T加200ml，50T加100ml）

4.粉剂（100T）加蒸馏水50ml溶解；液体（50T）直接加量。

避光4℃保存

5.粉剂（100T4支，50T2支）每支加蒸馏水10ml溶解，4℃保存。

6.GSH标准品粉剂3.07mg/支（100T4支，50T2支）

7.标准品溶剂储备液，1瓶（100T为10ml，50T为5ml），标准品溶剂应用液：

储备液：

蒸馏水=1：

9，现用现配，4℃保存。

GSH应用液的配制：

1mmol/LGSH溶液    GSH的分子量为307，每次测定前将1支3.07mg的GSH标准品粉剂加到GSH标准品的溶剂应用液中，定容至10ml即为1mmol/L的GSH溶液，现用现配。

、

100umol/LGSH溶液   取1mmol/LGSH溶液2ml加GSH标准品溶剂应用液18ml定容至20ml，作标准曲线用，若不做标准曲线可以不配。

（见附录）

20umol/L的GSH标准溶液   取1mmol/LGSH溶液0.2ml加GSH标准品溶剂应用液定容至10ml，即为20umol/L的GSH标准溶液。

全血中GSH-PX活力的测定

1.    样本的前处理：

溶血液的配制：

1.取肝素抗凝全血20ul，以蒸馏水稀释至1ml，配成1：

49的溶血液；鼠血10ul加蒸馏水至1ml，配成1：

99的溶血液。

2.    充分混匀，放置5分钟直至使玻璃管中的溶血液对光呈完全透明状，方可进行检测。

3.    已经配好的溶血液中GSH-PX活力只能保持45分钟-60分钟，天冷时可延迟至120分钟，如果当天来不及测定则以抗凝全血冰箱（4℃-8℃）保存，2-3天内酶活力变化不大。

注：

请在正式实验前参见附录摸索最佳取样浓度；

注：

测溶血液中GSH-PX含量要注意样品测试前红细胞一定要充分溶血。

（以对光观察透亮为标准，若不透亮可以冻溶一次，但有部分大鼠及猪的红细胞是不可放置0℃以下，否则不易溶血，例如糖尿病大鼠和部分正常大鼠的红细胞冻后很难溶血，在做正式实验时最好先取1-2只样本做预试。

）

测定操作步骤：

1.酶促反应

非酶管（对照管）

酶管（测试管）

1mmol/LGSHml

0.2

0.2

溶血液ml

0.2

37℃水浴预温5分钟

试剂一（37℃预温）ml

0.1

0.1

37℃水浴准确反应5分钟

试剂二ml

2

2

溶血液ml

0.2

2

混匀，3500-4000转/分，离心10分钟，取上清1ml作显色反应。

2.显色反应

空白管

标准管

非酶管（对照管）

酶管（测定管）

GSH标准品溶剂应用液ml

1

20umol/LGSH标准液ml

1

上清液ml

1

1

试剂三ml

1

1

1

1

试剂四ml

0.25

0.25

0.25

0.25

试剂五ml

0.05

0.05

0.05

0.05

混匀，室温静置15分钟，412nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，测各管OD值。

注意：

注：

空白管、标准管一般只需做1-2只。

注：

最佳取样量及最佳取样浓度因样品种类不同，其GSH-PX活力不一。

根据酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系，各种测定的样品取样量及取样浓度不一样，在每测定一种新的样品前最好选择一个最佳取样量及最佳取样浓度。

最佳取样浓度的摸索

测试前先预试以确定最佳取样浓度：

当您第一次使用本试剂某一种的样品时最好先做三只不同浓度的测试管，例如测全血时，则分别取用蒸馏水1：

24、1：

49、1：

99稀释的溶血液200ul进行预试，然后进行计算：

抑制率=（对照管OD-测定管OD）/对照管OD×100%，结果应该在15%-55%之间，然后取百分抑制率在45%或50%左右的一管作为最佳取样浓度，因为酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系，若百分抑制率大于60%时（曲线的平坦部分）,则需要将样品浓度稀释后再测试。

若百分抑制率小于20%时，则需要将样品浓度加大后测试。

这样做对科研结果分析及t检验有很大帮助；若百分抑制率大于60%或小于10%，各个测定组的结果在t检验中无显著性差异。

全血中GSX-PX活力的计算

公式一：

全血GSX-PX酶活力=（非酶管OD值-酶管OD值）/（标准管OD值-空白管OD值）×标准液浓度（20umol/L）×稀释倍数[5*×（1+X***）/（1+49***）]

公式二：

（标准曲线法）

全血GSH-PX酶活力=（非酶管OD值-酶管OD值）×A**×稀释倍数[5*×（1+X***）/（1+49***）]

注：

*从酶促反应表中看出反应液0.5ml加试剂二2ml，在反应液中为5倍稀释，所以乘5.

**A为标准曲线斜率的倒数，本所A值为165.16（见附录）

***X为全血稀释比例，例如1：

99稀释，X即为99.

***1+49：

溶血液为1：

49稀释时，取0.2ml检测即等于取样量为4ul的全血。

3.标准曲线的制定：

取1mmol/LGSH标准液2ml加试剂二18ml定容至20ml，配制成100umol/L的GSH标准应用液。

管号

1

2

3

4

5

6

100umol/LGSHml

0

0.4

0.8

1.2

1.6

2

试剂二ml

2

1.6

1.2

0.8

0.4

0

试剂三ml

2

2

2

2

2

2

试剂四ml

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

试剂五ml

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

混匀，室温静置15分钟，1cm光径，412nm处，蒸馏水调零，测各管吸光度。

相当于GSH标准浓度umol/L

0

20

40

60

80

100

本所参考吸光度

0.043

0.165

0.285

0.406

0.525

0.648

根据标准曲线计算A值：

A=标准管中GSH浓度值（umol/L）/标准管的GSH光密度值OD值

4.对数法计算鼠的全血中GSH-PX活力：

  注采用对数法计算鼠全血中GSH-PX活力时，实验过程中37℃水浴时间必须为3分钟

公式：

鼠全血GSH-PX活力单位数=（非酶管lg（GSH）-酶管lg（GSH））/3分钟×1/取样量（0.2ml）×样本测试前稀释倍数=（lg（非酶管OD-空白管OD）-lg（酶管OD-空白管OD））/3分钟×样本测试前稀释倍数（150）/取样量（0.2ml）

组织、线粒体和细胞膜中GSX-PX活力的测定

一、

样本的前处理：

1.10%组织匀浆的制备：

a.取组织块（0.2-1克）用冰冷的生理盐水漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入5-10ml的小烧杯内。

b.用量筒取预冷的匀浆介质（PH7.4,0.01mol/L蔗糖，0.01mo/LTris-HCI,0.000mol/LEDTA2Na溶液）或生理盐水。

匀浆介质或0.86%生理盐水的量应该是组织重量的9倍，用移液管将总量2/3的匀浆介质或生理盐水移入烧杯，用眼科小剪尽快剪碎组织块（天热时小烧杯要放入冰水中）。

c.将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩下的1/3匀浆介质或0.86%生理盐水用来冲洗残余在小烧杯中的碎组织一起倒入玻璃匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水的器皿中，右手将杆垂直插入套管中上下转动研磨数十次（6-8分钟），充分磨碎，使组织匀浆化。

或者用组织捣碎机10000-15000r/min研磨制成10%组织匀浆，也可以用内切式组织匀浆器制成10%组织匀浆（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3-4次，温度0-4℃），心肌组织等可延长匀浆时间。

注：

根据预试结果取最佳浓度进行测定。

d.将制备好的10%匀浆用普通离心机或低温离心机3000r/min左右离心10-15分钟。

将离心好的匀浆留上清弃下面沉淀。

e.根据你生物实验需要，取适量上清液进行各种测定。

2.线粒体的制备：

取10%的组织匀浆5-10ml，以1000-2000r/min离心10分钟（用普通离心机或低温离心机），取上清液以8000-10000r/min（低温高速离心机）离心15分钟，沉淀物为线粒体。

组织、线粒体和细胞膜中GSH-PX活力测定操作表

1.酶促反应:

非酶管（对照管）

酶管（测试管）

1mmom/LGSHml

0.2

0.2

样本**ml

0.2

37℃水浴预温5分钟

试剂二ml

2

2

样本ml

0.2

混匀，3500-4000转/分，离心10分钟，取上清1ml作显色反应。

显色反应：

空白管

标准管

非酶管（对照管）

酶管（测定管）

GSH标准品溶剂应用液ml

1

20umol/GSH标准液ml

1

上清液ml

1

1

试剂三ml

1

1

1

1

试剂四ml

0.25

0.25

0.25

0.25

试剂五ml

0.05

0.05

0.05

0.05

混匀，室温静置15分钟后，412nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，测各管OD值。

注意：

注：

空白管、标准管一般只需做1-2只。

注：

最佳取样量及最佳取样浓度因样品种类不同，其GSH-PX活力不一。

根据酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系，各种测定的样品取样量及取样浓度不一样，在每测定一种新的样品前最好选择一个最佳取样量及最佳取样浓度。

最佳取样浓度的摸索

测试前先预试以确定最佳取样浓度：

当您第一次使用本试剂某一种的样品时最好先做三只不同浓度的测试管，例如想测组织匀浆是时，则分别取10%、5%、1%的匀浆200ul进行预试，然后进行计算：

抑制率=（对照管OD-测定管OD）/对照管OD×100%，结果应该在15%-55%之间，然后取百分抑制率在45%或50%左右的一管作为最佳取样浓度，因为酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系，若百分抑制率大于60%时（曲线的平坦部分）,则需要将样品浓度稀释后再测试。

若百分抑制率小于20%时，则需要将样品浓度加大后测试。

这样做对科研结果分析及t检验有很大帮助；若百分抑制率大于60%或小于10%，各个测定组的结果在t检验中无显著性差异。

3.组织中GSH-PX活力的计算：

公式一：

组织GSH-PX酶活力=（非酶管OD值-酶管OD值）/（标准管OD值-空白管OD值）×标准管浓度（20umol/L）×稀释倍数（5*）÷反应时间÷（取样量×样本蛋白含量）

公式二：

组织GSH-PX酶活力=（非酶管OD值-酶管OD值）×A**稀释倍数（5*）÷反应时间÷（取样量×样本蛋白含量）

注：

从酶促反应表中看出反应液0.5ml加试剂二2ml，在反应液中为5倍稀释，所以乘5.

   公式二中A为标准斜线斜率的倒数，本所A值为165.16.（详见标准曲线测制定）

血清（浆）中GSH-PX活力的测定

1.血清（浆）GPX测定操作方法：

酶促反应：

加入物

非酶管对照管）

酶管（测试管）

1mmol/LGSHml

0.2

0.2

最佳取样浓度血清（浆）ml

0.1

37℃水浴预温5分钟

试剂一ml（37℃预温）

0.1

0.1

37℃水浴准确反应5分钟

试剂二ml

2

2

最佳取样浓度血清（浆）ml

0.1

混匀，3500-4000转/分，离心10分钟，取上清1ml做显色反应。

2.显色反应：

空白管

标准管

非酶管（对照管）

酶管（测定管）

GSH标准品溶剂应用液ml

1

20umol/GSH标准液ml

1

上清液ml

1

1

试剂三ml

1

1

1

1

试剂四ml

0.25

0.25

0.25

0.25

试剂五ml

0.05

0.05

0.05

0.05

混匀，室温静置15分钟后，412nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，测各管OD值。

注意：

注：

空白管、标准管一般只需做1-2只。

注：

最佳取样量及最佳取样浓度因样品种类不同，其GSH-PX活力不一。

根据酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系，各种测定的样品取样量及取样浓度不一样，在每测定一种新的样品前最好选择一个最佳取样量及最佳取样浓度。

最佳取样浓度的摸索

测试前先预试以确定最佳取样浓度：

当您第一次使用本试剂某一种的样品时最好先做三只不同浓度的测试管，例如想测血清时，则分别取未稀释的血清及应用生理盐水1：

1、1：

4、1：

9、1：

19稀释血清100ul进行预试，然后计算：

抑制率=（对照管OD-测定管OD）/对照管OD×100%，结果应该在15%-55%之间，然后取百分抑制率在45%或50%左右的一管作为最佳取样浓度，因为酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系，若百分抑制率大于60%时（曲线的平坦部分）,则需要将样品浓度稀释后再测试。

若百分抑制率小于20%时，则需要将样品浓度加大后测试。

这样做对科研结果分析及t检验有很大帮助；若百分抑制率大于60%或小于10%，各个测定组的结果在t检验中无显著性差异。

血清中GSH-PX酶活力的计算：

公式：

血清（浆）GSH-PX活力=（非酶管OD值-酶管OD值）/（标准管OD值-空白管OD值）×标准管浓度（20umol/L）×稀释倍数（6*）×样本测试前稀释倍数

注：

*：

从酶促反应表中看出反应液0.4ml，加试剂二2ml，在反应液中为6倍稀释。

注意点：

1.溶血液在室温下1小时内活力不变。

建议样品稀释不超过1小时为宜，测试前先将其他准备工作做好在准备溶血液

2.血样要新鲜，肝素抗凝后放冰箱4-8℃存放不要超过48小时。

3.测溶血液中GPX含量要注意样品测试前红细胞一定要充分溶血（以对光观察透亮为标准，若不透亮可以冻融一次，但有部分大鼠及猪的红细胞是不可冻融越冻越不破，最好先取1-2只样本做预试）。

4.试剂一存放瓶要彻底洗干净，应用液要现用现配。

5.1mmol/LGSH、0.1mmol/LGSH、20umol/LGSH的标准品，现用现配。

6.37℃水浴反应时间5分钟或3分钟，记录反应时间要准确。

7.测定上清液当天提取，当天测试。

8.组织蛋白质的测定法有多种，可购买本研究所蛋白定量试剂盒（考马测试盒）

GSH标准曲线的制备

标准曲线的制定：

取1mmol/LGSH标准液2ml加GSH标准品溶剂应用液18ml定容至20ml，配制成100umol/L的GSH标准应用液

管号

1

2

3

4

5

6

100umol/LGSHml

0

0.4

0.8

1.2

1.6

2

试剂二ml

2

1.6

1.2

0.8

0.4

0

试剂三ml

2

2

2

2

2

2

试剂四ml

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

试剂五ml

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

混匀，室温静置15分钟，1cm光径，412nm处，蒸馏水调零，测各管吸光度。

相当于GSH标准浓度umol/L

0

20

40

60

80

100

本所参考吸光度

0.043

0.165

0.285

0.406

0.525

0.648

以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，坐标准曲线。

根据标准曲线计算A=标准管中GSH浓度值（umol/L）/标准管的GSH光密度（OD值）

几种植物中谷胱甘肽过氧化物酶活性测定

Determinationofglutathioneperoxidaseactivityinsomeplantfamilies

<<广西农业科学>>2004年第35卷第03期

作者:

张景萍,吴珍龄,

期刊ISSN:

1002-8161（2004）03-0177-02

用直接测定法测定10种植物样品谷胱甘肽过氧化物酶活性,其中以百合科的蒜、葱,葫芦科的绞股蓝活性较高.这一结果为今后在高等植物中该酶的进一步研究奠定了实验基础,并对测定方法提出改进意见.

关键词:

高等植物,谷胱甘肽过氧化物酶,活性,测定,|全部关键词

谷胱甘肽过氧化物酶

　　谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）

　　谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。

硒是GSH-Px酶系的组成成分，它能催化GSH变为GSSG，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进H2O2的分解，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。

GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸，其活力大小可以反映机体硒水平。

GSH-Px酶系主要包括4种不同的GSH-Px，分别为胞浆GSH-Px、血浆GSH-Px、磷脂氢过氧化物GSH-Px及胃肠道专属性GSH-Px。

胞浆GSH-Px由4个相同的分子量大小为22kDa的亚基构成四聚体，每个亚基含有1个分子硒半胱氨酸，广泛存在于机体内各个组织，以肝脏红细胞为最多。

它的生理功能主要是催化GSH参与过氧化反应，清除在细胞呼吸代谢过程中产生的过氧化物和羟自由基，从而减轻细胞膜多不饱和脂肪酸的过氧化作用。

血浆GSH-Px的构成与胞浆GSH-Px相同，主要分布于血浆中，其功能目前还不是很清楚，但已经证实与清除细胞外的过氧化氢和参与GSH的运输有关。

磷脂过氧化氢GSH-Px是分子量为20kDa的单体，含有1个分子硒半胱氨酸。

最初从猪的心脏和肝脏中分离得到，主要存在于睾丸中，其它组织中也有少量分布。

其生物学功能是可抑制膜磷脂过氧化。

胃肠道专属性GSH-Px是由4个分子量为22kDa的亚基构成的四聚体，只存在于啮齿类动物的胃肠道中，其功能是保护动物免受摄入脂质过氧化物的损害。

产品简介

产品简介：

产品编号

产品名称

产品包装

产品价格

S0056

谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒

100次

319.00元

    谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒（CellularGlutathionePeroxidaseAssayKit）是一种简单易行的通过紫外比色来检测细胞、组织或其它样品中谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathioneperoxidase）活性的试剂盒。

绝大部分细胞内的谷胱甘肽过氧化物酶都是含硒的，且硒为该酶的活性中性组成部分。

细胞内也有很少量的不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶存在。

本试剂盒检测的是最常见的含硒的谷胱甘肽过氧化物酶。

    本试剂盒如果和总谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒（S0058）配合使用，可以定量检测出样品中不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶。

    谷胱甘肽过氧化物酶可以清除活细胞内过氧化物，在保护细胞免受自由基损伤过程中起着关键作用。

细胞内的脂类容易和自由基发生反应，产生脂类过氧化物。

谷胱甘肽过氧化物酶可以利用还原型谷胱甘肽（GSH）还原脂类过氧化物，从而消除自由基的毒害作用。

    谷胱甘肽过氧化物酶几乎在所有组织中都有分布。

在一些病理状况下谷胱甘肽过氧化物酶的活力会发生明显上调或下调。

    谷胱甘肽过氧化物酶可以利用还原型谷胱甘肽（GSH）催化过氧化氢以及许多有机过氧化物，产生水或有机醇。

如果以过氧化氢为底物进行检测，则同样可以分解过氧化氢的过氧化氢酶（Catalase）的酶活性会干扰谷胱甘肽过氧化物酶的测定。

本试剂盒利用了一种间接测定的方法。

谷胱甘肽过氧化物酶可以催化GSH产生GSSG，而谷胱甘肽还原酶可以利用NADPH催化GSSG产生GSH，通过检测NADPH的减少量就可以计算出谷胱甘肽过氧化物酶的活力水平。

在上述反应中，谷胱甘肽过氧化物酶是整个反应体系的限速步骤，因此NADPH的减少量和谷胱甘肽过氧化物酶的活力线性相关。

    本试剂盒利用了如下的反应原理，GPx为谷胱甘肽过氧化物酶，GR为谷胱甘肽还原酶，R-OOH为过氧化物。